Genul Staphylococcus

Etapele diagnosticului de laborator in infectia cu

Staphylococcus spp.

Stafilococi coagulazo-pozitivi: S. aureus

Stafilococi coagulazo-negativi (SCN) cu importanţă clinică: S. lugdunensis, S.

schleiferi, S. epidermidis, S.haemolyticus, S. saprophyticus. etc

Produse patologice

portaj: secreţie din cavitatea nazală anterioară, secreţie faringiană, probe de pe

tegumente (zona axilară, perianală)

plăgi, otite, infecţii tegumentare Þ puroiul (S. aureus)

infecţii urinare Þ urină (S. saprophyticus, S. aureus)

infecţii gastro-intestinale, toxiinfecţii alimentare Þ materii fecale, vomismente,

alimente.

meningite LCR

septicemie, febră puerperală, sânge pt hemocultura (S. aureus, SCN)

pneumonie, spută.

infecţii nosocomiale - S. aureus meticilino-rezistent (MRSA, SARM ),

SCN meticilino-rezistent-(MRS)

S. aureus intermediar vancomicina (VISA)

S. aureus rezistent la vancomicina ( VRSA)

1

Recoltare produs patologic

PRODUS RECOLTAREa)CANTITATE b)TRANSPORT

OBSERVATIIRESPECTA PRECAUTIUNILE

UNIVERSALE

ABCES

DESCHIS

INCHIS

Dezinfecteaza cu alcool etilic 70%, betadina. Daca este necesar iriga leziunea cu o solutie salina non-inhibitorie. Aspira cu o seringa sterila ( de preferat ) sau cu tampon steril, profund din leziune.

Aspira cu o seringa sterila. Transfera imediat aseptic tot materialul intr-un sistem anaerob.

a) > 1ml, sau 2 tampoane din acelasi loc. b) < 2 h.

a) > 1 ml b) < 2 h, sistem anaerob de transport

Se recomanda recoltarea cu seringa sterila prin aspiratie sau biopsie. Daca se recolteaza cu tamponul, este obligatorie recoltarea a doua tampoane din profunzimea leziunii ( 1 tampon pentru insamantare si 1 tampon pentru frotiul Gram ). Mediul de transport Stuart sau Amies. Evita contaminarea produsului patologic in momentul recoltarii cu bacterii ce nu sunt implicate in procesul infectios. Sistemul anaerob de transport este obligatoriu pentru a asigura supravietuirea bacteriilor anaerobe implicate in procesul infectios. Sistem anaerob : PRAS transport medium, Accu- CulShure -oxygen free-swab, containere fara oxigen pentru biopsiile de tesut.. (vezi anexa nr.3)

Aceleasi recomandari la recoltare pentru: vezicule, pustule,plaga, flictene, furuncule, arsuri, ulcer decubit, fistule, plaga muscata,etc Gangrena : se recolteaza si hemocultura in acelasi timp.

2

Examenul macroscopic: puroi cremos, filamentos, gălbui.

Examenul microscopic direct = frotiu din produsului patologic (pp)

coloraţia Gram: coci Gram pozitivi, dispuşi în grămezi asemănătoare ciorchinilor

de strugure

coci Gram pozitivi localizati intra si perileucocitar; prezenta celulelor inflamatorii

este dovada ca s-a recoltat un produs patologic real, de la nivelul procesului

infectios

Gram stain of Staphylococcus aureus in pustular exudate

3

Insamantarea pp

se insamanteaza in poligon deschis ( fara o latura) – pe medii solide, in scopul

obtinerii coloniilor microbiene izolate: geloza-sange sau Columbia –sange,

mediul Chapman

4

se insamanteaza si in mediu lichid de imbogatire – BHI

Incubare aerobă la 37°C, 18 – 24 ore.

Identificarea bacteriei:

Caractere morfotinctoriale: frotiu din cultură pură : coci Gram pozitivi, în

grămezi.

Caractere de cultură: colonii “S” pigmentate sau nepigmentate ( medii solide)

Medii lichide- tulbura uniform bulionul cu depozit moderat la fundul tubului

5

Producerea de hemolizine – pe geloză-sânge

hemoliza beta (S. aureus,) datorată hemolizinei alfa nu prezintă hemoliză (majoritatea tulpinilor SCN)

Descompunerea manitolului pe mediul Chapman (manito-pozitiv, colonii galbene, S.

aureus)

6

A) Staphylococcus aureus, (B) Staphylococcus epidermidis, and (C) Escherichia coli streaked on a mannitol salt agar plate. The mannitol fermenting colony (yellow) is S. aureus, while the mannitol nonfermenting colony (pink) is S. epidermidis.  The growth of E. coli was inhibited by the high salt concentration.

7

Caractere biochimice:

Testul catalazei

Diferentiaza coloniile de staphylococ de cele de streptococ.

Deoarece ambele bacterii cresc pe mediu cu sange se recomanda folosirea doar a

varfurilor coloniilor de stafilococ sau streptococ pentru a evita reactii fals pozitive

datorita catalazei eritrocitare(din mediu cu geloza –sange).

Pe o lama de microscop depune 1-2 picaturi de H2O2 , peste picatura de reactiv se adauga

coloniile testate.

Citire si interpretare:

Test pozitiv-aparitia bulelor de gaz pana la efervescenta

Test negativ-absenta bulelor

Identificarea Staphylococcus aureus

Se face prin testul coagulazei pe lama , stafilococul auriu fiind producător de coagulază.

Pe o lamă de microscop se pune o picătură de plasmă . În picătură se omogenizează cu

grijă o ansă din cultura pură a bacteriei de identificat. Omogenizarea se continuă

imprimând lamei mişcări de rotaţie.

Citire si interpretare

Test pozitiv-apariţia de grunji, care lasă picătura limpede înseamnă reacţie

pozitivă.

Test negativ- amestecul rămâne omogen;Orice reactie negativa se continua cu

testarea coagulazei in tub.

8

Testul coagulazei in tub -0,5 ml plasma se incubeaza cu 0.5 ml cultura de 24 ore a

tulpinii de testat in bulion glucozat,.la 37 C pentru patru ore.

Citire si interpretare

Rezultat pozitiv presupune aparitia unui coagul, se poate prelungi incubarea

probei pana la 16-18 ore, daca coagulul nu a aparut in primele patru ore, cu

verificarea periodica a probei

Rezultat negativ-lipsa coagulului

coagulaza liberă pozitiv: S. aureus;

coagulaza liberă negativ: stafilococi coagulazo-negativi (SCN)

9

Identificarea S.aureus -test rapid:

Slidex Staph Plus este un test rapid de latex aglutinare

pentru identificarea Staphylococcus aureus izolat pe mediile de cultura

rezultat negativ, absent S.aureus

1

Fermentează glucoza, manitolul, lactoza, zaharoza etc. cu producere de acid

Truse API de identificare biochimica

Tipizarea bacteriilor: pentru identificarea sursei de infecţie, compararea tulpinilor

izolate

prin lizotipie (determinarea sensibilităţii stafilococului faţă de bacteriofagi;)

prin metode de biologie moleculară

Antibiograma – testeaza sensibilitatea tulpinilor izolate

Mediul Muller Hinton, inocul 0.5 McFarland, temp 35 C, incubare 18 pana la 24 ore

Alegerea discurilor pentru testarea sensibilitatii prin metoda difuzimetrica, interpretarea

rezultatelor conform Performance standards for antimicrobial susceptibility

testing;

CLSI /2009( anterior numit NCCLS)

1

antibiograma E-TEST

pentru tulpinile cu inalta rezistenta la antibiotice

Modul de desfasurare a lucrarii practice

studentii primesc manuscrisul cu „etapele diagnosticului de laborator in

infectia cu Staphylococcus spp.

1. Lp se desfasoara interactiv- se discuta pe marginea manuscrisului primit

anterior LP-ului

2. Fiecare student efectueaza reactia catalazei

3. material demonstrativ- lucreaza doar asistentul -testul slidex Staph Plus

1

4. material demonstrativ-medii de cultura-Columbia-sange -colonii de

S. aureus, studentii recunosc coloniile de tip S, recunosc coloniile beta

hemolitice si non-hemolitice

5. material demonstrativ-trusa API pentru identificarea biochimica

6. antibiograma S.aureus, studentii masoara diametrele si noteaza in caiet,

interpretare conform CLSI/2009, Staphylococcus spp.

7. Fiecare student prinde imaginea la microscop si examineaza frotiuri :coci

Gram pozitivi in gramezi

Bibliografie

Bacteriologie Medicala, Olga Dorobat, editura UTM, 2006

Clinical Microbiology Procedures Handbook, Henry D. Isenberg, editata

American Society for Microbiology, 2004

Koneman's Color Atlas and Textbook of Diagnostic Microbiology , Washington

C Winn, Stephen D. Allen, Gail L. Woods, William M. Janda, Paul C.

Schreckenberger , editura Lippincott Williams & Wilkins, 2005

Manual of Clinical Microbiology , Patrick R. Murray , Ellen Jo Baron , Michael A. Pfaller , Fred C. Tenover , Robert H. Yolken, editura ASM, 2007Performance

Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing”.M 100, S19 CLSI /2009

1