1

UUNNII VVEERRSSII TTAATTEEAA DDEE ŞŞTTII II NNŢŢEE AAGGRRII CCOOLL EE ŞŞII MM EEDDII CCII NNǍǍ VVEETTEERRII NNAARRǍǍ

CCLL UUJJ -- NNAAPPOOCCAA

–– ŞŞCCOOAALLAA DDOOCCTTOORRAALLĂĂ ––

FFAACCUULL TTAATTEEAA DDEE MM EEDDII CCII NNǍǍ VVEETTEERRII NNAARRǍǍ

MM AARRII AANN TTAAUULL EESSCCUU

RREEZZUUMM AATTUULL TTEEZZEEII DDEE DDOOCCTTOORRAATT

PPAATTOOLL OOGGII AA GGAASSTTRRII CCĂĂ LL AA AANNII MM AALL EELL EE DDEE CCOOMM PPAANNII EE ÎÎ NN

II NNFFEECCŢŢII AA CCUU DDII FFEERRII TTEE SSPPEECCII II DDEE HHEELLII CCOOBBAACCTTEERR

CCOONNDDUUCCǍǍTTOORR ŞŞTTII II NNŢŢII FFII CC

PPRROOFF.. UUNNII VV.. DDRR.. CCOORRNNEELL CCĂĂTTOOII

CCLLUUJJ--NNAAPPOOCCAA

-- 22001111 ––

2

REZUMAT

Infecţia cu H.pylori reprezintă una dintre cele mai frecvente infecţii bacteriene la om, fiind

răspândită în întreaga lume. S-a demonstrat că infecţia gastrică cu această bacterie este asociatã

cu o serie de leziuni precum gastrita erozivã, ulcerul peptic şi gastrita cronicã activã. De

asemenea este strâns corelată cu dezvoltarea adenocarcinomului gastric şi a limfomului MALT.

Diferite specii de Helicobacter cu localizare gastrică au fost identificate frecvent la animale, mai

ales la câini şi pisici, ele fiind prezente atât la câinii asimptomatici (60-100%) cât şi la cei cu

simptome de vomã cronicã (74-90%). Speciile gastrice de Helicobacter la câini includ H. felis,

H. Bizzozeronii, H. salomonis şi H. heilmannii. Coinfecţia cu una sau mai multe specii

bacteriene, uzual H. bizzozeronii şi H. heilmannii se întâlneşte la 15-20 % dintre câini (Kenneth

şi colab., 1999). Infecţia naturală la câine cu Helicobacter pylori este controversată. Chiar dacă

majoritatea autorilor o contestă, există autori care identifică bacteria pe baza tehnicii PCR

(Buczolits şi colab., 2003; Ogawa şi colab., 2005). Infecţia gastrică cu o serie de specii de

Helicobacter este de asemenea frecventă la pisici, fiind cuprinsă între 86-100%. La pisici au fost

identificate speciile: H. felis, H. heilmannii, H. pamatensis şi H.pylori (Handt şi colab., 1994).

Prezenţa bacteriilor H. pylori, H. heilmannii şi H. felis la câine, pisică şi om conform

literaturii de specialitate motivează studiul în direcţia investigării prevalenţei şi a mecanismelor

de patogenitate ale infecţiei cu H. spp la câini şi pisici ca şi posibile surse de infecţie cu

Helicobacter la om.

Structura cercetãrilor. Teza cuprinde un numãr de 272 de pagini, şi este structuratã în

conformitate cu prevederile legale actuale; în conţinutul acesteia sunt inserate un numãr de 172

de figuri (imagini, grafice, diagrame) şi 43 de tabele. În partea I sunt prezentate cele mai

importante şi concludente date din literatura de specialitate, referitoare la aspectele

etiopatogenetice ale infecţiei gastrice helicobacteriene la om, câine şi pisicã, principalele leziuni

gastrice asociate acestei infecţii, modalitãţi de diagnostic şi aspecte privind infecţiile

experimentale cu Helicobacter spp. la diferite animale de laborator. În partea a II-a sunt

prezentate cercetãrile proprii ce au vizat patologia gastricã spontanã asociatã infecţiei

helicobacteriene la câine şi pisicã (capitolele II.2, II.3, II.4 şi II.5), patologia gastricã

helicobacterianã comparatã la om, câine şi pisicã (capitolul II.6) şi în final patologia gastricã

experimentalã cu H.pylori la cobai (capitolul II.7). Partea bibliograficã cuprinde un numãr de

227 de titluri de lucrãri ştiinţifice din literatura de specialitate autohtonã şi strãinã.

3

Scopul acestor cercetări a fost de a evalua atât infecţia gastrică spontană cu diferite specii

bacteriene aparţinând genului Helicobacter la câine şi pisică sub aspect epidemiologic şi

patogenetic, cât şi infecţia gastrică experimentală cu H.pylori la cobai sub aspectul mecanismelor

patogenetice de la nivel gastric şi a sensibilităţii bacteriene in vivo faţă de un nou protocol

terapeutic ascociat cu probiotice.

Patologia gastricã spontãnã

În capitolul II.2. intitulat ,,Particularitãţi epidemiologice şi morfologice ale

gastropatiilor spontane la câine şi pisicã” sunt descrise principalele leziuni gastrice prezente la

cadavrele de câini şi pisici necropsiate în cadrul Disciplinei de Anatomie Patologicã pe perioada

1 octombrie 2007 - 1 august 2010 şi corelaţiile dintre aceste leziuni şi infecţia helicobacterianã.

Dintr-un număr total de 643 de câini, 73 (11.35 %) au prezentat leziuni gastrice la

examenul necropsic, iar în cazul pisicilor dintr-un număr total de 133 de cadavre, 25 (18.79 %)

au prezentat leziuni gastrice la examenul necropsic.

Evaluând categoriile de vârstă la care s-au dezvoltat leziunile gastrice, s-a observat faptul

că la câine leziunile cronice inclusiv polipii gastrici au părut la adulţi şi la câinii în vârstă mai

ales între 6-10 ani, respectiv peste 11 ani. La pisici nu a existat o uniformitate a leziunilor

gastrice la anumite vârste, cele mai frecvente fiind leziunile acute întâlnite între 3 luni şi 11 ani.

La câini, s-a observat faptul cã infecţia gastrică cu H.spp creşte proporţional cu vârsta, fiind

maximă la categoria de vâstã cuprinsă între 10-15 ani (100%), aspect întâlnit de asemenea şi la

pisici.

Gastrita erozivă acută a fost identificatã atât la câini (n=8/73 cazuri; 10.95%) cât şi la

pisici (n=8/25 cazuri; 32%), aceasta fiind caracterizatã prin necroze superficiale ale mucoasei

gastrice cu infiltrat neutrofilic discret. În 3 cazuri am descris dilataţie şi torsiune gastricã, în douã

dintre ele fiind prezentã şi infarctizarea mucoasei gastrice. Gastritele hemoragice au fost

evidenţiate în 4 cazuri (la doi câini şi la două pisici); trei din acestea au fost asociate intoxicaţiei

cu anticoagulante, iar în cel de-al patrulea caz, s-a confirmat anaerobiozã (caracter necrotic).

Ulcerele gastrice au fost prezente în 8/73 cazuri (10.95%) la câini, iar la pisici în 11/25

cazuri (44%), acestea fiind caracterizate prin leziuni unice sau multiple de necroză cu

discontinuitate tisulară şi lipsa de substanţă (mucoasă gastrică şi/sau alte straturi ale peretelui

4

gastric), având o morfologie cu aspect crateriform (escavat). Ulcerele cronice s-au deosebit de

cele acute prin prezenţa unor margini indurate, albicioase, răsfrânte peste cavitate.

Gastrita cronică a fost descrisã la 37/73 de câini (50.68%) şi la 3 pisici din 25 (12%), ca o

îngroşare neuniformã a mucoasei gastrice, uneori cu aspect de circumvoluţiuni cerebrale

(hipertrofia gigantã). La câine, în urma cuantificãrii intensităţii inflamaţiei cronice s-a observat

faptul că 21/37 (56.75%) din indivizi au prezentat gastrite cronice de gradul I, 10/37 (27.02%) au

fost cu gastrite de gradul 2 şi 6/37(16.21%) cu gastrite de gradul 3. Microscopic au fost

diagnosticate urmãtoarele tipuri: gastrită cronică superficială, gastrită cronică difuză, gastritã

cronicã atroficã, gastritã cronicã hipertroficã şi gastritã cronicã limfoid folicularã. De asemenea

au fost prezente şi o serie de leziuni preneoplazice, precum metaplazia intestinalã incompletã,

atrofia glandularã şi displazia epitelialã.

La câini, contrar literaturii de specialitate, corelarea gradului de colonizare bacteriană cu

markerii histopatologici ai inflamaţiei de la nivelul antrului, a relevat o semnificaţie statisticã

între densitatea bacteriană şi leziunea acutã (p<0.01), cronicã (p<0.01) şi modificările

preneoplazice (p<0.01). La pisici, s-a observat că în regiunea pilorică a stomacului densitatea

bacteriană cu H.spp se asociază cu severitatea infiltratului inflamator acut (p<0.01). Nu există

corelaţii semnificative statistic cu gradul hiperplaziei foliculare. La nicio pisică nu s-au observat

leziuni de tip metaplazic şi/sau displazic.

Polipii gastrici au fost prezenţi doar la câini la 15/73 de cazuri, aceştia fiind descrişi într-

un capitol ulterior. Neoplasmele gastrice au fost identificate la câini în 5 din 73 de cazuri

(6.84%), iar la pisici într-un singur caz din 25 (4%). La câine, tumorile gastrice au fost clasificate

astfel: adenocarcinom in situ (n=1), adenom tubulo-papilar (n=1), leiomiom (n=3). La pisică a

fost identificată o singură formaţiune tumorală gastrică reprezentată de un limfom MALT.

Examenul microscopic a evidenţiat în structura tumorilor epiteliale şi a limfomului MALT o

infecţie helicobacterianã severã.

Clinic, leziunile gastrice au dezvoltat o serie de simptome precum dilataţia rapidă a

stomacului cu torsiune gastrică, moarte subită în cazul intoxicaţiei cu anticoagulante, vomă

cronică (8/15 cazuri), pierderea greutăţii corporale (5/15 cazuri) şi sindrom de retenţie gastrică

(2/15 cazuri) în polipoza gastrică, hematemeză, melenă şi anemie în ulcerele gastrice acute şi/sau

cronice. În cele mai multe cazuri de gastrită cronică şi eroziuni gastrice proprietarii nu au relatat

simptome de suferinţă gastrică la animale. La animalele cu adenocarcinom gastric, limfom

5

digestiv şi neoplasme mezenchimale gastrice au fost relatate simptome precum vomă cronică,

diaree, slăbire progresivă şi sindrom de retenţie gastrică.

Numărul animalelor identificate cu infecţie helicobacterianã în urma examenului

histopatologic a fost de 62/71 de câini (87.32 %) şi 23/25 (92%) de pisici, procente

asemănătoare fiind relatate şi de către unii autori, precum Weber în 1958, Henry în 1987 şi Eaton

în 1996. Helicobacterii gastrici au fost prezenţi în toate regiunile stomacului, mai frecvent în

regiunea antrului piloric la câini (58/71; 81.69%) şi în regiunea corpului gastric (23/25; 92%) la

pisici.

Studiul de faţă a scos în evidenţă rolul infecţiei cu Helicobacter spp. în dezvoltarea

leziunilor gastrice la câine şi pisică. În al doilea rând s-a observat faptul cã leziunile de gastritã

cronicã helicobacterianã sunt asociate cu o serie de modificãri preneoplazice, acestea

reprezentând zone de dezvoltare a cancerului gastric asociat infecţiei cu H.spp, mai ales la câine.

În capitolul II.3. intitulat ,,Metode de diagnostic în infecţia gastricã spontanã cu

Helicobacter spp. la câine şi pisicã” sunt prezentate datele unui studiu comparativ între diferite

metode invazive utilizate în diagnosticul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp. la câine şi pisicã.

Au fost utilizate doar metode invazive, ce au necesitat prelevarea de mucoasã gastricã, deoarece

studiul s-a realizat exclusiv pe cadavre de câini şi pisici.

Metodele utilizate în diagnosticul infecţiei cu Helicobacter se clasifică în funcţie de

indicatorul de infecţie urmărit astfel: metode directe, ce vizează identificarea bacteriei din

biopsiile de mucoasă gastrică sau din cultura de bacterii (examenul morfologic, citologic,

bacteriologic şi molecular - genetic) şi metode indirecte, care se bazează fie pe identificarea

anticorpilor induşi de prezenţa bacteriei, fie pe determinarea produşilor rezultaţi în urma

activităţii ureazei bacteriene (testul respirator, examenul serologic şi testul ureazic rapid din

biopsii gastrice). Lipsa unui consens în literatura de specialitate în ceea ce priveşte

diagnosticarea infecţiei gastrice helicobacteriene la câine si pisică, precum şi lipsa unui “protocol

de aur”, standard, similar celui de diagnostic al infecţiei cu Helicobacter pylori la om, ne-a

determinat să recurgem la aceast studiu ce are ca şi scop identificarea infecţiei gastrice cu

Helicobacter spp. la câini şi pisici prin diferite metode de diagnostic invazive.

6

Compararea metodelor de diagnostic între ele sub aspectul sensibilităţii şi specificităţii,

respectiv identificarea infecţiei gastrice cu Helicobacter pylori prin tehnica imunohistochimică

reprezintă principalele obiective ale studiului de faţă.

Pentru examenul citopatologic, testul ureazei şi examenul histopatologic au fost utilizate

fragmente de mucoasă gastrică (probe) recoltate din cele trei regiuni ale stomacului (cardia, corp

şi antru) provenite de la 71 de cadavre de câini şi 25 de pisici. Pentru examenul microbiologic

cultural au fost recoltate probe de la 20 cadavre de câini şi 10 cadavre de pisici. Pentru metoda

Giemsa s-au folosit 20 de probe de la câini şi 10 de la pisici, iar pentru tehnica

imunohistochimică cu Ac anti-Hpylori au fost utilizate 30 de probe de la câini şi 10 de la pisici.

Pentru analizarea eficienţei diferitelor metode de diagnostic s-au luat în considerare

următoarele aspecte: Sn (%) , Sp (%), VPP (%) şi VPN (%).

Infecţia helicobacteriană a fost identificată în fragmentele de mucoasã gastricã prelevate

de la cadavrele de câini şi pisici prin toate metodele de diagnostic utilizate în acest studiu, dar în

procentaje diferite.

În cazul utilizării testului ureazei, interpretarea pozitivităţii infecţiei cu Helicobacter spp.

urează pozitive s-a realizat la diferite intervale de timp, acestea fiind asociate diferitelor grade de

infecţie de la 1 la 4 astfel: gradul 0 (negativ la 48 de ore), gradul 1 (pozitiv la 48 de ore), gradul 2

(pozitiv la 24 de ore), gradul 3 (pozitiv la 4 ore), gradul 4 (pozitiv la 1 oră). Prin această metodă,

infecţia helicobacteriană a fost evidenţiată la 66/71 de câini (92.95%) şi la 100% din pisici.

Identificarea infecţiei şi aprecierea rapidă a numărului de organisme bacteriene spiralate

aparţinând genului Helicobacter de la nivel gastric s-au realizat în urma examinării lamelor cu

amprente de pe suprafaţa mucoasei gastrice din diferite regiuni. Bacteriile ce aparţin genului

Helicobacter s-au colorat în albastru intens în cazul coloraţiei Diff Quick-Panoptic, fundalul

fiind deschis la culoare. În cazul coloraţiei Gram, bacteriile fiind negative s-au colorat în nuanţe

de roşu (acidofile). Prin aceastã metodã infecţia helicobacterianã a fost identificatã la un numãr

de 66/71 de câini (92.95%) şi 21/25 de pisici (84%), obţinându-se rezultate asemãnãtoare testului

ureazei. Helicobacterii gastrici au fost evidenţiaţi la câini într-un procent de 7.5% în regiunea

cardiei, la 57.74% în regiunea corpului gastric şi la 87.32% în regiunea antrului piloric. La pisici

prin intermediul examenului citopatologic, helicobacterii gastrici au fost evidenţiaţi în regiunea

cardiei la 20% din indivizi, în corpul gastric la 84% şi în regiunea pilorică la 76% din cazuri.

7

La câini, raportându-ne la examenul citopatologic, am observat că testul ureazei are o

sensibilitate excelentă (100%), dar specificitatea acestuia variază de la 55.55% la nivelul antrului

până la 96.96% la nivelul cardiei. Acest lucru se poate datora prezenţei la nivelul celor două

regiuni gastrice şi a altor microorganisme producătoare de urează, precum Proteus, Citrobacter,

Enterobacter şi Staphylococcus, determinând rezultate fals pozitive. Valoarea predictivă (-) a TU

este de 100%, ceea ce face ca acesta să fie recomandat de primă intenţie ca mijloc de diagnostic,

o valoare negativă excluzând infecţia, iar o valoare pozitivă necesitând confirmare prin testul

citologic. La pisici sensibilitatea TU este crescută, dar specificitatea variază între 50 şi 100 %,

cu valori mici în antru, unde pot fi întâlnite şi alte microorganisme producătoare de urează, ceea

ce face să crească numărul testelor fals pozitive. Valoarea TU constă în VPP de 100% putând fi

folosit ca şi prim test screening, o valoare negativă determinând excluderea infecţiei, iar o

valoare pozitivă presupune continuarea demersului diagnostic pentru investigarea infecţiei cu

H.spp

Examenul histopatologic ca şi metodă de diagnostic a infecţiei cu Helicobacter spp. a

utilizat fragmente de mucoasă gastrică fixate în formol 10% la pH neutru, apoi incluse în

parafină şi colorate ulterior cu HE şi TM. Bacteriile ce aparţin genului Helicobacter s-au colorat

în nuanţe de roşu şi/ sau albastru intens pe suprafaţa epiteliului foveolar sau în lumenul glandelor

gastrice, la polul apical al celulelor, sub stratul de mucus. Morfologia polimorfă a bacteriilor a

determinat în acest caz limitarea la un diagnostic de gen bacterian, respectiv Helicobacter spp.,

diferenţierea speciilor între ele urmând a se realiza prin metode specifice. Prin aceastã metodã,

infecţia helicobacterianã a fost identificatã într-o proporţie de 87.32% (62/71) la câini şi 92% la

pisici (23/25). La câine, specificitatea examenului histopatologic utilizat în scopul identificării

infecţiei gastrice helicobacteriene a avut valori cuprinse între 80 şi 100% în funcţie de regiunea

gastrică. La pisică sensibilitatea examenul histopatologic este crescută, iar specificitatea este

moderată între 50 şi 100%, explicată prin distribuţia parcelară a infecţiei cu H.spp. şi lotul

constituit dintr-un număr mic de animale. Identificarea infecţiei gastrice cu H.spp pe secţiuni

histologice are o valoare predictivă pozitivă crescută, dar un test negativ nu exclude infecţia cu

H.spp, deoarece distribuţie este parcelară.

Microbiologic, s-au izolat şi identificat bacterii spiralate aparţinând genului Helicobacter

de la 6/20 dintre câini, doar din regiunea pilorică. Nu s-a putut realiza izolarea bacteriilor

gastrice de la pisici pe medii de cultură. Pe mediul cu agar selectiv s-au izolat bacterii de la 6

8

cazuri, pe mediul Agar Mueller-Hinton cu supliment selectiv de la 2 cazuri, iar pe mediul Agar

Columbia cu sânge de cal lacat şi supliment selectiv, de asemenea de la 2 cazuri.

Tehnica Giemsa a confirmat infecţia cu Helicobacter spp. în toate cazurile unde a fost

identificată şi prin coloraţii uzuale, marcând astfel organismele spiralate în albastru închis.

Probele negative la coloraţiile uzuale au fost negative şi prin această metodă. Bacteriile marcate

cu Giemsa sunt polimorfe din punct de vedere al mărimii şi al numărului de spire, fapt ce infirmă

utilizarea strictă a acestei metode în scopul identificării bacteriei H.pylori.

Pentru tehnica imunohistochimică s-au utilizat anticorpi primari policlonali anti-

Helicobacter pylori. Probele utilizate pentru acestă metodă au fost pozitive la examenul

histopatologic. Bacteria, H. pylori a fost identificată ca un organism spiralat, marcat brun, cu

dimensiuni de aproximativ 3-5/0,5 µm pe suprafaţa epiteliului şi în lumenul glandelor la 6 câini

(20%) şi 4 pisici (40%) din cazurile luate în studiu, acestea fiind confirmate ulterior prin tehnica

PCR. Bacteriile de dimensiuni mari şi cu spire multiple nu au fost marcate prin această metodă.

Certitudinea existenţei acestei bacterii, Helicobacter pylori, la câine şi pisică, dată de

pozitivitatea unor teste superioare de diagnostic, concluzioneazã faptul cã aceste animale pot

reprezenta o sursă de infecţie helicobacteriană pentru om.

În capitolul II.4. intitulat ,,Identificarea diferitelor specii de Helicobacter din biopsiile

gastrice provenite de la câini şi pisici prin intermediul tehnicii moleculare PCR” ne-am propus

să identificăm trei dintre principalele specii de Helicobacter prezente la câini şi pisici, dintr-o

serie de fragmente de mucoasã gastricã cu leziuni la acest nivel, prin intermediul tehnicii PCR

utilizând primeri specifici pentru H. pylori, H. felis şi H. heilmannii.

Identificarea infecţiei cu H.pylori şi corelarea acesteia cu leziunile gastrice dezvoltate sunt

obiectivele principale ale acestui studiu, mai ales în contextul în care infecţia cu această bacterie

la câine este contestată de literatura de specialitate. Prezenţa acestei bacterii la câine şi pisică

poate explica una din sursele de infecţie cu Helicobacter pylori la om, concluzionând faptul că

această bacterie are potenţial zoonotic.

Pentru acest studiu au fost utilizate fragmente de mucoasã gastrică provenite de la 15

cadavre de câini şi 15 cadavre de pisici cu leziuni gastrice. Probele au fost recoltate separat din

cele trei regiuni ale stomacului (cardia, corp gastric şi antrum) în tuburi Eppendorf şi apoi

introduse la congelator la -70 ºC. Pentru acest studiu au fost prelevate probe gastrice numai de la

9

animalele ce au fost pozitive la testul rapid al urezei, astfel încât un alt obiectiv urmãrit în acest

studiu este reprezentat de corelarea pozitivitãţii testului ureazei cu rezultatele PCR. Extracţia şi

purificarea ADN-ului s-a realizat în cadrul disciplinei de Anatomie Patologicã, iar amplificarea

şi interpretarea datelor s-au realizat la disciplina de Genetică, din cadrul Facultăţii de

Horticultură, USAMV Cluj-Napoca.

Din cele 15 probe provenite de la câini, s-au identificat 4 cazuri pozitive cu H. pylori şi 8

cazuri pozitive cu H.heilmannii, în timp ce bacteria H. felis nu a fost identificată în aceste probe.

Cu toate că în urma examenului histopatologic am evidenţiat prezenţa bacteriilor

Helicobacter felis-like, tehnica PCR nu a confirmat această bacterie. Acest lucru se explică prin

faptul că bacteriile evidenţiate aparţin altor specii helicobacteriene. În cazul biopsiilor gastrice

provenite de la pisici, din cele 15 probe utilizate s-au identificat 5 cazuri pozitive cu H. pylori, 7

cu H. heilmannii şi 9 cu H. felis.

La pisici, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată în 6

cazuri, astfel o dublă infecţie între H. felis şi H. pylori s-a observat în 2 din 15 cazuri, coinfecţia

bacteriană între H. pylori şi H. heilmannii a fost identificată în alte 2 din 15 cazuri, iar coinfecţia

între H. felis şi H. heilmannii a fost prezentă într-un singur caz din 15. Tripla infecţie bacteriană

cu H. felis, H. heilmannii şi H. pylori a fost identificată de asemenea într-un singur caz din 15.

La câini, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată într-un

singur caz între H. pylori şi H. heilmannii. Helicobacterii au fost identificaţi în doar două din

cele trei regiuni ale stomacului de unde au fost recoltate probele.

În medicina veterinară, termenul care se foloseşte frecvent pentru a denumi bacteriile

spiralate de la nivelul stomacului de la animale, mai ales de la carnivore este de GHLO (Gastric

Helicobacter - Like Organism). Pentru acest lucru mulţi dintre autori asociază leziunile gastrice

întâlnite la carnivore cu GHLO şi nu cu diferite specii de Helicobacter chiar dacă au fost

identificate prin tehnici superioare precum IHC sau/şi PCR. Contrar acestui lucru, noi credem că

este inoportun să folosim termenul de GHLO pentru helicobacterii gastrici atâta timp cât am

utilizat o tehnică superioară de diferenţiere a acestor bacterii. Asocierea leziunilor gastrice cu o

specie bacteriană şi nu cu genul bacterian nu face altceva decât să confirme faptul că numai

anumite specii de Helicobacter au importanţă patogenetică asupra mucoasei gastrice. Mai mult

decât atât se pot relata date importante despre tipul de leziune gastrică indusă de către o anumită

10

specie de Helicobacter, plecând de la premiza că există diferenţe între speciile de Helicobacter

în ceea ce priveşte patogenitatea.

Leziunile gastrice au fost prezente atât în regiunea pilorică cât şi în zona corpului gastric.

Gastritele acute, gastritele cronice active şi inactive, ulcerul gastric şi limfomul MALT sunt

leziunile histopatologice întâlnite la nivel gastric la pisicile şi câinii din acest studiu. La câine

infecţiile gastrice cu Helicobacter pylori şi Helicobacter heilmannii au fost asociate cu gastrite

acute şi cronice întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în regiunea fundică. La pisică infecţiile

gastrice cu H. felis, Helicobacter pylori şi Helicobacter heilmannii au fost asociate cu gastrite

acute şi cronice, ulcere gastrice şi limfom MALT, întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în

regiunea fundică. Helicobacter felis nu a fost asociat cu leziuni acute la nivel gastric la pisici,

această infecţie fiind asociată cu gastrite cronice, ulcer gastric cronic şi limfom MALT atât în

regiunea fundică cât şi în cea pilorică. Din acest punct de vedere datele obţinute corespund cu

cele din literatura de specialitate.

Cu toate că au fost prezente atât la câine cât şi la pisică o serie de leziuni gastrice în care nu

am identificat helicobacteri gastrici (H. felis, H.pylori, H. heilmannii) prin tehnica PCR, nu se

poate afirma faptul că aceste leziuni nu au fost induse de Helicobacter spp., deoarece s-au folosit

primeri doar pentru 3 specii bacteriene. Cunoscând faptul că mucoasa gastrică la câine şi pisică

este colonizată şi de alte specii bacteriene aparţinând genului Helicobacter, cum ar fi H.

bizzozeroni, H. canis, H. rappini, H. billis, apariţia leziunilor gastrice s-ar putea pune şi pe

seama acestora. Mai mult decât atât, nu se poate exclude implicarea unor factori precum

hiperaciditatea, alimentaţia, substanţele medicamentoase, agenţii biotici nonbacterieni şi

dismetaboliile în dezvoltarea acestor leziuni gastrice.

În urma acestui studiu am pus în evidenţă prezenţa bacteriei Helicobacter pylori la câini,

bacterie contestată ca fiind prezentă în stomacul acestora. Prezenţa acesteia la câine poate explica

una dintre sursele de infecţie cu Helicobacter pylori la oameni, proprietari de câini şi nu numai.

Prezenţa infecţiei cu H. pylori la pisică corespunde datelor din literatura de specialitate.

În capitolul II.5. intitulat ,,Polipii gastrici şi infecţia helicobacterianã la câine” ne-am

propus în primul rând să evaluãm aspectele epidemiologice, morfologice macroscopice şi

histologice ale formaţiunilor polipoase gastrice întâlnite la câini, precum şi realizarea unei

corelaţii între aceştia şi infecţia helicobacterianã, aspect neîntâlnit în literatura de specialitate.

11

La oameni, polipii gastrici, mai ales cei de naturã hiperplazicã sau regenerativã sunt

frecvent întâlniţi, în schimb la câine aceştia se întâlnesc sporadic. Dacã la oameni, gastrita

cronicã helicobacterianã reprezintã locul de dezvoltare al polipilor gastrici, la câine nu este

relatatã o astfel de corelaţie, lucru care ne-a determinat sa extindem aria de cercetare şi în aceastã

direcţie.

Studiul s-a realizat pe un număr de 15 cadavre de câini (8 masculi şi 7 femele), ce au

prezentat la examenul necropsic formaţiuni polipoase la nivelul stomacului. Dintre aceştia, 6 au

fost eutanasiaţi la cererea proprietarilor, iar ceilalţi 9 câini au murit din diverse cause.

Clinic, conform anamnezei relatate de cãtre proprietari, aceştia au prezentat vomă cronică

(8/15 cazuri), pierderea greutăţii corporale (5/15 cazuri) şi sindrom de retenţie gastrică (2/15

cazuri), simptome ce au indicat o leziune cronică la nivelul stomacului. La 14 câini, formaţiunile polipoase au fost întâlnite în regiunea pilorică a stomacului, iar

la un câine la nivelul joncţiunii dintre corpul gastric şi regiunea pilorică a fost identificat un polip

solitar. Polipii gastrici au fost identificaţi ca şi formaţiuni solitare (8 cazuri) sau multiple (7

cazuri). Dimensiunea polipilor a fost cuprinsă între 0.5 şi 3 centimetri, cu o medie de 1.2 cm.

Examenul histopatologic a diagnosticat 11 formaţiuni polipoase hiperplazice, 2 polipi

inflamatori, 1 polip adenomatos şi o formaţiune polipoasă având ca şi structură o hiperplazie

fibro-musculară în jurul unei zone limitate de mineralizare distrofică, trădând în acest sens

leziunea de polip propriu-zis.

În structura polipilor gastrici au fost observate o serie de leziuni preneoplazice, precum

metaplazia intestinală şi displazia epitelială a mucoasei gastrice. Într-un singur caz s-a identificat

neoplazie gastrică, încadrată ca şi adenom tubulovilos.

La 10 din 15 cazuri au fost observate leziuni de gastritã cronicã hipertroficã, iar în alte

douã cazuri deformarea peretelui gastric s-a datorat tumorilor de naturã mezenchimalã.

Identificarea infecţiei helicobacteriene s-a realizat în 14 cazuri prin intermediul testului

ureazei, citologiei, histologiei cu coloraţii uzuale şi metodei Giemsa. În urma examenului

imunohistochimic pentru investigarea infecţiei cu H. pylori utilizând Ac policlonali anti-H.

pylori, s-a demonstrat prezenţa acestor bacterii la 3 din 15 cazuri.

Infiltratul inflamator cu mononucleare si rare neutrofile, atrofia glandulară, proliferarea

ţesutului conjunctiv fibros în corionul mucoasei, hipertrofia foliculilor limfoizi, prezenţa

celulelor Goblet în epiteliul foveolar şi displazia joasă epitelială reprezintă principalele

12

modificări histologice evidenţiate în fragmentele de mucoasă prelevate din apropierea

formaţiunilor polipoase gastrice de la câini. La nivelul fragmentelor de mucoasă gastrică din

jurul polipilor hiperplazici şi inflamatori, testul corelativ Kendall, a scos în evidenţă o

semnificaţie statistică între gradul de colonizare cu GHLO şi infiltratul cu celule mononucleare,

atrofia glandulară, metaplazia intestinală şi hiperplazia/hipertrofia foliculilor limfoizi (p<0.01);

pe de altă parte testul Kendall a evidenţiat lipsa unei semnificaţii statistice (p>0.05) între gradul

de colonizare cu GHLO şi infiltratul inflamator cu neutrofile, necroza tisulară şi displazia

epitelială.

În fragmentele de mucoasă gastrică din jurul polipului adenomatos, testul Kendall a

evidenţiat o corelaţie semnificativă statistic între gradul de colonizare cu GHLO şi infiltratul cu

celule mononucleare, hiperplazia foliculilor limfoizi şi displazia epitelială (p<0.01).

Studiu actual scoate în evidenţã faptul cã polipii gastrici s-au dezvoltat pe fondul unor

gastrite cronice de naturã helicobacterianã.

Capitolul II.6. intitulat ,,Aspecte comparative ale infecţiei gastrice spontane cu

Helicobacter spp. la om, câine şi pisică” a urmãrit investigarea infecţiei cu Helicobacter pylori

la o serie de pacienţi umani ce s-au prezentat la Clinica Medicală III Cluj-Napoca cu suferinţe la

nivel gastroduodenal. Rezultatele obţinute în urma acestui studiu au fost comparate cu cele de la

câine şi pisică relatate în capitolele anterioare.

Obiectivele studiului sunt reprezentate de evaluarea leziunilor gastrice la pacienţii umani

induse de infecţia cu Hp, compararea diferitelor metode de diagnostic în cazul infecţiei cu Hp,

corelarea gradului de infecţie bacteriană cu intensitatea lezională gastrică şi în final realizarea

unui studiu comparativ al infecţiei gastrice cu Hp la om, câine şi pisică sub aspectul etiologiei,

patogenezei şi a metodelor de diagnostic. Prin aceste date comparative între patologia gastrică

asociată infecţiei cu Hp la om şi animale, dorim să scoatem în evidenţă modele patogenetice

asemănătoare, utile pe viitor în studiul carcinogenezei.

Studiul s-a realizat pe un număr de 32 de pacienţi, 15 B şi 17 F cu vârste cuprinse între 21

şi 69 de ani cărora li s-a identificat H.pylori prin testul respirator cu uree marcată C14. Toţi

pacienţii au fost pozitivi la testul respirator. Aceştia, ulterior au fost examinaţi prin EDS. Prin

această metodă s-a examinat mucoasa esofagiană, gastrică şi duodenală în scopul identificării

diferitelor leziuni inflamatorii sau neoplazice de la acest nivel şi efectuarea de biopsii de

13

mucoasă gastrică (regiunile fundică şi pilorică) pentru testul ureazei, microbiologie,

histopatologie, imunohistochimie (Ac policlonali anti-H.pylori) şi PCR (primeri specifici pentru

H.pylori, genele VacA şi CagA).

În cazul EDS, din cei 32 de pacienţi, 4 au fost identificaţi cu leziuni cronice şi 5 cu

leziuni acute, 23 de pacienţi neprezentând leziuni la nivel gastric. La testul ureazei din 32 de

pacienţi, 29 dintre aceştia au fost pozitivi şi 3 negativi.

În urma examenului histopatologic realizat pe cele 19 biopsii gastrice s-au evidenţiat o

serie de leziuni la acest nivel, 16 dintre ele pledând pentru gastrită cronică activă de diferite

grade. În alte două biopsii s-a evidenţiat metaplazie intestinală incompletă, iar într-o singură

biopsie s-a constatat displazie epitelială joasă. Evaluând atât intensitatea lezionalã de la nivel

gastric cât şi gradul de colonizare bacterianã, am observat cã nu a existat o corelaţie

ssemnificativã statistic între aceste douã caracteristici.

În urma IHC, utilizatã pentru investigarea infecţiei cu H.pylori, s-a demonstrat prezenţa

acestor bacterii marcate cromogen la toate cele 19 cazuri, având o intensitate variată de

colonizare a mucoasei gastrice.

Amplificarea PCR pentru H.pylori, cu aceleaşi secvenţe de nucleotide utilizate pentru

câine şi pisicã, s-a realizat la toate cele 4 culturi bacteriene luate în studiu. Amplificarea PCR

pentru gena cagA (297bp) s-a realizat la toate cele patru probe iniţiale, în timp ce pentru gena

vacA (259 bp) amplificarea s-a realizat la 3/4 pacienti.

În comparaţie cu omul, la care cele mai multe studii epidemiologice se fac în direcţia

bacteriei H. pylori, la animale majoritatea studiilor epidemiologice includ identificarea de

Helicobacter spp. Chiar dacă este un studiu comparativ, este normal să găsim o incidenţă mai

mare a infecţiei helicobacteriene la câini şi pisici decât la om, tocmai din această perspectivă.

Dacă la om am evidenţiat H. pylori în toate cele 32 de biopsii gastrice, la animale am

identificat această bacterie la un număr mic de animale (la câine 4 cazuri pozitive cu H. pylori/15

biopsii gastrice, iar la pisică 5 cazuri pozitive cu H. pylori/ 15 biopsii), în contradicţie cu

literatura de specialitate care infirmă prezenţa acestei bacterii mai ales la câine.

Din biopsiile gastrice provenite de la pacienţii umani nu s-au identificat şi alte bacterii

spiralate din genul Helicobacter, precum H. felis şi H.heilmannii, bacterii de asemenea cu

potenţial patogen pentru om. În schimb, la câini şi pisici am identificat aceste două bacterii prin

intermediul tehnicii PCR. La câini, coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a

14

fost identificată în 6 cazuri, astfel o dublă infecţie între H. felis şi H. pylori s-a observat în 2 din

15 cazuri, coinfecţia bacteriană între H. pylori şi H. heilmannii în alte 2 din 15 cazuri, iar

coinfecţia între H. felis şi H. heilmannii a fost prezentă într-un singur caz din 15. La pisici,

coinfecţia bacteriană cu mai multe specii de Helicobacter a fost identificată într-un singur caz,

între H. pylori şi H. heilmannii.

În cazul infecţiei gastrice cu H. pylori la om, majoritatea leziunilor au fost de ordin

cronic, în schimb la câine şi pisică leziunile inflamatorii asociate infecţiei gastrice cu

Helicobacter spp. au fost variate, dar asemănător pacienţilor umani, au predominat leziunile

cronice. Gastritele erozive, ulcerele gastrice, gastritele cronice şi neoplasmele gastrice au fost

identificate la câinii şi pisicile luate în studiu. Gastritele cronice, din punct de vedere

histopatologic au coincis cu cele descrise de literatura de specialitate la om şi animale.

Leziunile gastrice induse de H.pylori au fost prezente atât în regiunea pilorică cât şi în

corpul gastric. La câine, infecţiile gastrice cu H. pylori şi H. heilmannii au fost asociate cu

gastritele acute şi cronice, întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi în regiunea fundică. La pisică,

infecţiile gastrice cu H. felis, H. pylori şi H. heilmannii au fost asociate cu gastritele acute şi

cronice, ulcerul gastric şi limfomul MALT, acestea fiind întâlnite atât în regiunea pilorică cât şi

în cea fundică.

Atât la animale cât şi la om se pot utiliza o serie de metode de diagnostic în infecţia

gastricã cu Helicobacter spp. Dacă testul respirator se realizează cu dificultate la animale, la om

sensibilitatea testului variază între 90-98 %, iar specificitatea atinge 99-100%. Utilizat la

pacienţii umani de la care au fost recoltate biopsiile gastrice pentru acest studiu, testul respirator

a fost pozitiv la toate cele 32 de cazuri. Nu am putut utiliza metode non-invazive ca şi tehnici de

diagnostic, deoarece studiul s-a realizat doar pe cadavre de câini şi pisici.

Examenul citopatologic nu a fost utilizat la pacienţii umani luaţi în studiu; în practica

medicală, mai ales în clinici nu se utilizează acest test rapid, în schimb se preferă testul ureazei.

Contrar acestui lucru la câine şi pisică diagnosticul citopatologic poate fi considerat metoda

,,gold standard” de identificare a infecţiei gastrice helicobacteriene. Prin acest test am evidenţiat

helicobacterii gastrici la câini într-o proporţie de 92.95% şi de 84% la pisici.

Sensibilitatea testului ureazei raportată la examenul cultural a fost de 90%. Specificitatea

testului este de 100% numai când virarea culorii mediului este urmărită până la 4 ore. La om

utilizarea acestui test pe cele 32 de biopsii gastrice a avut o specificitate de 100% şi o

15

sensibilitate de 97%. Specificitatea crescută a testului rapid al ureazei la oameni se explică prin

faptul că mucoasa gastrică este colonizată în cele mai multe cazuri doar de Helicobacter pylori.

La câini şi pisici, raportându-ne la examenul citopatologic, la testul ureazei am observat o

sensibilitate excelentă, dar specificitatea a variat de la 55.55% la nivelul antrului până la 96.96%

la nivelul cardiei. Acest lucru poate fi explicat prin prezenţa la nivelul corpului şi a antrului a

altor microorganisme producătoare de urează.

H. pylori este foarte dificil de identificat din biopsiile gastrice prin examenul

histopatologic, deoarece are dimensiuni foarte reduse (2-4/0.5um). Din acest motiv necesită

coloraţii speciale precum coloraţia Giemsa şi/sau imunohistochimia cu anticorpi anti - H. pylori.

La câine şi pisică histopatologia cu coloraţii uzuale, inclusiv tehnica Giemsa a identificat o serie

de bacterii polimorfe din punct de vedere al dimensiunii şi al numărului de spire, ceea ce ne

obligă să spunem că diagnosticul este de H. spp şi nu de infecţie cu H. pylori.

Imunohistochimia a scos în evidenţã în toate cele 19 biopsii gastrice luate în studiu de la

pacienţii umani prezenţa bacterie H.pylori pe suprafaţa epiteliului foveolar şi în glandele

gastrice. Sensibilitatea IHC raportată la testul respirator şi la testul ureazei s-a dovedit în acest

caz de 100%. La câine, IHC a identificat prezenţa bacteriei H.pylori la 6/30 (20%), iar la pisicã

la 4/10 indivizi (40%), toate aceste cazuri fiind confirmate prin tehnica PCR.

La om, dorită faptului că mucoasa gastrică este colonizată în aproape toate cazurile numai

de H. pylori, se poate utiliza cu succes un anticorp primar policlonal anti H.pylori. La animale,

îndeosebi la câini şi pisici datorită prezenţei unui număr crescut de specii de Helicobacter la

nivel gastric, pentru tehnica imunohistochimică se indică utilizarea de anticorpi primari

monoclonali pentru Helicobacter pylori. Aceşti anticorpi au ca şi scop evitarea reacţiilor

nespecifice date de alte specii de Helicobacter, precum H. felis, H. heilmannii, H. canis şi H.

bizozzeronii.

Astfel, pentru diagnosticul de certitudine al infecţiei cu Helicobacter pylori ne-am propus

să utilizăm o tehnică mult mai superioară, precum tehnica PCR. Din cele 4 culturi bacteriene

izolate de la pacienţii umani, am obţinut rezultate pozitive pentru H. pylori în toate cazurile.

Aceleaşi culturi, au fost negative pentru H. felis şi H.heilmannii.

Prin intermediul aceloraşi primeri utilizaţi la om am identificat infecţii helicobacteriene

gastrice cu H.pylori, H.felis şi H.heilmannii la câini şi la pisici.

16

Un factor important de virulenţă este considerat produsul genei vacA, respectiv citotoxina

vacuolizantă, care determină vacuolizarea citoplasmatică a celulelor ţintă atât în vivo, cât şi în

vitro. Deşi toate tulpinile au această genă, doar 50-60% sunt capabile să determine vacuolizarea

citoplasmatică a celulelor epiteliale. Un alt factor de virulenţă este proteina CagA (proteină

asociată citotoxicităţii), care este codificată de către gena cagA, prezentă la 60-70% din tulpinile

de H. pylori. Probele din culturi bacteriene la care s-a amplificat gena cagA alela s2 au fost

pozitive la trei din patru pacienţi. De asemenea am obţinut o bandă de amplificare la 300 bp la o

probă la care am folosit primer-ul vacA de 259 pb (posibil produs nespecific). Spre deosebire de

om, la câini şi pisici cele 2 gene vac A şi cagA nu s-au putut identifica din biopsiile gastrice.

Pe lângă particulariţăţile specifice întâlnite în cazul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp.

la om, câine şi pisică, în acest studiu am evidenţiat o serie de similitudini privind etiologia,

patogeneza, gastropatiile comune asociate infecţiei şi metodele de diagnostic utilizate în scopul

detectării acestor bacterii de la nivelul stomacului.

Pe baza aspectelor evidenţiate în acest studiu referitoare la infecţia comună cu H. pylori la

om, câine şi pisică putem afirma faptul că aceste animale de companie pot reprezenta potenţiale

surse de infecţie helicobacteriană pentru om şi viceversa.

Capitolul II.7. intitulat „ Infecţia gastrică experimentală cu Helicobacter pylori la

cobai - aspecte patogenetice şi tratament” reprezintã ultima parte de cercetãri proprii din cadrul

tezei de doctorat.

Scopul studiul de faţă a constat în inducerea infecţiei gastrice cu Helicobacter pylori

cagA şi vacA pozitive la cobai şi evidenţierea modificărilor histologice, hematologice şi

biochimice ce apar în cursul terapiei de eradicarea a acestei infecţii prin administrarea unei triple

medicaţii (Omeprazol, Rifaximină, Amoxicilină) şi probiotice (Enterolactis).

Pentru acest studiu s-a folosit un număr de 20 cobai (Cavia porcellus) dintre care 10

masculi şi 10 femele, cu o vârsta la începutul experimentului de aproximativ 3 luni.

Tulpinile de H.pylori au fost izolate din 4 culturi bacteriene obţinute din biopsii gastrice

umane, provenite de la patru pacienţi infectaţi. După obţinerea culturilor, acestea au fost tipizate

prin tehnica PCR, toate patru fiind cagA/vacA+. Pentru infecţie s-au utilizat suspensii cu o

densitate de 108 UFC/ml (1 MF).

17

Infectarea s-a realizat cu H. pylori cagA/vacA+ la 15 dintre cobai, pe cale orală cu sonda

esofago-gastrică. S-a adminstrat câte 1 ml din suspensia bacteriană, trei zile consecutiv. Anterior

infecţiei, pe perioada celor trei zile de administrare a bacteriilor cât şi o zi după infecţie s-a

administrat Omeprazol (1 mg/kg m.c). După 14 săptămâni s-au recoltat fecale, individual de la

fiecare cobai infectat, pentru confirmarea infecţiei prin metoda PCR utilizând primeri specifici

pentru Helicobacter pylori.

În urma confirmării infecţiei helicobacteriene am recurs la realizarea unui protocol de

eradicare a acesteia, utilizând o serie de substanţe medicamentoase (Amoxicilina, Rifaximina,

Omeprazolul) şi probiotice, sub diferite scheme terapeutice, astfel: la un lot infectat cu Hp s-a

administrat probiotice înainte cu 5 zile şi în timpul tratamentului cu antibiotice, iar la celãlalt lot

infectat cu Hp s-a administrat probiotice doar în timpul terapiei cu antibiotice. Dupã tratament,

cobailor li s-au prelevat sânge pentru determinãri biochimice şi hematologice şi apoi au fost

sacrificaţi pentru prelevare de porţiuni de mucoasã gastricã, acestea urmând a fi investigate

histopatologic, citopatologic, microbiologic, imunohistochimic şi prin PCR cu scopul evaluãrii

leziunilor gastrice şi confirmãrii eradicarii infecţiei helicobacteriene.

Datele obţinute au fost prelucrate statistic cu ajutorul testului IST (Independent sample

test) pentru eşantioane independente, considerându-se valori semnificative statistic p (pragul de

semnificaţie statistică) < 0.05. Testul ,,IST” verifică dacă există diferenţe semnificative între

două grupuri comparate în ceea ce priveşte mediile variabilelor dependente analizate. Modelul

experimental a fost realizat cu acordul comisiei de bioetică a FMV Cluj-Napoca.

Infecţia gastrică cu H. pylori a fost realizată cu succes la toate animalele, aceasta fiind

confirmată după un interval de 14 zile postinfecţie prin metoda PCR.

Hematologic, s-a evidenţiat o creştere a leucocitelor totale, a limfocitelor şi a neutrofilelor

la cobaii infectaţi faţă de martori, dar fără o semnificaţie statistică (p>0.05). În acelaşi sens s-a

observat o diminuare a acestor parametri după ambele protocoale de tratament, dar numai în

cazul neutrofilelor a avut o semnificaţie statistică (p< 0.05, între lotul infectat şi cel tratat cu

antibiotice fără premedicaţie anterioară cu probiotice). De asemenea la cobaii trataţi a existat un

număr semnificativ mai redus de trombocite (posibil efectul secundar al Rifaximinei) faţă de cei

netrataţi (p<0.01 între lotul HP+ netrat şi cel tratat cu premedicaţie probiotică), iar între cele

două loturi tratate nu au existat diferenţe semnificative statistic (p>0.05).

18

Biochimic, au fost urmăriţi o serie de markeri specifici pentru afecţiunile gastrice şi

îndeosebi hepatice, apărute consecutiv infecţiei cu H. pylori precum şi a tratamentului cu

antibiotice. S-a observat o creştere a GOT şi GPT la lotul infectat şi netratat faţă de lotul martor

(Hp-), având semnificaţie statistică numai în cazul enzimei GPT, unde p<0.05. Tot referitor la

valoarea acestor enzime s-a observat că după tratament GPT-ul scade şi se încadrează în limitele

fiziologice la ambele loturi supuse diferenţiat tratamentului, valoarea fiind mai redusă dar fără

semnificaţie statistică în cazul lotului de cobai premedicat cu probiotice. Contrar cu acest lucru

GOT-ul a crescut la lotul tratat cu antibiotice şi fără premedicaţie probiotică faţă de lotul tratat cu

premedicaţie probiotică (p<0.05). Acelaşi lucru s-a întâmplat şi cu fosfataza alcalinã (PA).

Necropsic, la nivelul stomacului la cobaii din lotul infectat cu H.pylori şi netratat (lot

M+) au fost evidenţiate eroziuni gastrice multiple difuze (n=2) şi hiperplazia mucoasei gastrice.

Evaluarea prezenţei bacteriei H.pylori de la nivelul fragmentelor de mucoasã gastricã

provenite de la lotul infectat şi netratat s-a realizat prin urmãtoarele examene: microbiologic

cultural, examenul citopatologic, testul rapid al ureazei, examenul histopatologic cu coloraţii

uzuale şi Giemsa, imunohistochimie şi tehnica PCR.

Prin examenul microbiologic s-a izolat şi identificat H.pylori după 7 zile de la incubaţie

la 2/5 indivizi din lotul de cobai infectat şi netratat. Activitatea ureazică a fost prezentă la 3 cobai

din lotul infectat cu Hp şi netratat, iar examenul histopatologic, nu a evidenţiat în nici un caz

prezenţa bacteriei H. pylori. Imnunohistochimia cu Ac anti-Hp a identificat infecţia

helicobacterianã la doi cobai din lotul infectat şi netratat, fiind negativã pentru celelalte loturi.

Prin intermediul tehnicii PCR s-a obţinut amplificarea secvenţelor de ADN bacterian

pentru H.pylori la 4/5 cobai din lotul A (infectat cu Hp şi netratat). La cobaii din lotul martor

negativ şi din loturile B şi C (infectate şi tratate diferenţiat) nu s-au obţinut produşi de

amplificare pentru Hp, fapt ce explică eradicarea infecţiei cu Hp după tratament.

Histologic, la cobaii din lotul martor negativ (neinfectat) nu au existat leziuni gastrice. În

comparaţie cu acest lot, la cobaii infectaţi cu Hp dar netrataţi (lot A) s-au observat gastrite

cronice active, iar media gradului inflamator gastric a fost unul redus spre moderat.

În cazul lotului de cobai B (infectat cu Hp şi tratat fară premedicaţie probiotică) nu au

fost evidenţiate leziuni de inflamaţie gastrică. La indivizii din lotul C (infectat cu Hp şi tratat cu

antibiotice şi premedicaţie probiotică) au fost evidenţiate leziuni gastrice cronice active discrete.

19

Din punct de vedere statistic nu am obţinut diferenţe semnificative între loturile

experimentale (p>0.05) cu privire la intensitatea lezională de la nivel gastric.

În ceea ce priveşte cuantificarea apoptozelor şi diviziunilor celulare, s-a observat faptul

că la indivizii din loturile infectate cu H.pylori există un număr mai mare de apoptoze şi

diviziuni celulare faţă de cobaii din lotul martor negativ (p=0.028).

Studiul de faţă a demonstrat faptul că infecţia la cobai pe cale orală cu Hp izolat de la om,

determină leziuni gastrice cronice active şi induce procese de apoptoză şi proliferare celulară ce

se pot diminua după eradicarea infecţiei. De asemenea, prin intermediul acestui studiu am

elaborat un nou protocol de combatere a infecţiei gastrice cu H. pylori introducând astfel un nou

antibiotic, Rifaximina, precum şi o premedicaţie cu probiotice, lucru ce a dus la reducerea

efectelor secundare produse de antibiotice.

Concluzii generale

1. Studiul a evidenţiat faptul că infecţia gastrică helicobacteriană este frecvent întâlnită la

câine şi pisică, de cele mai multe ori evoluând cronic şi asimptomatic.

2. La câini leziunile asociate infecţiei helicobacteriene au fost reprezentate de gastrite

cronice şi polipi gastrici, iar la pisici de gastrite acute erozive şi ulceroase.

3. Studiul a scos în evidenţă atât la câine cât şi la pisică o corelaţie semnificativă între

gradul de colonizare helicobacteriană şi intensitatea lezională de la nivel gastric, mai ales

la nivelul regiunii pilorice.

4. Prin intermediul tehnicilor IHC şi PCR s-a pus în evidenţã prezenţa diferitelor specii de

Helicobacter (H.pylori, H. heilmanii si H. felis) cu importanţã patogeneticã şi în acelaşi

timp zoonoticã.

5. Polipii gastrici antrali au fost întâlniţi la un numãr relativ mare de câini (n=15) contrar

literaturii de specialitate, cei mai mulţi fiind de naturã hiperplazicã.

6. Leziunile de polipoză gastrică prin intermediul focarelor de metaplazie/displazie

epitelialã pot reprezenta zone de dezvoltare a cancerului gastric la câine; identificarea

unui polip adenomatos benign confirmã acest lucru.

20

7. Prezenţa infecţiei helicobacteriene în polipii inflamatori, hiperplazici şi adenomatoşi

aduce un argument în plus în ceea ce priveşte etiologia acestor leziuni la câine, aspect

nedescris în literatura de specialitate.

8. Prezenţa gastritelor cronice helicobacteriene în zonele adiacente polipilor gastrici scoate

în evidenţã faptul cã aceştia din urmã se dezvoltã pe fondul unei injurii cronice tisulare cu

o regenerare atipicã a mucoasei gastrice produse de infecţia cu GHLO.

9. Testul ureazei, examenul citopatologic, histopatologia cu coloraţii uzuale şi metoda

Giemsa se pot utiliza cu uşurinţă în diagnosticul infecţiei gastrice cu Helicobacter spp. la

câine şi pisică.

10. Prin intermediul metodelor imunohistochimice şi moleculare de diagnostic s-a evidenţiat

prezenţa infecţiei gastrice cu H. pylori la câini, aspect încă contestat în literatura de

specialiate.

11. În acest studiu s-au evidenţiat o serie de similitudini între om, câine şi pisică privind

etiopatogeneza infecţiei gastrice helicobacteriene, precum şi metodele de diagnostic

utilizate în scopul detectãrii acesteia.

12. Pe baza aspectelor evidenţiate în acest studiu referitoare la infecţia comună cu H. pylori

la om, câine şi pisică, putem afirma faptul că aceste animale de companie reprezintă

potenţiale surse de infecţie helicobacteriană pentru om şi viceversa.

13. Introducearea Rifaximinei alături de probiotice în schema clasică de tratament a infecţiei

gastrice helicobacteriene poate reprezenta pe viitor un nou protocol terapeutic în această

direcţie la om, câine şi pisică.