referat secventiere
-
Upload
alina-patrascu -
Category
Documents
-
view
223 -
download
0
Transcript of referat secventiere
-
7/22/2019 referat secventiere
1/5
Secvenierea acizilor nucleici-Principii generale-
Determinarea secnveelor de AND implic folosirea metodelor biochimice pentru
stabilirea ordinii bazelor azotate dintr-o secven oligonucletidic. Metodele de lucru au
evoluat de la procedurile laborioase bazate pe migrarea n gel de poliacrilamid pan la cele
modern care utilizeaz colorani i detecie prin electroforez capilar. Astfel s -a putut
ajunge ca n prezent s se poat cunoate genomuri i transcriptomuri ntregi.
Datorit vitezei cu care se pot secveia n prezent cantiti mari de AND, aceast
tehnic a nceput s fie folosit n tot mai multe domenii , precum : criminalistic ,
medicin, ecologie i taxonomie. Folosirea tehniclor moleculare cunoate o dezvoltare
mare, iar echipamentele devin mai upr de folosit i ofer o productivitate sporit. Dac n
anii 70 era nevoie de ani de zile de foarte mult munc pentru a secvena numai cteva zeci
de perechi de baze, n prezent se poate determina nlnuirea bazelor pe lungimi de un
milliard de baze ntr-o singur zii.
nainte de dezvoltarea tehnicilor rapide de secveniere, la nceputul anilor 1970
Frederick Sanger, Allan Maxam i Walter Gilbert au folosit diferite metode laborioase pentru
determinarea secvenelor de baze azotate din acizii nucleici. De exemplu, Gilbert i Maxam
(1973) o secven de 24pb, obinut prin metoda de analiz (wandering-spot). Metoda
secvenierii cu un terminator al lanului nucleotidic a fost dezvoltat de Sanger i
colaboratorii si n 1975, metod care a devenit rapid cea preferat de marea majoritate
datorit uurinei cu care se poate efectua i a rezultatelor satisfctoare obinute.
Dificultile de prezentate de dimensiunile mari ale AND-ului a fcur ca initial atenia
cercetrilor s fie ndreptat nspre ARN , mai precis ARNt care are dimensiuni considerabil
mai mici.
Moleculele de ARN erau tiate cu enzimele potrivite n fragmente mai mici , a cror
secven era apoi determinate, apoi structura molecule ntregi era dedus. Aceast metod
consuma foarte mult timp i implica foarte mult munc, fiind nevoie de digestii i de
fractionri succesive. S-au obinut i cteva secvene semnificative de AND , de 50bp, darera nevoie de o alt abordare a problemei pentru a descira fragmente mai mari.
-
7/22/2019 referat secventiere
2/5
Urmtorul pas a fost folosirea metodelor care implicau copierea materialului genetic.
Metoda a fost initial dezvoltat prin sintetizarea noilor catene de pe un fragment de ARN,
folosnd nucleotide marcate radioactive. Folosirea metodelor de copiere pentru AND, implic
folosirea unei AND polimeraze, care copiaz AND-ul monocatenar n direcia 3-5 . Enzimasintetizeaz o nou caten pe baz de complementaritate, dar are nevoie de un capt 3
liber, astfel fiind nevoie de o amors (primer). Prin folosirea nucleo tidelor trifosfatate
marcate radioactive cu 32p n poziia alfa, ADN-ul nou sintetizat paote fi marcat.
Nucleotidele marcate radioactiv cu avantajul c pot fi vizualizate prin autoradiografie.
Iniial primerii erau oligonucleotide sintetizate chimic, dar apoi au fost folosite
fragmente obinute prin tierea cu nou descoperitele endonucleaze de restricie.
Aceste enzime sunt capabile de recunoaterea unui situs specific din secvena deADN, iar apoi s taie n interiorul acesteia sau imediat adiacent.
Prin folosrea procedurii de sintez a unei noi catene se obine o regiune
specific a ADN, marcat radioactiv, care apoi poate fi supus procedurilor de
digestie parial. Nu se cunoateau enzime specifice care s recunoasc un situs de
tiere de o singur nucleotid, astfel fiind nevoie folosirea unei alte metode pentru
obinerea unor fragmente mici. Problema a fost rezolvat prin ncorporarea
ribonuleotidelor n catena nou format, n locul deoxiribonucleotidelor. Se folosea unribonucleotid trifosfatat i alte trei trei dezoxiribonucleotide trifosfatate. Astfel dac se
folosete un exemplu riboCTP i dATP, dGTP, dTPP se poate sintetiza o caten
nou, n care C este n form ribo. Legturile cu riboNTPs pot fi desfcute n condiii
de alcalinitate, astfel ca se poate obine o fragmentare la resturile de C. Folosind
aceast metod au putut fi extinse studiile de secveniere, totui fiind nc nevoie de
fracionari i de analize extensive.
Metoda terminrii lanului
Pentru a crea copii ADN de o radioactivitate specific a fost nevoie de
substratul marcat sa fie n concentraii mai mici e celelalte dNTPs. Frecvent se
observa n urma analizelor c lanurile se termin la situsurile la care ar fi fost nevoie
sa se ncorporeze nucleotidele marcate radioactiv. Prin fracionarea produilor de
diferite lungimi, avnd acelai capt 5 i cu finalul la un nucleotid cunoscut, se poate
obine un pattern de fracionare, proporional cu distribuia nucleotidului marcat
radioactiv de-a lungul secvenei. Prin aflarea pattern-urilor i pentru celelalte
-
7/22/2019 referat secventiere
3/5
nuleotide se poate determina secvena de nucleotide pentru un fragment de ADN.
Viteza de lucru a fost crescut prin migrarea simultan a fraciunilor n geluri de
poliacrilamid. Metoda aceasta a avut un succes limitat, dar a servit ca baz pentru
alte metode, ajungndu-se la tehnica plus i minus, folosit pentru a obine
genomul aproape complex al fagului X174, de 5386 nucleotide.
O metod similar celei de mai sus este cea care folosete dideoxinuleotide
pentru a termina sinteza lanului ADN. Metoda este mai rapid i mai precis dect
cea anterioar i a fost folosit pentru a completa secvena fagului X174, a o
determina pe cea a fagului G4 i a mai multor genomuri mitocondriale.
Dideoxinucleotidele nu au captul 3-OH necesar adugrii de noi nucleotide, astfel
c dup ncorporarea lor acioneaz ca i terminatori, fiind imposibil pentru ADNpolimeraz s adauge noi nucleotide.
Reaciile au loc n patru amestecuri diferite, fiecare cu cte unul din cele patru
dideoxinucleotide. Apoi cele patru amestecuri sunt fracionate n paralel prin
electroforez pe gel de poliacrilamid, sub condiii de denaturare. Acest sistem
separ fragmentele n funie de mrime. Secvena poate fi astfel citit pur i simplu
de pe o autoradiografiere a gelului. Metoda este relativ rapid i secvene de o
lungime de aproximativ 300 nucleotide de la captul 3 al primerului pot fideterminate. Secvene mai lungi de 300 nucleotide pot fi citite, dar sunt mult mai
puin sigure. Aceast metod a fost dezvoltat prin folosirea primerilor marcai
fluorescent, metod cunoscut drept dye primer sequencing.
Metoda a fost dezvoltat mai departe prin folosirea ddNTPs marcate
fluorescent, fiecae cu cte un colorant diferit. Avantajul acestei tehnici este evitarea
folosirii materialelor radioactive i creterea vitezei de lucru fiind nevoie de un singur
amestec de reacie, fiecare colorant florescent oferind rspuns la o lungime diferit
de und. Aceast abordare a secvenierii este cunoscut drept dye terminator
sequencing. Aceste noi dezoltri au deschis calea spre automatizarea secevenierii
i nceputul secvenierilor genomice high-throughput.
n timpul separrii polinucleotidelor marcate, o raz laser excit floroforii.
Fluorescenaemis este colectat de ctre detectoare ( tuburi fotomultiplicatoare ,
elemente CCD sau camere) i apoi trimise ctre computer, unde un software
convertete datele n secevene nucleotidice.
-
7/22/2019 referat secventiere
4/5
Apariia tehnicilor bazate pe detecia fluorescenei a eliminat folosirea
markerilor radioactivi pentru secvenierea materialului genetic, datorit siguranei
sporite, mentenanei reduse, abilitatea de muliplexa i de a achiziiona datele n timp
real.
n ultimii ani au fost dezvoltate protocoale noi pentru pregtirea probelor
pentru secveiere prin amplificare PCR(polymerase chain reaction), care prezint
mult interes datorit avantajelor pe care le prezint fa de tehnicile tradiionale cu
dideoxinucleotide. Avantajele principale sunt: folosirea oricrei secvene ADN mono
sau dublucatenar drept matri, reaciile se pot desfura n microplci sau micro-
reactoare n cazul PCR-ului de emulsie, manipularea manual este minim, este
nevoie de cantiti infirme de matri, de ordinul picomolilor.
n cazul secvenieriiciclice, o singur amors este folosit pentru a amplifica
liniar o caten matri n prezena Taq polimerazei i a unui amestec de dNTPs i
ddNTPs. Majoritatea protocolurilor create recomand folosirea radioizotopilor sau a
fluoroforilor la captul 5 alamorsei. Protocoale folosite n cazul amplificrii cu Taq
polimeraz s-au dovedit foarte utile n obinerea secvenelor de 400-500 nucleotide,
dar i cu proiecte de secveniere la scal mai mare.
Pirosecvenierea
n 1996 metoda de secveniere prin pirosecveniere a fost dezvoltat la
Institutul Regal pentru Tehnologie din Stockholm. Metoda se bazeaz pe
secvenierea prin sintez. Procesul implic sintetizarea unei catene de pe o matri
de ADN i secvenierea acesteia n acelai timp. Activitatea de ncorporare a
nucleotidelor de ctre polimeraz este evideniat printr-o reacie luminescent.
ADN-ul matri este imobilizat pentru un substrat i nucleotidele trifosfatate sunt
adugate i eliminate secvenial. Reacia cu producere de lumin are loc numaicnd
este ncorporat una dintre nucleotide. Prin emiterea de lumin numai la
ncorporarea unui nucleotid se determin secvena.
Ciclul de reacii:
-eliminarea unui pirofosfat la ncorporarea unui nucleotid
-transformarea pirofosfatului n ATP de ctreATP sulfurilaz, n prezena
adenozin 5 fosfosulfatului
-
7/22/2019 referat secventiere
5/5
-ATP particip n conversia luciferinei n oxiluciferin, reacie mediat de
luciferaz, cu eliminare de lumin.
-nucleotidele nencorporate sunt degradate de ctre apiraz, astfel putnd
ncepe un nou ciclu de reacii.
Secveniatoarele care folosesc acest metod sunt cele mai performante n
prezent, ajungnd pn la 1 miliard de perechi de baze secveniate pe zi.
n prezent se lucreaz la alte metode noi de secveniere, inta fiind de 1000
USD pentru secvenierea unui genom uman complet. Exist i un premiu de 10
milioane USD pentru prima echip care va reui s secvenieze 100 de genomuri n
maxim 10 zile, cu o acuratee de cel puin de o eroare la 100.000 de baze azotate,
cuprinznd cel puin 98% din genom i cu un cost mai mic de 10000 USD/genom.