Termene n 2004

SPECIALIZAREA de BIOLOGIEREFERATCOMUNICARE INTERCELULARAPOPTOZA I CANCERULndrumtor tiinific:Prof.univ.dr. Viorica BLANStudent:

Daniela RDULESCUBUCURETI

2015 -

INTRODUCEREMoartea celulara fiziologica este esentiala pentru dezvoltarea si functionarea normala a organismelor multicelulare. Celulele non-necesare, deteriorate si potential nocive trebuie inlaturate din microclimatul celular sanatos pentru asigurarea homeostaziei structurale si functionale a tesutului. Exemple ale mortii celulare fiziologice au fost observate la aproape toate tipurile celulare pe parcursul dezvoltarii si maturarii. Pe parcursul dezvoltarii embrionare modelarea celulara specifica si organogeneza sunt asigurate de un program spatiotemporal definit genetic de proliferare si moarte celulara. In tesuturile adulte, moartea celulara fiziologica apare de asemenea proeminent in interiorul tesuturilor ciclic stimulate sau dependente hormonal, cum sunt endometrul, prostata si glanda mamara, dar si in turnoverul stady-state al multor alte tesuturi. Moartea selectiva a celulelor este fundamentala pentru dezvoltarea, reglarea si functionarea sistemului imun, incluzand eliminarea timocitelor auto-reactive, selectia negativa a limfocitelor T si B si distrugerea celulelor realizata de limfocitele T citotoxice.Apoptoza este un proces innascut, conservat din punct de vedere evolutiv, prin care celulele sistematic isi inactiveaza, isi dezasambleza si isi degradeaza propriile componente structurale si functionale pentru desavarsirea propriului lor deces. Reglarea stricta a acestor parametri modulatori ai mortii trebuie mentinuta pentru asigurarea contextului fiziologic propice aparitiei apoptozei. Disfunctiile ce apar in oricare dintre punctele caii de moarte programata, pot duce la un proces apoptotic eronat determinand astfel la exprimarea unor conditii fiziopatologice.

Importanta apoptozei deriva din natura sa activa si din potentialul sau de a controla sistemele biologice.FAZELE PROCESULUI APOPTICControlul general al numarului de celule ce se efectueaza prin intermediul ciclului celular este compus dintr-un sistem multicompartimentat in interiorul caruia celula are cel putin 3 optiuni posibile.Celula poate fi:

1) metabolic activa dar nu desfasoara nici procesul de proliferare si nici cel de apoptoza (celula aflata in faza G0);

2) in curs de desfasurare a procesului de proliferare (G0G1SG2mitoza)

3) pe punctul de a desfasura procesul de moarte celulara fie pe calea programata (G0D1FD2fragmentare celulara apoptotica), fie pe calea neprogramata (necroza).

Fig. 1. Schema desfasurarii ciclului celular care arata optiunile unei celule aflate in faza G0. D1 defineste perioada pe parcursul careia se activeaza noi gene a caror expresie proteica este ceruta pentru inducerea fragmentarii ADN (faza F). D2 defineste perioada insasi celula se fragmenteaza in corpi apoptoticiCelulele pot fi induse sa intre pe calea mortii celulare programate din orice faza a ciclului celular de proliferare (G1, S sau G2). Semnalele locale sau sistemice ale factorilor de crestere ce regleaza progresia in interiorul ciclului celular sunt specifice tipului celular si sunt independent determinate ca parte a fenotipului de diferentiere a celulei in cauza. Astfel, acelasi factor de crestere (ex: factorul transformant de crestere 1) poate avea efecte agoniste sau antagoniste in cadrul ciclului celular al diferitelor tipuri de celule (ex: inductor al proliferarii celulare in celulele mezemhimale sau inductor al arestului in G0 sau progresia prin fazele apoptozei pentru celulele epiteliale).

Procesul apoptotic poate fi impartit in trei etape distincte:

- angajarea, in care celula care a primit un stimul apoptotic letal devine ireversibil angajata pe calea mortii;

- executarea, pe parcursul careia apar majoritatea modificarilor structurale;

- clearance-ul, in cadrul caruia resturile celulare sunt indepartate prin fagocitoza.

Modificarile structurale ce apar pe parcursul fazei executorii au fost descrise pentru prima data de Kerr si colaboratorii (2), iar acum sunt din ce in ce mai bine intelese din punct de vedere al mecanismului.

BIOCHIMIA APOPTOZEICelulele care sufera apoptoza, se contracta considerabil. Cea mai plauzibila explicatie ar fi aceea ca celula a pierdut apa si, cum nu se evidentiaza o umflare imediata, probabil a pierdut ioni izoosmotic. De asemenea, nu au fost descrise leziuni specifice ale organitelor citoplasmatice, sau ele nu au fost cautate intr-un mod adecvat. A fost observata umflarea cisternelor reticului endoplasmic.

Biochimic, in celula are loc reducerea sintezei de ARN si proteine urmata de degradarea lor.

Desi apoptoza este un proces opus necrozei, reprezentand calea fiziologica de moarte celulara, poate fi de asemenea provocata de stimuli patologici. In general, orice stimul ce produce necroza prin distrugere celulara directa poate induce apoptoza, in cazul in care celula initial supravietuieste. In acest sens, apoptoza reprezinta un raspuns celular coordonat la stimuli vatamatori care nu sunt imediat letali. Nu se poate vorbi de o serie invariabila de evenimente metabolice ce au loc in cursul apoptozei. Totusi, timpuriu, in apoptoza, in multe tipuri celulare apare o crestere sustinuta a nivelului de calciu ionizat citosolic. Calciul, poate activa latent enzime care contribuie la modificarile structurale din cursul apoptozei. Aceste enzime includ o endonucleaza nucleara calciu dependenta care cliveaza invariabil ADN si o transglutaminaza care crosslinkeaza proteine citosolice. Proteazele calciu dependente (calpaina) degradeaza citoscheletul.

In general, procesul apoptotic are nevoie de energie sub forma de ATP, sinteza activa a ARN si proteina depinde de tipul celular si stimulul apoptotic. In limfocitele mature, agentii care inhiba ARN-ul sau sinteza proteica in general duc la blocarea apoptozei; din contra, in neutrofilele imature si in unele linii celulare leucemice, aceeasi compusi amplifica apoptoza. Una din explicatiile acestei contradictii este ca majoritatea celulelor contin proteine reglatoare care pot inhiba sau promova moartea celulara fiziologica. Intr-un tip particular celular, comparand ratele catabolice ale inhibitorilor si promotorilor se poate determina daca sistarea sintezei de ARN si proteice previne sau induce apoptoza.

Fig.2 . Evenimente metabolice ce au loc in apoptoza.

In celulele destinate sa sufere apoptoza creste ARNm pentru -tubulina inainte de aparitia modificarilor morfologice si a clivajului ADN. Intr-o etapa ulterioara, apar si in citoplasma cantitati crescute de -tubulina. Probabil ca, genele pentru -tubulina sunt degradate impreuna cu restul DNA-ului nuclear indata ce endonucleaza devine activaActivitatea endonucleazica, structura cromatinei si degradarea ADN in apoptozaNucleul este locul producerii majoritatii modificarilor dramatice ce au loc in apoptoza.

Modificarile sunt studiate mai bine cu ajutorul microscopiei electronice de transmisie, dar au fost deja vizualizate in celule vii in urma utilizarii colorantilor. Modelul modificarilor difera de la un tip celular la altul dar, in general, nucleul se contracta si cromatina devine foarte densa, se fragmenteaza si, in final se leaga strans de anvelopa nucleara.

Aceasta modificare este adesea acompaniata de fragmentarea ADN in subunitati regulate ce formeaza o scara ca rezultat al ruperii dublu catenare, aparent randomice la nivelul regiunilor linker dintre miezurile nucleozomale. In fiecare celula exista peste un milion de astfel de rupturi ceea ce releva o situatie imposibil de reparat si ca urmare are loc sistarea transcriptiei.

O serie de investigatii au sugerat ca proteinele responsabile de fragmentarea letala a ADN in apoptoza sunt endonucleaze de tip DNaza I care, pentru activare, depind de calciu (Ca2+)De asemenea, intr-o serie de tipuri celulare, in care a fost indusa apoptoza sub diferite forme, s-a demonstrat elevarea sustinuta a nivelului de ioni liberi de calciu intracelular (Cai) care s-a sugerat ca ar fi necesari pentru activarea endonucleazelor de aproximativ 23 kD. Celulele raspund la o crestere a Cai prin pomparea calciului in interiorul unei organite intracelulare sau in afara celulei prin membrana citoplasmatica. Astfel de transport de Ca2+ este catalizat de schimbul membranar de Na2+ - Ca2+ si de proteinele ATP-aze Ca2+. Deoarece ATP-aze Ca2+cere un proton pentru transportul vectorial al Ca2+ in afara celulei un astfel de transport ar putea acidifia celula daca nu ar fi imediat tamponat sau transportat in afara celulei.

De asemenea, se pare ca nucleozomii sunt eliberati de preferinta din regiunea domeniilor rozeta si/sau bucla ce contin elemente repetitive ale ADN pe parcursul fazei secundare de degradare. S-a aratat ca sensibilitatea generala a cromatinei la nucleaze nu este alterata pe parcursul apoptozei.ceasta indica faptul ca in conditiile unui nivel ridicat de Ca2+ fragmentarea de ADN are loc in interiorul buclelor de ADN la un numar strict de loci si nu e dependent de gradul de pliere al fibrei de 30-nm care determina accesibilitatea generala a regiunilor linker.Luand in considerare toate aceste date se poate spune ca fragmentarea endogena a ADN pe parcursul apoptozei se produce in 3 etape.Prima etapa incepe cu activarea unei endonucleaze legata constitutiv de o clasa de SAR (regiuni de atasare a matricei si citoscheletului) bogate in legaturi A-T, care ataseaza domenii mari ale cromozomului la matricea nucleara. Concentratia nucleara endogena de Mg2+ este suficienta pentru activitatea ei. Nu este nici o cerinta de Ca2+ atat timp cat ADN este monocatenar. S-au evidentiat astfel o serie de fragmente monocatenare de ADN pe parcursul procesului de apoptoza. A doua etapa implica propagarea acestei degradari la alte clase de SAR. Aceasta propagare are o dependenta de Ca2+ sugerand ca situsurile si-au imbogatit compozitia in C-G si toata cromatina este redusa la fragmente de ~ 300 kb. In etapa a treia se cliveaza ADN internucleozomal la regiunile linker din interiorul buclelor si genereaza scara ADN. Aceasta clivare este relativ independenta de secventa (in termeni legati de situsurile ce leaga nucleaza) dar necesita Ca2+ pentru cinetica. De asemenea, aceasta etapa necesita proteoliza (56). Factorii aditionali implicati in aceasta etapa ar putea realiza extensia finala a fragmentarii ADN ce difera mult de la un tip celular la altul. Toate aceste etape de degradare sunt catalizate de o enzima sau doua pool-uri de enzime cu proprietati DNaza-I like.Proteinele intracelulare Ced-2, Ced-5 si Ced-10 semnalizeaza intr-o maniera comparabila cu omologii lor mamalieni Crkll, DOCK 180 si Rac mediind reorganizarea si extensia citoscheletului celulei inglobatoare. Ced-7, omoloaga cu ABC-1 activeaza atat in celula muribunda cat si in cea inglobatoare, posibil in transportul transmembranar de lipide. Ced-1 este analog receptorilor scavenger din sistemul mamalian; Ced-7 si Ced-1 promoveaza, probabil, inglobarea interactionand cu proteina adaptoare de semnalizare Ced-6 (78).

Fig. 3.Schema genetica a apoptozei in C. elegans. Au fost izolate mutatiile din 14 gene diferite ce afecteaza apoptoza in diferitele ei etape. Mutatiile ce influenteaza decizia de a murii afecteaza doar un numar mic de gene. Genele implicate in etapele ulterioare sunt comune tuturor celulelor somatice din organism angajate pe calea mortii. Activitatea lui ced-3 si ced-4 promoveaza moartea celulara, iar ced-9 previne acest proces.

TRANSFORMAREA MALIGNA

Deoarece o celula trebuie sa sufere o serie de modificari moleculare pentru a atinge fenotipul malign si datorita faptului ca aceste schimbari sunt deseori induse de agenti sau tratamente care, in timp, altereaza celula, orice activeaza supravietuirea celulelor deteriorate sau initiate promoveaza carcinogeneza.

In majoritatea cazurilor, celulele canceroase sunt diferite de celulele normale din punct de vedere morfologic. Variatiile legate de marimea si forma celulelor si a nucleilor lor corespund pleomorfismului celulelor tumorale. Nucleul este deseori marit, cu densitati inegale (hiper- sau hipocromatism), o membrana nucleara neregulata, angulara, nucleoli proeminenti, singulari sau multipli. Exista o crestere a raportului nucleo-citoplasmatic. Se observa si celule bizare, cu nuclei polilobati sau multipli si celule gigantice.

Majoritatea cancerelor se caracterizeaza printr-un numar mare de celule in diviziune. Aceste mitoze sunt uneori anormale, mitoze tri- sau multipolare. Indicele mitotic, definit prin numarul de mitoze pe unitatea de camp microscopic, are o valoare data contribuind la evaluarea prognostica a tumorilor. In realitate, cancerele nu poseda un indice mitotic ridicat, ca cel care se poate observa in patologia nontumorala. Totusi, in anumite tipuri de cancer, diagnosticul de malignitate se bazeaza pe indicele mitotic.

Oncologii au fost preocupati in principal de proliferarea celulara, cu toate acestea in ultimul timp atentia lor se indreapta, cu un interes din ce in ce mai mare, spre studiul apoptozei

Observatia legata de aparitia apoptozei in tumori nu este recenta. Cu peste 20 de ani in urma s-a sugerat ca apoptoza este responsabila de o mare parte din pierderile celulare ce apar in tumori, observatii obtinute in studiile cinetice, si nu mai este o noutate extinderea ei si activarea in tumori ca urmare a aplicarii bine cunoscutelor metode terapeutice: iradierea, chemoterapia citotoxica, ablatie hormonala. Totusi, in ultimii ani, extinderea cunostintelor despre controlul apoptozei la nivel molecular a dus la largirea semnificatiei ei potential oncologice depasind simpla alimentare a unei explicatii mecaniciste pentru deletia celulelor tumorale. In particular, descoperirea faptului ca apoptoza poate fi reglata de produsii unor anumite proto-oncogene si de gena supresor tumoral p53, a deschis noi drumuri viitoarelor cercetari.

Proteina p53 este o fosfoprotein nuclear, codificat de gena TP53, ce acioneaz ca

senzor pentru multiple forme de stres i controleaz numeroase procese celulare, cele mai importante fiind apoptoza i derularea ciclului celular.Gena TP53 (tumor protein 53) face parte din familia genelor supresoare de tumori. Este localizat pe braul scurt al cromozomului 17, n poziia 17p 13(regiune frecvent deletat n cancere umane).

Atunci cand modificarile de la nivelul ADN cauzeaza acumularea anormala de celule se produce transformarea maligna. Ratele comparative, ale mortii celulare si ale diviziunii celulare, determina viteza de crestere a cancerului. Anumite celule canceroase se divid mult mai incet decat celulele normale, dar, cancerul continua sa se extinda datorita prelungirii timpului de viata al celulei.

Multi carcinogeni provoaca rupturi ADN sau interfera cu enzimele necesare pentru replicarea corecta a ADN. Celula poate raspunde la acest tip de alterare in mai multe feluri: poate intarzia diviziunea celulara pana la rerpararea leziunii, poate suferii apoptoza sau poate progresa fara intrerupere in ciclul de crestere celulara.

Oncogena bcl-2 ar putea fi supresorul general al mortii celulare pentru genele care regleaza direct apoptoza . Toate celulele hematopoetice si limfoide, multe celule epiteliale si neuronii contin gena bcl-2, intalnita in special in membrana mitocondriala, nucleu si reticul endoplasmic.

Produsul proteic al genei supresoare tumorale p53 poate intarzia progresia ciclului celular inaintea initierii sintezei replicative de ADN. Multe cancere umane poseda mutatii sau deletii la nivelul genei p53. Proteinele codificate de virusurile oncogene pot de asemenea lega si inactiva proteina p53. Proasta functionare a p53 poate promova dezvoltarea cancerului prin permiterea duplicarii DNA in celulele cu mutatii secundare, inainte de o reparare completa. Totusi, p53 este doar un inhibitor al diviziunii celulare, in alte situatii se comporta ca o apoptogena directa (o gena ce cauzeaza apoptoza). Superproducerea proteinei p53 normale, in linia celulara leucemica mieloida, induce rapid moartea celulara prin apoptoza.

Fig.4. Relatia dintre proliferarea celulara si apoptoza.

In multe tipuri celulare, proliferarea necesita cel putin doi stimuli externi, uneori numiti semnale de competenta si progresie. Semnalele de competenta declanseaza evenimentele metabolice comune atat replicarii cat si apoptozei; semnalul de progresie abate celula spre replicare, altminteri survine apoptoza.

Apoptoza poate fi considerata o cale alternativa care distruge celulele incapabile sa strabata punctul de vama inainte de replicarea ADN si se petrece in celulele competente activate, cand un semnal de progresie este absent sau anormal sau cand o celula nu-si repara o leziune intr-o perioada critica.

Majoritatea medicamentelor anticancerigene: inhibitori ai topoizomerazei, agenti alchilanti, antimetaboliti si hormoni antagonisti, produc apoptoza in celulele sensibil . In urma acestor observatii este subanteles faptul ca eficienta lor nu depinde totdeauna doar de interactia cu o tinta biochimic specifica; un efect asupra evenimentelor metabolice conducand la apoptoza poate, de asemenea, influenta raspunsul la chemoterapie. S-a descoperit faptul ca, in diferite cancere umane, concentratia endonucleazelor calciu dependente, care degradeaza ADN pe parcursul apoptozei, variaza enorm. Tendinta unei celule cancerigene de a suferi apoptoza poate fi importanta in special pentru terapia tumorilor maligne cu o rata scazuta de crestere, care sunt de obicei rezistente la agenti citostatici.

BIBLIOGRAFIE

1. www.biovision.com

2. www.bioinformatics.org3. www.ncbi.nlm.nih.gov

7