Raport stiintific

privind implementarea proiectului PCE: Efectul exozomilor derivati din celule stem

mezenchimale asupra plasticitatii si remodelarii creierului imbatranit (EXOSTROKE); PN-III-

P4-ID-PCE-2016-0215.

Studii recente au aratat ca efectele regenerative ale celulelor stem ar putea fi mediate de

exozomi. Ca urmare a unei comparații directe anterior realizata de grupul nostru, am

evidentiat faptul că exozomii derivati din celulele stem mezenchimale (MSCs) s-au dovedit la

fel de eficiente ca celulele stem mezenchimale pentru reducerea deficitelor neurologice

după accidente vasculare cerebrale ischemice (AVC) la șoarecii tineri. De aceea, exozomii

sant candidati terapeutici promitatori pentru pacientii cu AVC.

Insa majoritatea pacientilor cu AVC sunt varstnici. Deoarece eficacitatea terapeutică este

diferită între tineri și vârstnici, dorim să testam eficacitatea exozomilor in recuperarea dupa

AVC pe animale batrane. AVC va fi provocat la sobolani tineri (3 luni) prin ocluzia arterei

cerebrale medii. Vehicul, MSC (2x106 MSCs /kg corp) sau exozomi izolati din măduva osoasă

(echivalent cu 2x106 MSCs/kg corp) vor fi administrate intravenos, de trei ori, la 24 de ore si

la 28 zile dupa AVC. Deficitul neurologic va fi evaluat folosind teste motorice, senzoriale si de

memorie specifice (rotarod, grip test, adhesive tape removal, water maze, forced swimm) la

7, 14, 28, 42 si 56 zile dupa AVC. Animalele vor fi sacrificate după 14 zile (n = 12

animale/grup), 28 de zile (n = 12 animale/grup) si 42 de zile (n = 18 animale/grup). Volumul

infarctului, atrofia cerebrala, atrofia corpului calos, leziunile neuronale diseminate,

infiltrarea leucocitara cerebrală, activitatea microglială, formarea cicatricei astrogliale, vor fi

evaluate imunhistochimic. Neurogeneza endogena și angiogeneza vor fi evaluate

imunhistochimic utilizand incorporarea de BrdU. In cazul unui rezultat favorabil, un studiu

proof-of-concept va fi initiat la pacientii cu accident vascular cerebral, deoarece protocoalele

pentru producția larga, purificarea si stocarea de exozomi derivati din MSC sunt în prezent

stabilite la Spitalul Universitar din Essen.

Etapa II Efectul tratamentului timpuriu cu exosomi obtinuti din celule mesenchimale asupra

recuperarii neurologice dupa accident vascular ischemic la sobolani tineri.

Schema de tratament este aratata in imaginea de mai jos:

Experimental Design

Procedure P1

P2

P3 S 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1

0 11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

Physiological constants

Monitoring food and water intake

Behavioral Tests Stroke BrdU administration

Treatment Perfusion

Activitati

1.1. Ocluzia ireversibilă a arterei cerebrale medii

Infarctul cerebral a fost indus prin cauterizarea arterei cerebrale medii. Optsprezece ore

înainte de intervenția chirurgicală, șobolanii au fost privați de hrană. Apa a rămas disponibilă

în orice moment. Artera cerebrală medie dreptă a fost ridicată cu un cârlig de tungsten

atașat la un micromanipulator (Maerzhaeuser Precision Micro-manipulator Systems, Fine

Science Tools) si cauterizata. Ambele artere carotide comune au fost apoi ocluzionate timp

de 90 de minute prin strângerea unei bucle pre-poziționate folosind un stereomicroscop 5x

şi având la dispoziţie instrumente chirurgicale specifice. De-a lungul operației, anestezia a

fost menținută prin inhalare spontană de halotan 1-1,5% într-un amestec de 75% protoxid

de azot și 25% oxigen. Amestecul a fost administrat cu ajutorul unei cuşti etanşe, din

plexiglas. Cuşca a fost folosită pentru inducerea anesteziei, iar pentru menţinerea anesteziei

pe tot parcursul intervenţiei chirugicale s-a folosit o mască special concepută pentru acest

scop. Temperatura corpului a fost permanent monitorizaţă cu ajutorul unei sonde

intrarectale şi menținută la aproximativ 37°C cu ajutorul unei pături homeotermice

(Homeothermic Blanket System-Harvard Apparatus).

1.1 Cuantificarea numarului de celule fluorescente. Celule s-au numarat pe 3 campuri

microscopice aleatorii dar care sa cuprinda 30% din aria infarctului pe fiecare a 20-a

sectiune de 25 micrometri. Numarul total de celule pe volumul de infarct s-a obtinut

prin integrarea numarului de celule sectiune (metoda Cavalieri). S-a observat ca

numarul de celule scade cu crsterea timpului dupa AVC.

1.2 Fenotipizarea celulelor neurogenice dupa stroke. Am dezvoltat tehnici de marcare

dubla si tripla a celulelor neurogenice dupa AVC dupa cum urmeaza.

Protocol de fenotipizare:

Anticorp primar: Rabbit anti NeuN, dilutie 1/1000; MS anti Doublecortin/dilutie 1/4000.

Anticorp secundar: Goat anti Rb CFL 555 dilutie 1/1000; Goat anti Ms POD polimer dilutie 1/10.

Ziua 1: Aplicare primul anticorp primar (rabbit); Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween

Fixare cu PFA 4% , 10 min; Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween

Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton, 1% , restul 1xPBS /0.2%

Tween. Inlocuire blocking cu anticorp primar: Rabbit anti Neu N 1/1000 in 3% GS, restul 1x PBS

/0.2% Tween. Pastrare la 4 gr C peste noapte.

Ziua 2: Spalare de 3x3 min cu 1xPBS/0.2% Tween; Anticorp secundar : Goat anti Rb CFL 555

dilutie 1/1000 in 1% GS , restul 1xPBS; Mentinere pe sectiuni cca 5 ore la RT , sub agitare.

Spalare 3x3 min cu 1XPBS/0.2% Tween. Fixare cu PFA 4%, 10 min. Spalare 3x3 min cu

1XPBS/0.2% Tween. Blocare 1 h cu blocking : 3% Goat serum , 0.1% Triton din 10% Triton, 1% ,

restul 1xPBS /0.2% Tween. Inlocuire blocking cu al doilea anticorp primar: Ms anti Doublecortin,

dilutie 1/4000, peste noapte la 4 gr C in 3% GS, restul 1x PBS /0.2% Tween.

Anticorp secundar: Goat anti Ms POD polimer dilutie 1/10 in 1% GS, restul 1xPBS. Pastrare sub

agitare timp de 5 ore la temp. camerei.

Coloratie sistem Tiramida –FITC. Dilutia finala pe lama 1/500.

II. Stabilirea de teste recuperatorii dupa accidente vasculare Evaluarea recuperării memoriei spaţiale prin testul labirintului radial

Pentru această evaluare, animalele au fost testaţe într-un labirint radial. ce prezintă o

zonă centrală, de la care pleacă radiar 8 braţe simetrice, conturând o formă circular-octogonală.

Acest dispozitiv a fost ridicat la 60 cm înălţime, pentru a evita ieşirea Animlanilor din labirint

peste peretele braţelor.

Animalele au fost plasaţi la capătul unuia dintre cele 8 braţe, folosit totdeauna ca start,

iar celelalte trasee (braţe) fiind considerate ca destinaţii. Compartimentul de start şi fiecare

dintre cele 8 destinaţii au fost etichetate cu simboluri albe şi negre, de diferite forme geometrice,

pentru orientarea animalelor.

Animalele, privaţi de hrană din seara precedentă, au fost plasaţi în labirint în braţul de

start şi, la capătul unuia dintre celelalte braţe, a fost plasată hrană. Aceştia, după ce au găsit

hrana, au fost scoşi din labirint, urmând ca după un interval de 30 de minute să fie plasaţi în

acelaşi labirint, cu hrana în aceeaşi poziţie, fiind nevoiţi să „îşi reamintească” braţul cu

recompensa alimentară.

Notarea şi cuantificarea rezultatelor a fost efectuată astfel:

Ø 0 pentru un parcurs de succes, în care Animlanul a găsit recompensa alimentară, reamintindu-şi

poziţia acesteia;

Ø 1 pentru eşecul găsirii hranei într-un timp mai mic de 3 minute, considerându-se că acest interval

de timp este suficient pentru un găsirea recompensei.

4. RotaRod

Evaluarea funcţiei vestibulo-motorie prin testul barei rotative

Acest test evaluează funcţiile vestibulară şi motorie fină, în cazul recuperării după ischemia

cerebrală, la model animal. Fiecare animal a fost testat în ceea ce priveşte capacitatea de a se

adapta la trecerea peste o punte rotitoare, a cărei viteză de rotaţie poate fi modificată.

Dispozitivul constă într-un cilindru cu o lungime de 160 cm şi diametru de 12 cm,

acoperit cu o suprafaţă semidură, pentru a nu permite animalelor să alunece. Cilindrul se poate

roti, cu ajutorul unui potenţiometru, putând ajusta viteza de la 0 la 6 rotaţii pe minut.

Animalul a fost plasat pe cilindru, măsurându-se timpul necesar pentru a traversa

cilindrul şi de a ajunge la capătul distal, unde se găseşte un grup de animale, plasate într-o cuşcă,

pentru a favoriza deplasarea acestuia. Rezultatele au fost exprimate sub forma a două entităţi:

timpul necesar traversării şi scorul acordat de către examinator comportamentului animalului de

experienţă în timpul traversării, după următoarea schemă:

Ø 0 - Animalul cade imediat după plasarea pe cilindru, fără a se putea deplasa;

Ø 1 - Animalul rămâne pe rotor, dar nu avansează, menţinându-şi totuşi poziţia;

Ø 2 - Animalul avansează, dar cade înainte să ajungă la capătul distal al cilindrului;

Ø 3 - Animalul traversează, dar membrele sunt folosite asimetric, cu preponderenţă membrul

stâng se dovedeşte a fi deficitar;

Ø 4 - Animalul traversează, dar membrul stâng este folosit mai puţin de 50% din timpul necesar

traversării;

Ø 5 - Animalul traversează cu succes, dar având mici dificultăţi în a-şi menţine echilibrul;

Ø 6 - Animalul traversează fără greşeală cilindrul, prezentând mişcări simetrice ale membrelor.

Pentru acest test, animalele trebuie antrenate cel puţin 10 zile înainte de intervenţia chirurgicală,

iniţial fără rotire, dar apoi crescând uşor viteza de rotaţie a cilindrului, până se ajunge la 6 rotaţii

pe minut.

Rezultate

1.1.3. Evaluarea efectului asupra neurogenezei prin imunhistochimie

DCX/BRDU -NEUROGENEZA

CD31/BRDU-ANGIOGENEZA

REZULTATE: Teste de recuperare

Director proiect

Prof. univ. dr. Dirk Hermann

D a y -7

D a y 3

D a y 7

D a y 14

D a y 21

D a y 28

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5

R o ta t in g P o le 6 rp m - A D U L T

D a y s p o s t-s tro k e

Tim

e(s

)

1xT

1 /1 0 x T

C

D a y -7

D a y 3

D a y 7

D a y 14

D a y 21

D a y 28

0

1 0

2 0

3 0

4 0

C y lin d e r T e s t - A d u lt

D a y s a f te r s tro k e

Nr.

of

tou

ch

es

1xT

1 /1 0 x T

C