Random Amplification of Polymorphic DNA

Introducere

Metoda RAPD este o variantă de PCR ce se deosebeşte de aceasta prin faptul că se foloseşte un singur primer, scurt (10 pb), se folosesc 45 de cicluri de amplificare iar temperatura de ataşare a primerilor este de obicei mică (37°C).

Metoda RAPD poate fi folosita pentru studierea polimorfismelor si segregarilor intrapopulationale pentru stabilirea gradului de apropiere dintre formele salbatice si cele domestice, pentru identificarea criteriilor de izolare a notiunilor de specie-subspecie-populatie . Aceste polimorfisme pot fi rezultatul insertiilor, deletiilor sau inversiilor .

Principiul metodei

Metoda RAPD se bazează pe amplificarea ADN-ului cu primeri scurţi, cu segvenţă arbitrară. Din această cauză, aceştia se ataşează de segvenţele complementare de ADN, pe ambele catene, la temperaturi scăzute, rezultând în amplificarea regiunii dintre primeri. Reacţia de amplificare are loc în condiţii de stringenţă scăzută, permiţînd apariţia perechilor de primer-ADN, chiar dacă nu există complementaritate deplină.

Prin urmare, rezultă un set de fragmente amplificate care, separate prin electroforeză vor produce benzi specifice.

Teoretic, primerii se ataşeaza în mai multe regiuni din genom. Totuşi amplificarea lor doar în cazul în care capetele 3’ ale primerilor sunt îndreptate unul spre celălant şi primerii nu sunt la o distanţă mai mare de 3 kb unul de altu. Aceste condiţii sugerează că locurile de ataşare ale primerilor trebuie sa fie secvenţe repetate, inversate.

Tehnica RAPD scanează genomul în căutarea acestor regiuni inversate şi amplifică regiunea dintre ele, care este de mărime variabilă.

Genotipurile sunt evaluate prin intermediul markerilor; benzile comune tuturor indivizilor sunt interpretate ca similarităţi genetice în timp ce benzile care nu sunt comune sunt interpretate ca diferenţe.