Reacţii de identificare pentru oligozaharide şi polizaharide

PROTEINE

Una dintre cele mai importante categorii de substanţe care intra în compoziţia materiei vii o constituie proteinele sau substanţele proteice. Din punct de vedere fizico-chimic ele se caracterizează prin greutate moleculară mare, având deci structura macromoleculară. Prin hidroliză pun în libertate aminoacizi sau peptide.

Proprietatile fizico-chimice ale proteinelor

Soluţiile de proteine, cu unele excepţii (gelatina), precipită la cald sau sub acţiunea diferiţilor agenţi chimici. Datorită prezenţei anumitor aminoacizi, proteinele dau reacţii specifice acestora sau legăturilor formate între ei. În consecinţă proteinele dau două categorii de reacţii:

- reacţii de precipitare

- reacţii de culoare

Reacţii de precipitare

Reacţiile de precipitare se datoresc în parte proprietăţilor fizice ale substanţelor proteice. Astfel, deoarece proteinele au structură macromoleculară, prin dizolvare dau soluţii coloidale. În soluţie proteinele se găsesc sub formă de molecule mari, agregate sau micele. Stabilitatea acestor micele depinde de mărimea lor, de starea lor electrică, de densitatea dizolvantului şi de temperatură, aşa încât reacţiile de precipitare sunt dependente de aceşti factori. Ele se pot împărţite în două grupe:

I. Reacţii reversibile de precipitare

În aceste reacţii proteinele precipitate nu suferă transformări profunde şi de aceea proteina precipitată poate fi redusă în stare de soluţie.

II. Reacţii ireversibile de precipitare

În aceste reacţii proteinele suferă transformări profunde. În acest caz are loc o denaturare a proteinei, astfel încât odată precipitată nu mai poate fi redusă în stare de soluţie. Dintre reacţiile reversibile de precipitare menţionăm salifierea proteinelor, iar din reacţiile ireversibile de precipitare menţionăm: precipitarea prin caldură, cu săruri ale metalelor grele, cu acizi minerali concentraţia cu acizi organici şi cu reactivii alcaloizilor.

1

Reacţii reversibile de Salifierea (precipitare cu (NH4)2SO4) precipitare:

- prin caldură

Reacţii ireversibile de precipitare - cu săruri ale metalelor grele (CuSO4 şi Pb (CH3COO)2)

- cu acizi minerali concentraţi (HCl, HNO3)

- cu acizi organici (CCl3COOH şi acid sulfosalcilic)

- cu reactivii alcaloizilor (Esbach, Bouchardat şi soluţie

saturată de acid picric).

Ca sursă de proteină se foloseşte albuş de ou diluat sau ser sanguin.

Reactivi

- sulfat de amoniu solid;

- acid acetic 1%;

- acid acetic 10%;

- clorură de sodiu solidă;

- hidroxid de sodiu 30%;

- acetat de plumb 0,5%;

- sulfat de cupru 1%;

- acid clorhidric concentrat (d=1,19);

- acid azotic concentrat;

- acid tricloracetic 20%;

- acid sulfosalicilic 20%;

- acid picric soluţie saturată;

- reactiv Bouchardat (12,7 g iod se dizolvă în 100 ml apă distilată în care s-au adaugat 10 g iodură de potasiu);

- reactiv Esbach (1 g acid picric + 2 g acid citric şi apa distilată până la 100 ml).

2

Modul de lucru

Salifierea -Într-o eprubetă se introduce puţin ser sangvin sau albus de ou diluat şi se adaugă sulfat de amoniu solid până nu se mai dizolvă substanţa. Se observă că o dată cu salifierea se formează un precipitat de proteină. Dacă se adaugă apă distilată, precipitatul se dizolvă, deoarece a scăzut concentraţia în sulfat de amoniu. Adăugând din nou sulfat de amoniu, când se ajunge la saturaţie, apare din nou precipitatul.

Separarea albuminelor de globuline

Atât în serul sanguin cât şi în albuşul de ou se găsesc două categorii de proteine mai importante: globulinele şi albuminele. Aceste proteine precipită cu sulfat de amoniu în condiţii diferite: globulinele precipită cu o soluţie de sulfat de amoniu semisaturată, iar albuminele precipită cu o soluţie saturată de sulfat de amoniu.

Pentru a demonstra aceasta se procedează în felul următor: într-o eprubetă se introduce un ml ser sangvin şi un volum egal de soluţie saturate de sulfat de amoniu. Soluţia devine semisaturată. La această concentraţie precipită globulinele. Se filtrează pentru a separa globulinele precipitate de albumine, care se găsesc încă în soluţie. În filtrat se adaugă sulfat de amoniu solid până la saturaţie, când precipită albuminele.

Precipitarea prin caldură

Majoritatea proteinelor precipită la cald. Prin încălzire proteina se denaturează. Mecanismul denaturării termice este legat de restructurarea moleculei proteice. Un rol important în coagularea proteinelor îl joacă prezenţa sărurilor neutre şi concentraţia de ioni de hidrogen. Coagularea cea mai completă şi cea mai rapidă se produce la punctul izoelectric, adică la un pH la care particulele coloidale de proteină au cea mai mare stabilitate.

Modul de lucru – se iau 5 eprubete notate de la 1 la 5 şi se introduce în fiecare 2 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat.

1. Se încălzeşte prima eprubetă şi se observă formarea unui precipitat.

2. În a doua eprubetă se adaugă o picătură de acid acetic şi se încălzeşte. Precipitatul se observă mai repede şi mai complet pentru că prin adăugare de puţin acid acetic proteina a fost adusă mai aproape de punctul izoelectric.

3. În a treia eprubetă se adaugă 0,5 ml acid acetic 10% şi se încălzeşte. Nu apare precipitat, mediul fiind prea acid.

4. În a patra eprubetă se încălzesc 0,5 ml acid acetic 10% şi puţină NaCl solidă. Va apare un precipitat deoarece la mediul acid s-a adăugat o sare neutră (NaCl).

5. În a cincea eprubetă se adaugă 0,5 ml NaOH concentrat şi se încălzeşte. Precipitatul nu mai apare, deoarece mediul este prea alcalin.

3

În concluzie proteinele nu precipită în medii prea acide sau prea alcaline. În mediu acid prezenţa sărurilor neutre înlesneşte precipitarea.

Precipitarea cu săruri ale metalelor grele

Proteinele în soluţie precipită în prezenţa sărurilor metalelor grele, ca: plumb, cupru, mercur etc. Precipitarea este ireversibilă. Se iau două eprubete în care se pune câte 1 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat. În una se adaugă câteva picături de soluţie de acetat de plumb, iar în alta câteva picături de soluţie de sulfat de cupru.

- În ambele eprubete apare precipitat. Precipitatele se dizolvă dacă se adaugă în exces acetat de plumb, respectiv sulfat de cupru.

Precipitarea cu acizi minerali concentraţi

Acizii minerali concentraţi provoacă precipitarea protidelor. Excepţie face acidul fosforic (H3PO4), care nu precipită cu substanţele proteice.

- Se iau două eprubete în care se pune ser sangvin sau albuş de ou diluat şi se adaugă:

- în una acid azotic concentrat, iar în alta acid clorhidric concentrat.

- se formează în ambele eprubete un precipitat alb. Se adaugă în ambele acid azotic, respectiv acid clorhidric în exces. Se va constata că în eprubeta unde s-a lucrat cu acid azotic, precipitatul nu se dizolvă, pe când în eprubeta în care s-a lucrat cu acid clorhidric, precipitatul se dizolvă.

Precipitarea cu acizi organici

Proteinele în soluţie precipită şi cu acizi organici. Acizii tricloracetic şi sulfosalicilic sunt reactivi foarte sensibili şi specifici pentru proteine.

- Într-o eprubetă se pune ser sangvin sau albuş de ou diluat şi se adaugă câteva picături de acid tricloracetic 20%. Se obţine un precipitat alb. Reacţia cu acid sulfosalicilic se execută în acelaşi fel.

Precipitarea cu reactivii alcaloizilor

Soluţiile de proteină pot forma precipitate cu reactivii cu care precipită alcaloizii ca: Esbach, Bouchardat şi soluţie saturate de acid picric. Precipitarea are loc în mediu acid. În mediu alcalin, precipitatul se dizolvă.

- se iau 3 eprubete în care se pune ser sangvin sau albuş de ou diluat.

- în prima se adaugă câteva picături de respectiv Esbach.

- în a doua se adaugă cîteva picături de soluţie saturate de acid picric.

4

- în a treia eprubetă se adaugă câteva picături de reactiv Bouchardat. În prima şi a doua eprubetă apare un precipitat galben, insolubil la cald, iar în a treia eprubetă se obţine un precipitat roşu-brun.

Reacţii de culoare

Reacţiile de culoare se datoresc proprietăţilor chimice ale proteinelor. Ele sunt, de fapt, reacţiile unui anumit amino-acid care intră în compoziţia lor. Nu toate protidele dau aceste reacţii cu aceeaşi intensitate. Aceasta dovedeşte că în general, protidele au aceeaşi compoziţie, dar se deosebesc între ele prin felul, numărul şi secvenţa aminoacizilor. Cele mai importante reacţii de culoare sunt:

1. Reacţia biuretului

2. Reacţia xantoproteică

3. Reacţia Adamkiewicz

4. Reacţia Millon

5. Reacţia sulfului

6. Reacţia ninhidrinei

Reactivi

-sulfat de cupru 1%

- hidroxid de sodiu 10 %

- acid azotic concentrat

- acid acetic concentrat

- acid sulfuric concentrat

- reactiv Millon (într-o capsulă de porţelan se pun 10 g mercur metallic, peste care se adaugă 20 g acid azotic concentrat d= 1,42. Operaţia se face în nişe, deoarece se degajă vapori nitroşi. După răcire se adaugă un volum de două ori mai mare de apă distilată. Se lasă în repaus 24 ore. Dacă nu este perfect limpede, se filtrează.

- acetat de plumb 0,5 %

- hidroxid de sodiu 20%

- ninhidrină 1% soluţie acetonică.

5

Modul de lucru

1. Reactia biuretului

Proteinele şi unii produşi de hidroliză ai proteinelor dau în mediu alcalin, cu cantităţi mici de sulfat de cupru, o coloraţie roz-violet, datorită formării unui derivat peptidic sau protidic cupro-alcalin.

Într-o eprubetă se pun 2 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat, se alcalinizează cu câteva picături de NaOH 10% şi se adaugă apoi cu atenţie, picătură cu picătură, sulfat de cupru 1%. Se obţine o culoare roz-violet. Nu trebuie adăugat prea mult sulfat de cupru, pentru că excesul de NaOH cu CuSO4 poate da hidroxidul cupric, care este un precipitat şi care ar împiedeca observarea culorii roz-violet. Această reacţie se numeşte reacţia biuretului pentru că este dată şi de biuret. Biuretul este o substanţă ce rezultă din condensarea a două molecule de uree, cu eliminarea unei molecule de amoniac:

Derivat peptidic cupro-alcalin

2. Reacţia xantoproteică

Proteinele formează cu HNO3 concentrat, un precipitat alb la rece. Prin încălzire, precipitatul devine galben, iar în medii alcaline culoarea se schimbă în galben-potocaliu. Această reacţie de culoare se datoreşte formării de nitroderivaţi aromatic din aminoacizi cu nucleu aromatic, conţinuţi în protide ca: fenil-alanina, tirozina şi triptofanul.

6

Într-o eprubetă se introduce 2 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat, peste care se adaugă 1 ml HNO 3

concentrat. Se formează un precipitat alb. Prin încălzire, precipitatul devine galben-deschis. Prelungind încălzirea, substanţa protidică se dizolvă parţial şi lichidul capată o culoare galbenă frumoasă. Se alcalinizează cu NH3 concentrat. Se obţine o culoare galben-portocalie.

3. Reacţia Adamkiewicz

Prin tratarea unei soluţii protitice cu acid gliosilic, în prezenţa acidului sulfuric, se obţine o coloraţie roşie-violetă. Aceasta reacţie se datoreşte prezenţei triptofanului în molecula protetică. Proteinele care nu conţin triptofan (spre exemplu gelatina) nu dau reacţia Adamkiewicz. Acidul glioxilic este un acid nestabil, uşor oxidabil şi greu de obţinut ca atare. De aceea, practic, reacţia Adamkiewicz se execută cu acid acetic concentrat, care conţine totdeauna urme de acid glioxilic.

ACID GLIOXILIC

Într-o eprubetă se pun 2 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat, peste care se adaugă un volum egal de acid acetic concentrat. Se introduce apoi în fundul eprubetei 1 ml H2SO4 concentrat. La limita de separaţie între cele două lichide apare un inel roşu-violet.

4. Reacţia Millon

Proteinele dau cu reactivul Millon un precipitat alb, gelatinos, care prin încălzire devine spongios şi capată o culoare roşie-cărămizie. Această reacţie este dată de aminoacizii cu nucleu fenolic, conţinuţi în molecula proteică (tirozina).

Într-o eprubetă se pun 2 ml ser sangvin sau albuş de ou şi se adaugă câteva picături de reactiv Millon. Se încălzeşte. Prin încălzire, precipitatul se strânge, devine spongios şi capată o culoare roşie-cărămizie. Reactivul Millon este un amestec complex de azotat mercuric, azotat mercuros, acid azotic şi acid azotos.

5. Reacţia sulfului

Proteinele care conţin acizi aminaţi de sulf (metionina, cistina, cisteina), prin încălzire în mediu alcalin, pun în libertate sulful sub forma de H2S, care cu o sare de plumb dă un precipitat negru de sulfură de plumb.

Într-o eprubetă se pun 2 ml ser sangvin diluat sau albuş de ou diluat, peste care se adaugă NaOH 20 %. Se încălzeşte până la fierbere şi se adaugă câteva picături dintr-o soluţie de acetat de plumb sau azotat de plumb 0,5 %. Apare un precipitat negru de sulfură de plumb.

7

6. Reacţia ninhidrinei

Aminoacizii dau cu ninhidrina o coloraţie violet-albastră cu excepţia prolinei şi oxiprolinei, care dau o coloraţie galbenă. Reacţia este dată (mai greu) şi de substanţele protidice.

Într-o eprubetă se pun 2 ml ser sangvin sau albuş de ou diluat, iar în altă eprubetă se pun 2 ml soluţie dintr-un aminoacid (glicocol). În ambele eprubete se adaugă câteva picături de ninhidrină. În eprubeta cu soluţie de aminoacid apare o coloraţie violet-albastră intense, iar în eprubetă cu ser sangvin sau albuş de ou diluat apare o coloraţie sau un precipitat albastru, mai puţin intens. Compusul colorat este rezultatul unei serii de reacţii intermediare, prin care aminoacidul este degradat la aldehidă şi CO2, azotul grupării amină fiind singurul care intră în molecula acestui produs final. Între aminoacid şi ninhidrină are loc următoarea reacţie:

Amoniacul degajat se condensează cu o nouă moleculă de ninhidrină şi cu cetoalcoolul format prin reducere ei, rezultând combinaţia I care la pH = 4,5 se transformă în enolul II a cărui sare de amoniu III este colorată în roşu-violet sau purpuriu-albastru.

8

Reacţia ninhidrinei este dată de toate substanţele care conţin grupări aminice. Ea nu este specifică aminoacizilor şi protidelor. Aminoacizii însă reacţionează cu ninhidrina dând CO2, NH3 şi aldehide, cu un atom de carbon în minus decât aminoacidul tratat. Eliberarea dioxidului de carbon este caracterizată existenţei unui carboxil liber în vecinatatea grupării aminice. Aşadar culoarea roz-violet pe care o dau aminoacizii cu ninhidrina nu este specifică, ea fiind dată şi de amoniac, peptide şi protide, dar eliberarea de CO2 în această reacţie este specifică aminoacizilor. Cu ajutorul reacţiei ninhidrinei se pot pune în evidenţa aminoacizii separaţi dintr-un amestec, prin metoda numită cromatografie.

9