UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRONOMICE ȘI

MEDICINĂ VETERINARĂ BUCUREȘTI

FACULTATEA DE BIOTEHNOLOGII

Masterat “Biotehnologii şi siguranța alimentară”, anul I

Temă: Tehnici clasice si moderne de detectie in alimente

pentru Listeria

Disciplină: Metode moderne de detectare a patogenilor și a microorganismelor

modificate genetic (OMG) din alimente

Coordonator: Student:

Conf. Dr. Florentina Matei Barbu Emilia Nicoleta

-BUCUREȘTI-

2013

Cuprins

Introducere..................................................................................................................................3Genul Listeria-Taxonomie..........................................................................................................4Habitat.........................................................................................................................................6Izolarea si identificarea...............................................................................................................6Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare...................................................................................................................7

Metode bacteriologice........................................................................................................................7

Procedeul FDA...................................................................................................................................7

Procedeul USDA-FSIS.......................................................................................................................8

Procedeul NGFIS...............................................................................................................................8

Metodologia de izolare utilizata in tara noastra........................................................................9Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal...................................................................................................................................................11

Metode biochimice...........................................................................................................................13

Metode imunochimice......................................................................................................................14

Metode imunofizice.........................................................................................................................15

Testul imuno-latex............................................................................................................................15

Metode imunofizice..................................................................................................................16Flow-citometria................................................................................................................................16

Imunocaptarea.................................................................................................................................17

Metode fizice....................................................................................................................................18

Impedansmetria................................................................................................................................18

Metode de biologie moleculara........................................................................................................18

Hibridarea cu sonde nucleare...........................................................................................................18

2

Introducere

Listeria spp. este destul de răspândit în natură, fie ca germen saprofit, epifit, fie ca

patogen, atât în mediile naturale cât și în organismul animalelor și al omului. În condiții

prielnice de temperatură și umiditate, germenul poate supraviețui mult timp în sol, ape, gunoi

de grajd, furaje și plante, iar în anumite împrejurări dispune de capacitatea de a se înmulți în

aceste medii, [Weis, J.et al., 1995].

În afară de om, marea majoritate a speciilor de mamifere, păsări domestice și sălbatice

sunt receptive la infecia listerică, [Sergeant, E.S.et al., 1991]

Impactul actual a listeriozei umane nu este pe deplin cunoscut, deoarece în cele mai

multe țări este o boală nedeclarabilă. Factorii de risc în listerioză sunt factori care nu par a

avea o implicare singulară și directă în producerea bolii. Astfel s-a demonstrat că pentru

apariția bolii este necesară asocierea mai multor factori de risc. Orice factor de risc

suplimentar poate crește sansele de producere a bolii, dar nu este obligatoriu să se ajungă la

listerioză, [Jensen, A., et. al., 1995].

3

Genul Listeria-Taxonomie

Genul Listeria cuprinde bacili gram pozitivi, cu dimensiuni cuprinse intre 0,4-0,5

micrometri diametru si 0,5-25 micrometri lungime, cu capetele rotunjite, neramificati, dispusi

in palisade sau in lanturi. Sunt mobili (prezentand in acest sens un numar de 1-5 cili

peritrichi), nesporulati, facultativ anaerobi. Cresc pe medii complexe, in limite largi de

temperatura (3-42‚°C) si in prezenta umor concentratii mari de NaCl (10-12%). Sunt catalazo-

pozitivi, oxidazo-negativi, fermenteaza glucoza cu producere de gaz. 

În acest gen sunt incluse 8 specii:

Listeria monocytogenes

Listeria ivanovii

Listeria innocua

Listeria welshimeri

Listeria seeligeri

Listeria grayi

Listeria murrayi

Listeria denitrificans.

Comitetul International de Sistematica Bacteriana-Subcomitetul de Taxonomie pentru

Listeria, în 1992, la Copenhaga, a stabilit pentru genul Listeria 6 specii si 2 subspecii:

Listeria monocytogenes

Listeria innocua

Listeria ivanovii cu doua subspecii:-ivanovii

-londoniensis

Listeria seeligeri

Listeria welshimeri

Listeria grayi.

În editia a-9-a din 1994 a “Bergey’s Manual of Determinated Bacteriology”, sunt

incluse 7 specii:

Listeria monocytogenes

4

Listeria innocua

Listeria ivanovii

Listeria seeligeri

Listeria welshimeri

Listeria grayi

Listeria murrayi.

În prezent Listeria denitrificans a fost exclusa din acest gen si reclasificata ca Jonesia

denitrificans, iar Listeria grayi si Listeria murrayi pe baza studiilor de hibridare ADN/ARN

facute de Stuart si Welshimer în 1974, sunt suficient de distincte de Listeria monocytogenes,

pentru a forma un gen separat “Murraya” cu doua subspecii:

Murraya grayi subsp.grayi

Murraya grayi subsp.murrayi.

Unii specialisti considera ca genul Listeria este format din 4 specii, Listeria

monocytogenes fiind considerata ca un un grup heterogen care contine tulpini patogene dar si

apatogene. Asa, Listeria innocua este considerata varianta nehemolitica si apatogena a

Listeriei monocytogenes, iar Listeria seeligeri si Listeria welshimeri au fost scoase un timp

din genul Listeria ca fiind apatogene, dar recent s-a demonstrat ca Listeria seeligeri poate

determina meningita purulenta chiar si la persoanele imunocompetente.

5

Habitat

Este prezentă peste tot în natură: la nivelul solului,plantelor, animalelor şi omului.

Infectează animale domestice (mai ales ovine) şi sălbatice, păsări, reptile, peşti,crustacee.

Poate fi izolată din alimente, cu precădere din brânzeturi. Studii mai recente au evidentiat

prezenta L. monocytogenes in alimentele crude sau insuficient preparate termic, de tipul

carnii, produselor din carne, pestilor, crustaceilor, legumelor (ridichi, castraveti), produselor

lactate.

Izolarea si identificarea

Înainte de jumătatea anilor 1980, ˮîmbogățirea la rece ˮ, bazată pe capacitatea Listeriei

de a depăși prin creștere la temperaturi scăzute germenii competitivi, a fost utilizată în

principal pentru izolarea selectivă. Totuși datorită lipsei de specificitate a acestei metode și a

faptului că este lenta (unii cercetători au incubat bulion pana la 6 luni), procedeurile au fost

mult mai îmbunătățite. Ai fost dezvoltate medii care utilizeaza diversi agenti selectivi,

incluzand acriflavina, clorura de litiu, colistin, acid nalixidric, cicloheximida si polimixina.

Aceste metode au largit capacitatea laboratoarelor de microbiologie (in special a celor

implicate in controlul alimentelor) de a izola selectiv Listeria.

Pentru detectarea listeriilor in alimente sunt din ce in ce mai mult utilizate hibridizarea

acizilor nucleici si testele imunoenzimatice.

6

Metode de izolare, identificare si determinare cantitativa a speciei Listeria monocytogenes in produsele alimentare

Metode bacteriologice

Majoritatea procedeelor de izolare si îmbogatire selectiva pentru detectarea speciei

Listeria monocytogenes se bazeaza pe rezistenta acestei bacterii la anumiti agenti selectivi

care inhiba dezvoltarea florei de asociatie.

Agentii selectivi cel mai frecvent utilizati în prepararea mediilor de îmbogatire

selectiva includ : acriflavina, acidul nalidixic, clorura de litiu, feniletanolul, moxalactamul si

altii .

Procedeele de detectare a acestei specii bacteriene în produsele alimentare sau în

spatiile de prelucrare a alimentelor, cele mai raspândite sunt cele recomandate de USDA -

FSIS (US Departament of Agriculture - Food Safety Inspection Service) pentru detectarea

speciei Listeria monocytogenes în carne si produsele din carne si de FDA (Food and Drug

Administration), în lapte si produsele lactate.

Procedeul FDA

Acest procedeu implica o îmbogatire initiala a 25g sau 25ml de proba în 225ml LEB

(Listeria enrichment broth). LEB contine TSB la care se adauga 0,6% extract de drojdie,

50mg cicloheximida, 15mg acriflavina si 40mg acid nalidixic /litru.

Probele se incubeaza la 30°C/24-48h, o modificare a procedeului original care cere o

îmbogatire de 1-7 zile la 30oC. Urmeaza transplantarea de pe LEB pe mediile: Oxford si LPM

(lithium chloride phenylethanol moxalactam), ambele medii înlocuiesc agarul Mc Bride

modificat (MMA), recomandat initial ca mediu selectiv de izolare. Mediile se incubeaza la

35°C/48h apoi coloniile trebuie confirmate ca apartin speciei Listeria monocytogenes. Testele

de confirmare includ examinarea coloniilor alb-bleo în lumina oblica la 45o, mobilitatea,

catalaza, hemoliza pe agarul cu sânge, testul CAMP, rosu-metil, Voges Proskauer, fermentarea

7

manitolului, xilozei si ramnozei .

Procedeul FDA a fost conceput, în mod special pentru optimizarea izolarii speciei

Listeria monocytogenes în lapte si produsele lactate.

Procedeul USDA-FSIS

Procedeul de îmbogatire selectiva USDA-FSIS pentru izolarea speciei Listeria

monocytogenes din carne, a fost dezvoltat de Mc Clain and Lee (25). Ulterior, acest procedeu

a fost utilizat cu succes si pentru produsele lactate si probele de mediu.

De asemenea, acest protocol include o îmbogatire initala a 25ml sau 25g proba în

225ml mediu LEB 1, care înlocuieste bulionul initial de îmbogatire UVM (University of

Vermont Medium).

Bulionul de îmbogatire primara LEB 1 contine pe litru: 5g proteoza- peptona, 5g

triptona, 5g Leb Lemco, 5g extract de drojdie, 20g clorura de sodiu, 12g fosfat disodic - 7-

hidratat, 1,35 fosfat monobazic de potasiu, 1g esculina, 20g acid nalidixic, 1,2mg acriflavina.

Urmeaza incubarea la 30°C/20-24h. Apoi 0,1ml mediu de îmbogatire primara se

transfera în 10ml bulion de îmbogatire secundara Fraser si se incubeaza la 35oC/ 24h si 40h.

Bulionul de îmbogatire secundara Fraser, contine pe litru: 52g UVM, 3g clorura de

litiu, 25mg acriflavina si 0,5g citrat feric de amoniu.

Se incubeaza la 35°C/24-48h, dupa care probele se trec pe agar Oxford

modificat(MOX), care se incubeaza la 35°C/24h si se examineaza coloniile tipice de Listeria.

Hidroliza esculinei si reactia ulterioara cu citratul feric de amoniu, determina producerea unui

precipitat negru în jurul coloniilor de Listeria pe agarul MOX. Coloniile tipice sunt

transplantate pe agar cu 5% sânge de cal. Coloniile transparente, betahemolitice sunt

transplantate în bulion BHI, care se incubeaza peste noapte la 35oC si se efectueaza testele de

confirmare prezentate la procedeul FDA.

Procedeul NGFIS

O metoda larg raspândita în Europa, pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes

în alimente este metoda NGFIS, recomandata de Netherland Goverment Food Inspection

Service, elaborata de Van Netten si col.

8

Acesti autori au raportat o sensibilitate superioara a acestei metode, fata de procedeul

USDA, când se urmareste detectarea speciei Listeria monocytogenes din alimente în care se

afla sub nivelul de 10CFU/ml.

În procedeul NGFIS, pentru îmbogatirea selectiva se utilizeaza bulionul L-

PALCAMY, cu incubare la 30oC/24-48h, apoi cultura se trece pe agar PALCAM.

Bulionul de îmbogatire selectiva L-PALCAMY contine la litru de apa distilata: 23g

peptona Oxoid, 5g extract de drojdie, 5g Lab Lemco, 5g lapte peptonizat Oxoid, 5g Na Cl, 5g

D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI polimixina

B, 5mg acriflavina, 10g clorura de litiu, 30mg ceftazidime, moxalactam si 25ml emulsie de

galbenus de ou.

Agarul PALCAM contine la litrul de apa distilata: 39g agar Columbia, 0,5g D-glucoza,

10g D-manitol, 0,8g esculina, 0,5g citrat feric de amoniu, 80mg rosu fenol, 100000UI

polimixina B, 5mg acriflavina, 15g clorura de litiu si 20mg ceftazidime sau moxalactam.

Numeroase studii au urmarit compararea diferitelor procedee de izolare a speciei

Listeria monocytogenes din produsele alimentare. Doyle and Schoeni(21), au comparat

procedeul FDA, cu metoda de îmbogatire la rece (Gray) si cu un procedeu propriu de

îmbogatire selectiva, SEP, (selective enrichment procedure). S-a urmarit izolarea prin aceste

procedee a speciei Listeria monocytogenes dintr-un lot de brânza "soft ripened" contaminat.

Prezenta bacteriei a fost confirmata, în 41 din 90 de probe examinate. Prin procedeul de

îmbogatire la rece, prezenta bacteriei a fost detectata în 21 probe, în timp ce prin procedeul

FDA, numai în 16 probe.

În cadrul unui studiu al CDC, asupra factorilor de risc alimentari pentru listerioza

sporadica, în perioada noiembrie 1988, decembrie 1990, Hayes si col., au condus un studiu

comparativ al celor 3 procedee microbiologice de izolare a bacteriei din 899 probe de

alimente. Sensibilitatea de detectare pentru fiecare metoda a fost: 65% pentru procedeul FDA,

74% pentru procedeele USDA si NGFIS. Folosind o combinatie a ultimelor doua procedee,

sensibilitatea de detectare a crescut la 90%. Pe baza acestor rezultate CDC a adoptat

utilizarea simultana a metodelor USDA si NGFIS pentru izolarea acestei bacterii din

alimente .

Metodologia de izolare utilizata in tara noastra

9

În tara nostra, se utilizeaza o metodologie de izolare si identificare a speciei Listeria

monocytogenes din produsele alimentare de origine animala, în care sunt incluse 3 metode de

izolare: USDA, TERPLAN si MERCK.

Procedeul USDA a fost prezentat anterior.

Metoda TERPLAN utilizeaza 4 medii de cultura si anume: un bulion de îmbogatire,

agarul Oxford, mediile TSA si TSB.

Bulionul de îmbogatire contine acid nalidixic, hidroxid de potasiu, triptona, peptona,

dextroza, fosfat dipotasic, extract de drojdie si apa distilata. Mediul TSA este un agar cu

triptona din soia, iar mediul TSB este un bulion cu triptona din soia si extract de drojdie.

Proba însamântata în bulionul de îmbogatire se incubeaza 48h la 30oC, dupa care se

fac strieri pe agarul Oxford. Incubarea se realizeaza în aceleasi conditii. Coloniile

caracteristice pentru Listeria spp. sunt mici, înconjurate de un halou negru, 3-5 astfel de

colonii se transplanteaza în mediile TSA si TSB.

Metoda MERCK utilizeaza un bulion de îmbogatire si agarul MERCK.

Bulionul de îmbogatire contine: triptona, glucoza, clorura de sodiu, tiocianat de

potasiu, tiamina si tripaflavina în apa distilata. Agarul MERCK contine: triptona, glucoza,

clorura de sodiu, tiamina, tripaflavina, acid nalidixic, agar si apa distilata.

Proba se însamânteaza în bulionul de îmbogatire, se incubeaza 48h, la 30oC, apoi se

fac strieri pe agarul MERCK. Se incubeaza în aceleasi conditii si 3-5 colonii caracteristice

(mici cu centrul galben-verzui si periferia transparenta usor verde- albastruie), se

transplanteaza în bulion si agar nutritiv.

În continuare se executa testele pentru identificare din care amintim: mobilitatea,

reactia catalazei, reactia oxidazei, fermentarea glucidelor, testul de hemoliza si testul CAMP.

Dupa ce bacteria izolata a fost identificata ca Listeria monocytogenes, urmeaza serotipizarea

tulpinii respective. Datorita faptului ca majoritatea cazurilor de listerioza la om sunt

determinate de trei serotipuri (1/2a, 1/2b si 4b), serotipizarea are o importanta minora în

investigatiile epidemiologice. Numeroase metode de subtipizare au fost utilizate în decursul

timpului: tipizarea fagica, tipizarea izoenzimatica (prin MEE-multilocus enzyme

electrophoresis), ribotipizarea (utilizand Ribosomal DNA fingerprinting), tipizarea plasmidica

si tipizarea în functie de monocinele sintetizate de tulpinile de Listeria monocytogenes [13].

În ultimul timp, pentru detectarea acestei specii bacteriene în produsele alimentare au

fost utilizate o serie de metode rapide care utilizeaza ELISA, flow citometria, sau amprente

AND. Însa aceste metode sunt conditionate de necesitatea îmbogatirii probei la un nivel

10

minim detectabil de 105-106 Listeria/ml.

Toate aceste procedee mentionate anterior, conventionale sau rapide, folosesc medii de

îmbogatire înalt selective, care faciliteaza dezvoltarea bacteriilor din genul Listeria, în pofida

florei de asociatie. Totusi aceste medii selective nu permit detectarea celulelor bacteriene care

au fost afectate de caldura, frig sau substante chimice, însa la un nivel subletal si care ar putea

exista în diferite alimente, sau spatiile tehnologice de obtinere a acestora.

Detectarea celulelor bacteriene listeria afectate de diferiti factori stresanti la un nivel subletal

Stresul provoaca modificari în structura macromoleculara si organizarea celulei

bacteriene. Modificarea proteinelor este de o importanta majora datorita implicarii lor în

metabolismul microorganismului respectiv.

Efectul diferitilor factori de stres (temperatura joasa: 4oC si ridicata: 49oC, valori

extreme de pH :4 si 9,5 precum si diversi factori chimici: detergenti-SDS 0,015%, deoxicolat

0,3% si etanol 5%) asupra profilului proteic la Listeria monocytogenes a fost studiat de

Gormon and Phan-Thanh în anul 1994 [36]. Autorii au observat ca stresul a represat sinteza a

50% din proteinele sintetizate de aceasta bacterie în conditii normale si a indus sinteza unor

proteine noi specifice de stres. Fiecare factor de stres a determinat sinteza unui set de proteine

specifice, totusi au existat si proteine comune sintetizate în prezenta unor factori diferiti. Mai

mult decât atât, acelasi factor a indus sinteza unui singur tip de proteina la 2 specii diferite:

Listeria monocytogenes si Listeria innocua ceea ce demonstreaza ca bacterii înrudite pot

dezvolta strategii similare, daca nu identice, în raspunsul fata de acelasi factor de stres.

Specia Listeria monocytogenes ar putea fi afectata în timpul prelucrarii produselor

alimentare de factori ca: încalzirea, congelarea, uscarea, iradierea, sau expunerea la diferiti

agenti chimici (dezinfectante, conservanti, acizi). Toate procedeele de detectare curenta, cu

exceptia îmbogatirii la rece, implica îmbogatirea selectiva. Tehnica de îmbogatire la rece nu

se poate utiliza însa în analizele de rutina datorita timpului îndelungat (aproape 2 luni) necesar

pentru îmbogatire.

Metodologia curenta subestimeaza însa numarul real de bacterii prezent într-un

produs, datorita neglijarii celulelor bacteriene stresate subletal. Numeroase studii au testat

diferiti compusi (acriflavina, polimixina, feniletanolul) care intra în compozitia mediilor

11

selective si s-a constatat ca acestia inhiba dezvoltarea bacteriilor afectate (stresate) termic.

Studiul factorilor nutritivi care au indus regenerarea listeriilor afectate termic a fost

facut de Busch and Donnely care au constatat ca: Glucoza, lactoza, sucroza, extractul de

drojdie, piruvatul, magneziul si fierul au determinat regenerarea bacteriilor din speciile

Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate de caldura. A fost formulat un mediu de

cultura lichid de regenerare/îmbogatire, care include acesti compusi. Acest mediu, LRB

( Listeria repair broth ), a permis completa revitalizare a celulelor bacteriene afectate, în timp

de 5h la 37oC. LRB contine pe litrul de apa distilata: 30g TSB, 5g glucoza, 6g extract de

drojdie, 4,94g sulfat de magneziu, 0,3g sulfat feros, 10g acid piruvic, 8,5g MOPS-free acid si

13,7g MOPS sare de sodiu. Dupa regenerare, agentii selectivi: acriflavina, acidul nalidixic si

cicloheximida se adauga la LRB în aceleasi concentratii cu cele din bulioanele utilizate de

procedeele USDA si FDA. Comparând eficacitatea LRB de a induce regenerarea/ îmbogatirea

bacteriilor din genul Listeria afectate termic, cu cea a altor medii, s-a observat ca bulioanele

de îmbogatire FDA si UVM nu au indus revitalizarea. Populatiile de Listeria, în mediile de

îmbogatire selectiva dupa 24h incubare, au fost cuprinse între 1,7 x 108 si 9,1 x 108

UFC/ml, comparativ cu populatiile în LRB de 2,5 x 1011- 8,2 x 1011 UFC/ml.

Totodata a fost studiata rezistenta listeriei la conditiile de congelare. Golden si col.[32]

au comparat gradul de afectare a 4 tulpini de Listeria monocytogenes, supuse congelarii la -

18oC, timp de 7 si 14 zile. Procentul de afectare a oscilat între 72 si 80%. El-Kest and Marth

[24] au observat un procent de afectare de 65% si 55% mortalitate, dupa mentinere în tampon

fosfat, la 18oC, 24h. Glicerolul în concentratie de 2 si 4% a asigurat protejarea bacteriilor în

timpul congelarii. Palumbo and Williams au utilizat diferite medii pentru a determina

cantitativ Listeria monocytogenes (afectate sau nu), în diferite produse congelate si a aratat ca

pH-ul produsului a influentat gradul de afectare în timpul stocarii prelungite la - 18oC.

De asemenea a fost examinat modul de revitalizare a bacteriilor din specia Listeria

monocytogenes, afectate de congelare si diferite substante dezinfectante, în LRB. Budo-

Amoako si col. au observat ca bacteriile afectate termic (5 min. la 60oC) si prin congelare (7

zile la -20°C), s-au regenerat în 6-8 h în TSB cu 0,6 % extract de drojdie (TSBYE) la 35oC,

dar si-au pierdut capacitatea de regenerare în LEB.

Procentul de afectare/mortalitate al speciei Listeria monocytogenes au influentat tipul

si concentratia dezinfectantelor, timpul de expunere si procedeul de îmbogatire. Mediul LRB

a permis revitalizarea bacteriilor afectate de actiunea substantelor dezinfectante, pe când

12

UVM ( University of Vermont Medium) nu a indus regenerarea acestora.

Crowford si col. au aratat ca în lapte, Listeria monocytogenes afectata termic, prin

încalzire la 71,7oC si-a pierdut capacitatea de regenerare în timpul stocarii la 4oC/28 zile.

Donnely a studiat capacitatea speciilor Listeria monocytogenes si Listeria innocua afectate

termic de regenerare în laptele pasteurizat. Capacitatea de regenerare a fost puternic

influentata de temperatura. La 4oC, regenerarea a fost initiata dupa 8-10 zile si a fost

completa dupa 16-19zile. În schimb, la 10oC regenerarea a fost initiata imediat si a fost

completa dupa 4 zile. La 26 si la 37oC regenerarea s-a produs dupa 13h si respectiv 9h.

Diferentele între rezultatele obtinute de Crowford si Meyer reflecta temperaturile diferite

utilizate pentru afectarea termica a bacteriilor. Temperatura ridicata folosita de Crowford a

indus afectarea grava, ireversibila a germenilor .

Produse (cum ar fi laptele), care permit regenerarea bacteriilor afectate, asociate cu

nedetectarea germenilor în aceste alimente ar putea avea consecinte semnificative asupra

sanatatii consumatorilor, mai ales daca se au în vedere studiile lui Mc Carthy care au

demonstrat ca germenii din specia Listeria monocytogenes, stresati termic dupa regenerare, au

fost la fel de patogeni ca înainte de afectarea termica.

Metode biochimice

Metodele biochimice se bazeaza pe sisteme biochimice miniaturale cu ajutorul carora

sunt testate tulpinile izolate pe mediile selective.

SISTEMUL API LISTERIA (Bio Merieux, Mary LaEtoile, France) se bazeaza pe

investigarea a zece caractere biochimice într-un sistem microtest, iar rezultatele se

obtin în 24h.

MONO CONFIRM TEST (AES Laboratoire, Combourg, France) este o

micrometoda bazata pe determinarea a patru caractere biochimice care permit

confirmarea genului Listeria si identificarea speciei Listeria monocytogenes.

Evidentierea enzimei D-aminopeptidaza, permite diferentierea tulpinilor de

Listeria monocytogenes în 24 h de alte specii de Listeria.

13

MICROBACT 12L (Rhone-Diagnostic-Lyon-France) este o coloana de identificare

compusa din 11 teste de fermentare a glucidelor si un test de hemoliza. Rezultatele

sunt obtinute în 6-24 ore.

Metode imunochimice

Aceste metode se bazeaza pe recunoasterea antigenului Listeria cu ajutorul

anticorpilor specifici anti-Listeria si mai recent anti-Listeria monocytogenes. Complexul

antigen-anticorp este pus în evidenta printr-o reactie chimica de culoare sau prin fluorescenta.

Aceste metode au o sensibilitate de 105-106 bacterii/ml, ceea ce necesita o îmbogatire

prealabila, de obicei în doua etape (în bulion de îmbogatire). Caracteristicele unor metode

imunochimice sunt prezentate în tabelul 1.

TABEL 1

Caracteristicile unor metode imunochimice pentru detectare Listeria

METODA KIT LISTERIA LISTERIA TEK VIDAS

Tehnica Elisa tip sandwich Elisa tip sandwich ELFA (Enzime Linked

Fluorescent Assay)

Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria

monocit.

Îmbogatire 2-3 zile 2 zile 2 zile 2 zile

Sensibilitate

(UFC/ml)

7x10 10 10 5x10

Rapiditate 1,5h 1,5h 45min. 1,1h

Tehnica de

evidentiere

Colorimetrie (Ac.

cuplati cu

peroxidaza)

Colorimetrie (Ac.

cuplati cu

peroxidaza)

Florimetrie

(Ac. cuplati cu

fosfataza

alcalina)

Florimetrie

(Ac. cuplati cu

fosfataza

alcalina)

14

Sistemul VIDAS permite detectarea Listeria spp. sau Listeria monocytogenes prin

tehnica ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay).

Dupa o dubla îmbogatire în bulionul Fraser, proba este depusa într-un cartus al

sistemului automat. Prin aspirarea probei cu ajutorul unui un con sensibilizat cu anticorpi

monoclonali se asigura fixarea specifica a germenilor din genul Listeria. Complexul antigen-

anticorp este pus în contact cu anticorpi marcati cu fosfataza alcalina, iar ansamblul este

evidentiat cu un substrat al acestei enzime ( 4-metil-umbeliferil-fosfat), prin determinarea

intensitatii fluorescentei la 450 nm.

Metode imunofizice

Aceste metode au la baza formarea complexului antigen-anticorp care este evidentiat

cu ajutorul unei tehnici fizice. Principalele metode sunt prezentate în tabelul 1.

Testul imuno-latex

KIT-ul Listeria Rapid Test (Unipath,Dardilly, France) este un test imunologic realizat

pe o placa ce contine anticorpi monoclonali anti antigenul flagelar B-Listeria, dispusi sub

forma de banda. Proba, dupa o dubla îmbogatire în bulion Fraser si LEB tamponat, este

depusa pe suportul absorbant al placii, care contine particule de latex bleo sensibilizate cu

anticorpi. Prezenta în proba a germenilor din genul Listeria va induce formarea de complexe

antigen-anticorp, cu anticorpii fixati pe particulele de latex. Aceste complexe vor migra prin

capilaritate, de-a lungul suportului pâna vor întâlni anticorpii monoclonali dispusi sub forma

de banda. Datorita imobilizarii complexelor produse, se formeaza o banda de coloare albastra,

în cazul reactiei pozitive.

Principalele avantaje ale acestei tehnici sunt: ergonomia, simplitatea de aplicare si

rapiditatea de interpretare.

Ca si în cazul metodelor ELISA si ELFA, sensibilitatea intrinseca a acestui kit nu

15

permite întotdeauna detectarea rapida a bacteriilor stresate, care se multiplica foarte lent.

TABEL 2

Metode imunofizice

METODA FLOW

CITOMETRY

IMUNO-LATEX IMUNOCAPTARE

Detectare Calitativa Calitativa Listeria

Rapid Test

Cantitativa

Lister Test

Calitativa

Lister Screen

Specificitate Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp. Listeria spp.

Sensibilitate

intrinseca

(UFC/ml)

1 1

Îmbogatire 24h 42h fara 18h

Rapiditate* 26h 43h 27h** 42-66h

Sistem de

detectare Fluorescenta

Imobilizarea

complexelor Ag/Ac-

latex

Etalare pe

geloza dot-

blot

Etalare pe

geloza

PALCAM

* Fara confirmarea rezultatelor

**Cu confirmarea coloniilor prin dot-blot.

16

Flow-citometria

Aceasta metoda permite detectarea unei populatii bacteriene marcate, în mediu lichid.

Dupa o îmbogatire selectiva în bulion LEB, ADN-ul bacterian este colorat cu iodura

de propidium, apoi celulele bacteriene din genul Listeria, sunt marcate cu anticorpi specifici

cuplati cu izotiocianat de fluoresceina. În faza urmatoare, proba este expusa unui fascicul de

raze laser si se realizeaza interpretarea. Celulele bacteriene sunt caracterizate în functie de

morfologie, antigenele de suprafata si continutul în ADN.

Flow-citometria are o sensibilitate intrinseca de 106-107 Listeria monocytogenes/ml,

iar cu o faza de îmbogatire de 24h, contaminarea minima detectabila este de 102 Listeria

monocytogenes/ml. Tehnica este aplicabila si pe probe de consistenta solida, daca examinarea

se executa în bulion de îmbogatire

Imunocaptarea

Imunocaptarea este o metoda originala care permite detectarea si concentrarea

germenilor din genul Listeria existenti într-o proba. Bacteriile sunt captate cu ajutorul

anticorpilor policlonali fixati pe bile magnetice microscopice. Complexele Listeria-imunobile

sunt captate sub actiunea câmpului magnetic, apoi imunobilele sunt spalate, iar complexele

Listeria-anticorpi policlonali sunt evidentiate prin diferite metode. În combinatie cu separarea

imunomagnetica sunt utilizate numeroase sisteme rapide de detectare pentru Listeria: ELISA,

PCR, dot-blot, hibridare etc. Cea mai folosita metoda consta în etalarea imunobilelor pe agar

selectiv, ulterior coloniile caracteristice sunt supuse confirmarii.

Aceasta metoda prezinta avantajul ca permite concentrarea germenilor din genul

Listeria, existenti într-o proba. Datorita utilizarii unui numar mare de imunobile magnetice,

sensibilitatea metodei este foarte mare (1 bacterie/ml.).

Din punct de vedere comercial imunobilele VICAM (Watertown SUA) sunt distribuite

sub forma a doua chituri:

Lister Screen

17

Lister TestTM .

Lister Screen este o metoda calitativa, combinând imunocaptarea cu

etalarea pe agar selectiv PALCAM, totodata este o metoda foarte sensibila (0,5-1UFC/ml.) si

specifica, prezentând avantajul ca permite decelarea bacteriilor stresate din alimente.

Lister TestTM permite o analiza cantitativa a germenilor din genul

Listeria dintr-un produs alimentar sau o proba de mediu. Dupa etapa de imunocaptare

imunobilele sunt etalate pe agar selectiv cu ceftazidima si acid nalidixic. Coloniile

caracteristice sunt supuse confirmarii prin tehnica dot-blot, cu anticorpi monoclonali.

Complexele imune sunt apoi puse în evidenta printr-o reactie enzimatica.

Metoda MIPA (Magnetic Immuno PCR Assay) combina imunocaptarea cu detectarea

prin PCR (poymerase chain reaction). Prin imunocaptare, pe lânga concentrarea germenilor se

asigura si eliminarea unor inhibitori ai polimerizarii, prezenti în unele produse alimentare.

Timpul necesar obtinerii rezultatelor este de 55h.

Metode fizice

Impedansmetria

Aceasta metoda se bazeaza pe determinarea variatiilor electrice dintr-un mediu de

cultura, datorate metabolismului microbian. În cultura obtinuta în bulion se aplica 2 electrozi

care vor înregistra variatia impedantei în urma dezvoltarii culturii. Tehnica poate fi utilizata si

pentru determinarea numarului de germeni si prezinta o serie de avantaje: rapiditatea de

detectare (24h), automatizare, economie de medii si manopera. Totusi, detectarea este dificila

atunci când probele sunt puternic contaminate si impune utilizarea unor medii înalt selective.

Metode de biologie moleculara

18

Tehnicile de biologie moleculara permit detectarea secifica a germenilor din genul

Listeria, sau chiar a speciei Listeria monocytogenes cu ajutorul unor sonde nucleare a caror

tinte sunt localizate pe ADN sau ARN. Totodata sunt metode deosebit de specifice care

asigura detectarea inclusiv a tulpinilor atipice. Dupa utilizarea sondelor nucleare constituite

spre exemplu dintr-un fragment a genei care codifica listeriolizina O, [58], au fost sintetizate

oligonucleotide pentru detectarea bacteriei fie prin hibridare cu o sonda, fie prin tehnica PCR

cu ,,amorse".

Hibridarea cu sonde nucleare

Tehnicile de hibridare a acizilor nucleici se bazeaza pe capacitatea catenelor

complementare de ADN sau ARN de legare specifica si de a forma complexe stabile dublu

catenare. Pentru detectarea speciei Listeria monocytogenes prin hibridare nucleara, se

utilizeaza 2 sonde specifice de ARN ribozomal 16S (Metoda Gene Track sau AccuProbe).

Aceste metode necesita o faza de îmbogatire prealabila indiferent de sonda utilizata (Tabel 3).

TABEL 3

Metode de hibridare cu sonde comerciale pentru detectare Listeria

METODA GENE-TRACK ACCUPROBE TM

Specificitate Listeria spp. sau L.m. L. monocytogenes

Îmbogatire 24h 24-48h*

Sensibilitate

(UFC/ml)

5x104 106

Rapiditate 30 min. 2h 30min

Sistem de evidentiere Colorimetrie (Reactie

imuno-enzimatica)

Luminiscenta

(ester de acridinium)

19

*În caz de rezultat negativ se aplica o îmbogatire secundara.

Kit-ul Accuprobe TM(Gen-Probe sau Diego, USA) permite detectarea specifica a

speciei Listeria monocytogenes dupa îmbogatire si etalare pe geloza. Apoi celulele bacteriene

sunt lizate pentru a elibera ARN-ul ribozomal, iar hibridarea se realizeaza cu o sonda de ADN

monocatenar marcata cu ester de acridinium. Hibrizii sunt detectati prin luminiscenta

(cantitatea de lumina este direct proportionala cu cantitatea de ARN ribozomal).

Bibliografie1. CRAWFORD R.G., BELIVEAU C.M., PEELER J.T., DONNELY C. W. and

BUNNING V.K. (1989). Comparative recovery of uninjured and heat-injured Listeria monocytogenes cells from bovine milk. Appl. Environ. Microbiol. 55, 1490-1494.

2. DESTRO M.T., J.M. FARBER (1996) Use of molecular typing methodes to trace the dissemination of Listeria monocytogenesin a shrimp processing plant., Appl. Envir. Microb., 62, 2, 705-711.

3. DONNELY C.W. and BAIGENT G.J. (1986). Method for flow cytometric detection of Listeria monocytogenes in milk. Appl. Environ. Microbiol. 52:689-695.

20

4. BUDO-AMOAKO E., TOORA S., ABLETT R. and SMITH J. (1992). Evaluation of the ability of primary selective enrichment to resuscitate heat-injured and freeze injured Listeria monocytogenes cells. Appl. Environ. Mi-crobiol. 58, 3177-3179.

5. DOYLE M.P., L.M. MESKE and E.H. MARTH. (1985) Survival of Listeria monocytogenes during manufacture and storage of nonfat dry milk. J. Food Prot. 48, 740-742.

6. EL-KEST S.E. and MARTH E.H. (1992). Freezing of L.monocytogenes and other microorganism: A review. J. Food Prot. 55, 579-582

7. GOLDEN D.A. BEUCHAT L.R. and BRACKETT R.E. (1988). Inactivation and injury Listeria monocytogenes as affected by heating and freezing. Food Microbiol. 5, 17-23.

8. HUI Y.H., RICHARD GORHAM J., MURRELL K.D. and DEAN O. CLIVER. (1994). Foodborne Disease Handbook , Marcel Dekker, N.Y.

9. MEYER D.H. and DONNELLY C.W. (1992) - Effect of incubation temperature on repair of heat-injured Listeria in milk, J. Food Prot., 55, 579-582.

10.PALUMBO S.A. and WILLIAMS A.C. (1991). Resistance of Listeria monocytogenes to freezing in foods. Food Microbiol. 8, 63-68.

11.Mc CARTHY S.A. (1991). Pathogenicity of nonstressed , heat-stressed and resuscitatea Listeria monocytogenes 1A1 cells. Appl. Environ. Microbiol. 57, 2389-2391.

12.THOMAS L.V. and J.W.T. WIMPENNY (1996) Investigation of the effect of combined variations in temperature, pH and NaCl concentration on nisin inhibition of Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus., Appl. Envir.Microb., 62, 2, 2006-2012.

13.WALKER S.J., ARCHER P. and BANKS J.G. (1990). Growth of Listeria monocytogenes of refrigeration temperatures. J. Appl. Bacteriol. 68, 157-162.

14.BEUMER R.R. (1996)-Listeria spp. in domestic environments., Epidem. and Inf., 117, 3, 429- 437.

15. BAYLES D.O., B. A. ANNES and B.J. WILLKINSON (1996), Appl. Eviron Microb., 62, 3, 1116-1119.

16.Alexandru T.Bogdan, Iulian Țogoe, Gheorghe Câmpeanu ș.a, Microbiologia alimentelor-volumul I- Patogeni alimentari, Editura Ascelepius, Bucuresti, 2011.

17. Bărzoi D., Apostu S. – Microbiologia produselor alimentare, Ed. Risoprint, ClujNapoca, 2002, p. 150-155.

18. Bourgeois CM., Mescle J.F., Zucca J. - Microbiologie alimentaire, Aspect microbiologique de la sécurité et de la qualité des aliments, Tec et Doc Lavoisier, Paris, 1996.

19. Bradshaw J.G., Peeler J.T., Twedt R.M. - Thermal resistance of Listeria sp.in milk, I. Food Prot., 54, 1991, p. 12-14.

21