1

“Interactii moleculare generatoare de chiralitate evidentiate

prin corelarea datelor de dicroism circular indus cu calcule cuantice”

-RAPORT STIINTIFIC AL ETAPELOR 2012-2013-

INTRODUCERE

Dicroismul circular indus (ICD) isi poate avea originea fie in modificarea geometriei moleculei achirale care devine,

astfel, chirala, fie in interactia intre momentele de tranzitie magnetic si electric ale celor doua molecule care interactioneaza si

inducerea unei puteri rotatorii nenule pentru molecula chirala [1]. Spectrul de dicroism circular este sensibil la modificarile de

mediu, de geometrie si de densitate electronica, avind drept caracteristica, pe linga pozitia si intensitatea benzii, semnul acesteia.

In acest fel, moleculele achirale pot deveni un senzor al interactiilor necovalente. Rezultate preliminare [2,3] au aratat ca, prin

corelarea datelor experimentale cu cele teoretice, se pot estima atit specia care interactioneaza, cit si modificarile conformationale

care au loc. Totusi, este necesar un studiu mai aprofundat al modului in care cele doua mecanisme de generare a unui semnal ICD

se combina si care este rezultatul asupra spectrului experimental.

Obiectivele acestei perioade au fost studiul interactiilor chirale in medii anizotrope (micele, ciclodextrine, proteine) prin

spectroscopie de dicroism circular cuplata cu simularea spectrelor prin metode de chimie computationala. Aparitia unui semnal de

dicroism circular (ECD) indus pentru aceste sisteme se datoreste modificarii geometriei ligandului care devine, in urma interactiei,

chiral, si/sau interactiei dintre momentele de tranzitie electric si magnetic ale partenerilor [4, 5].

Corelarea datelor experimentale cu cele teoretice permite identificarea speciei/speciilor de ligand care participa la

interactie si a modificarilor conformationale care au loc [6], precum si investigarea modului in care cele doua mecanisme

generatoare de chiralitate se combina si care este rezultatul asupra spectrului experimental.

METODE EXPERIMENTALE SI TEORETICE

Spectrele de dicroism circular si absorbtie au fost inregistrate cu un spectropolarimetru J-815 Jasco. S-a lucrat pe banda

ligandului achiral, urmarindu-se aparitia semnalului dicroic indus al acestuia prin interactia cu un mediu chiral. Pentru fiecare

pereche ligand achiral-mediu chiral studiata au fost selectate conditiile optime de lucru.

Spectrele de fluorescenta (in stare stationara, cu rezolutie in timp) si Raman au fost inregistrate cu un spectrofluorimetru

FLS920 Edinburgh Instruments si un spectrometru Raman NRS-3100 Jasco. S-a urmarit modificarea caracteristicilor emisiei de

fluorescenta a ligandului si a frecventelor sale de vibratie prin interactia cu macromolecula chirala.

Calculele cuantice in solvent au fost efectuate cu programul Gaussian09, folosind metoda DFT cu o functionala B3LYP

si diferite baze de orbitali atomici (6-31G, TZVP, aug-cc-pVDZ, 6-311++G(d,p)). Solvatarea a fost tratata in cadrul modelului

PCM. Modelarea moleculara a complecsilor ligand–ciclodextrina si ligand–proteina s-a efectuat cu programul Autodock 4.0.

Complecsii ligand-ciclodextrina au fost optimizati apoi cu metoda DFT. In toate cazurile, proprietatile spectroscopice au fost

calculate prin metoda (TD)DFT.

REZULTATE SI DISCUTII

Obiectivele propuse in aceste etape au fost:

O.1. Implementarea si optimizarea metodei pe sisteme model

O.2. Studiul unor interactii necovalente in complecsi bimoleculari

O.3. Studiul interactiilor chirale in medii anizotrope

O.4. Studiul moleculelor chirale adsorbite la suprafata nanoparticulelor

In acest scop s-au studiat urmatoarele aspecte:

• Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru sisteme simple (model) si complecsii lor bimoleculari

de tipul molecula chirala- molecula achirala in diferite rapoarte molare. Compusii chirali utilizati au fost: S-(+)-2-butilamina, D-luciferina, acidul S-(+)-4-izobutil-α-metil-fenilacetic, bromura

de (-)-N-dodecil-N-metilefedriniu, β-ciclodextrina (β-CD) si β-ciclodextrina modificata cu fragmente izopropil (2-HP- β-CD).

Compusii achirali au fost derivati de cumarina, p-nitrozodimetilanilina, kaempferol. Un caz aparte il constituie moleculele

achirale ce prezinta benzi electronice n-π*, interzise in spectrul de absorbtie, dar care pot fi permise in spectrul ICD. O a treia

categorie de interes sint amestecurile racemice, anume bilirubina (BLB) si amestec racemic de R- si S-warfarina. Sistemele binare

susceptibile de a forma complecsi prin interactii necovalente au fost monitorizate prin spectroscopie ECD si, ca o metoda de

control, ce poate evidentia formarea de complecsi, spectroscopia Raman.

Sensibilitatea spectrului ECD la conformatia adoptata in urma interactiei il recomanda ca o metoda de studiu al

modificarilor conformationale [7]. Problema se complica in cazul sistemelor labile, care pot adopta mai multe conformatii, iar

spectrul experimental este o medie a spectrelor acestora. Dezavantajul este necesitatea unor calcule laborioase pentru simularea

spectrului. Pentru exemplificare, am considerat un sistem foarte simplu acetona-S-(+)-2-butanol, in care acetona are tendinta de a

accepta protoni in legaturi de H, iar butanolul de a ceda. Prin optimizarea geometriei de echilibru a complexului, am identificat

doua conformatii la energii cvasiegale cu spectre foarte diferite (Figura 1 a), in care semnul benzilor nu este acelasi. Cautarea

conformationala nu a fost exhaustiva. Dar de aici rezulta, pe de o parte, ca semnul benzii ICD nu este intotdeauna acelasi cu cel al

2

componentului chiral care il induce, iar pe de alta parte ca o abordare riguroasa a simularii acestor spectre ar implica luarea in

considerare a dinamicii sistemului studiat prin dinamica moleculara. Nu in ultimul rind, moleculele de solvent pot juca si ele un

rol, astfel ca solvatarea ar trebui considerata explicit.

300 350 400 450 500

-1500

-1000

-500

0

500

1000

1500

R /

10

-40 e

rg e

su

cm

/Ga

uss

/nm

BLB M

BLB M-S-butilamina 1:1

BLB M-S-butilamina 1:2

BLB M-R-butilamina 1:2

a) b)

Figura 1. Spectre ECD simulate ale complecsilor acetona-R-butanol (a), BLB-butilamina (b).

Interactia S-(+)-2-butilaminei cu derivati achirali ai 3-carboxicumarinei. In cazul interactiei S-(+)-2-butilaminei cu mai multi derivati achirali ai 3-carboxicumarinei, in functie de aciditatea

acestora, sunt in principiu posibile 3 cazuri: inexistenta unei interactii, formarea unui complex bimolecular cu legatura de

hidrogen, formarea unei perechi de ioni liberi in solutie prin transfer de proton. Incadrarea intr-o categorie sau alta este guvernata

de marimea energiei libere a procesului de transfer de proton. Considerind structurile celor doi parteneri, aparitia unui semnal

dicroic indus in spectrul derivatului carboxicumarinic ar trebui sa aiba loc numai in cel de-al doilea caz (formare de complex).

Derivatii studiati au urmatoarele valori ale pKa: acid 3 carboxi-5,6-benzocumarinic (1), 3.52, acid 3-carboxicumarinic (2), 3.14,

acid 7-dimetilamino-3-carboxicumarinic (3), 3.06, acid 7-metoxi-3-carboxicumarinic (4), 2.98.

Dupa cum se observa din Figura 2, comportamentul compusilor studiati in prezenta moleculei chirale este diferit, in

functie si de polaritatea solventului in care are loc interactia. Daca 1 prezinta un semnal indus in ACN, 2 si 3 in hexan si ACN, 4 il

prezinta numai in hexan. Un caz special il constituie 3, ale carui spectre in ACN si hexan se prezinta ca imagine in oglinda, cu

doua benzi de tip excitonic, desi compusul nu prezinta in molecula doi cromofori identici. Acest lucru nu a putut fi explicat

deocamdata.

250 300 350 400 450-4

-3

-2

-1

0

1

2

(

md

eg

)

(nm)

a) 1 in ACN

250 300 350 400-4

-2

0

2

4

6

(

md

eg

)

(nm)

b) 2 in hexan

250 275 300 325 350 3750

10

20

30

40

(

md

eg

)

(nm)

c) 2 in ACN

250 300 350 400 450-2

-1

0

1

2

3

4

(

md

eg

)

(nm)

d) 3 in hexan

300 350 400 450

-3

-2

-1

0

1

2

3

(nm)

(

md

eg

)

e) 3 in ACN

250 300 350 400-5

0

5

10

15

(

md

eg

)

(nm)

f) 4 in hexan

Figura 2. Spectre experimentale ICD. [amina]=5×10-2

M; gri: ligand; negru: ligand+amina

Energia libera a procesului de transfer de proton depinde de energia de protonare/deprotonare a celor doi componenti,

de taria legaturii de hidrogen care se formeaza si de polaritatea solventului. Cu cit aciditatea derivatilor de cumarina creste, energia

libera devine mai negativa, favorizind procesul de transfer de proton. Pentru formare de complecsi, transferul de proton trebuie sa

3

fie reversibil. Aceasta se poate asigura modificind polaritatea solventului.

Simularea spectrelor ECD ale complecsilor permite aprofundarea modului de interactie intre cei doi componenti si felul

in care aceasta influenteaza tranzitiile electronice si puterea rotatorie, conducind uneori la concluzii surprinzatoare. Spectrul ECD

simulat al complexului bimolecular format de compusul 2 cu butilamina coreleaza ca lungime de unda a benzilor si intensitate cu

spectrul experimental (Figura 3 a). Geometria optimizata a complexului care corespunde acestui spectru indica formarea unei

legaturi de H (1.53 A). In acest mod, pe baza corelarii dintre spectrul experimental si cel simulat pentru mai multe geometrii

posibile ale complexului, se poate atribui geometria reala in solutie, in diferite medii, intr-un mod similar atribuirii configuratiei

absolute. Spectrul simulat al compusului 4 in prezenta butilaminei in hexan (Figura 3 b) prezinta 3 benzi in domeniul 400-250 nm,

350 nm (+); 323 nm (-); 292 nm (+), care coreleaza ca pozitie si semn cu datele experimentale: 366 nm (+); 328 nm (-); 288 nm

(+).

a) b)

Figura 3. a) Spectrul simulat si experimental in ACN al complexului butilaminei cu 2 si geometria complexului; b) spectrul

simulat al compusului 4 (gri) si al complexului lui cu amina (negru) in hexan.

Pentru a avea inca o dovada experimentala a formarii complexului, au fost efectuate masuratori de spectroscopie Raman

pentru compusii separati si pentru complex (Figura 4 pentru interactia 2- amina). Spectroscopia Raman evidentiaza efectul

interactiei bimoleculare la nivel local, al gruparilor functionale. De asemeni, constituie o metoda de validare a geometriei de

echilibru determinata prin calcule cuantice, pentru care se simuleaza si spectrul Raman. Analiza spectrelor a presupus identificarea

benzilor compusului 2 care isi modifica pozitia/intensitatea in urma complexarii si care sunt situate in regiuni spectrale in care

amina nu prezinta benzi. Aceste benzi sunt indicate in Figura 4, alaturi de atribuirea vibratiilor corespunzatoare, facuta pe baza

unui calcul DFT. Modificarile observate arata in mod clar formarea complexului, remarcandu-se fapul ca fragmentele afectate de

complexare sunt carboxilul si carbonilul.

Figura 4. Spectre Raman ale compusului 2, aminei si complexului bimolecular.

Interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca amestec racemic. Un alt aspect studiat a fost interactia unei molecule chirale cu o molecula ce prezinta doi enantiomeri aflati in solutie ca

amestec racemic. Un astfel de compus este bilirubina (BLB), ai carei enantiomeri sunt notati P si M. Spectrul lor ECD se prezinta

ca obiect si imagine in oglinda, cu doua benzi excitonice, de intensitati aproximativ egale, dar semne diferite, pozitiv-negativ

pentru P. Ele au fost evidentiate in interactie cu albuminele serice [8].

In prezenta S-(+)-sec-butilaminei este indus un semnal dicroic de diferite forme, in functie de mediu. In DCM si DMSO

semnalul prezinta doua benzi excitonice negativ-pozitiv centrate la maximul de absorbtie (440 nm), caracteristice conformerului

Banda

(cm-1)

Atribuire

1747 νC=Ocarbox

1680 νC=Ocetona

1216 νC-Ocarbox, δC-H

657 δC=Ocetona, δC=C

597 δO=C-O, δC=C

563 δC=C in afara planului

1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400

579609

650

563

597

1216

657

1231

1216

16801747

1733

1742

3CCA-BuNH2

BuNH2

(cm-1)

3CCA

4

300 350 400 450 500 550 600

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

[BLB]=9.73*10-5M

[BLB]=3.72*10-5M

CD

(m

de

g)

[BLB] (M)

300 350 400 450 500 550

-5

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3[BLB] = 4.74 *10

-5 M

[BLB]=0 M

CD

(m

de

g)

(nm)

M, in DMSO, in prezenta de SDS, o singura banda pozitiva la 445 nm, ca in Figura 4 a, b. Un caz special il constituie interactia cu

o micela chirala, care presupune probabil doua etape, in functie de concentratia de BLB (Figura 5, c), deoarece forma spectrului se

modifica.

Simularea spectrului ECD al conformerilor P si M ai BLB in interactie cu S-(+)-sec-butilamina (1:1 si 1:2) arata doua

benzi excitonice la 431 si 401 nm (in vacuo), care se regasesc si in spectrul simulat al conformerilor izolati (Figura 1 b). Chiar in

interactie cu R-(-)-sec-butilamina, forma spectrului si semnul benzilor se pastreaza practic nemodificate. Acest fapt pare sa indice

ca aparitia benzilor in spectrul BLB in prezenta unor molecule chirale se datoreaza inducerii unui exces enantiomeric.

400 450 500 550

-6

-4

-2

0

2

4

6

CD

(m

de

g)

(nm)

10 M

40 M

60 M

80 M

100 M

a) b) c)

Figura 5. Spectre de dicroism circular ale BLB in DCM (a); DMSO in prezenta de SDS (b); micele chirale (c).

Studiul experimental (ECD si Raman) si teoretic, pentru compusi achirali inclusi in cavitatea chirala a

ciclodextrinelor

Derivati cumarinici In prezenta 2-hidroxipropil-β-ciclodextrinei s-a inregistrat un semnal de dicroism circular indus pozitiv (figura 6). Din

variatia acestui semnal cu concentratia de ciclodextrina s-a determinat constanta de asociere si o stoechiometrie a complexului de

1:1. Avantajul acestei metode spectrale este acela ca poate valida geometria complexului. Astfel, prin simularea spectrelor de

dicroism circular (TDDFT) pentru diferite geometrii optimizate de complecsi si compararea cu spectrul experimental s-a ales acea

geometrie care reproduce cel mai bine spectrul in ceea ce priveste pozitia, semnul si intensitatea benzilor.

Derivati de fenoxatiina Includerea 10,10-dioxid-fenoxatinei si a 2-brommetil-10,10-dioxid-fenoxatinei in cavitatea - - - si 2-

hidroxipropil- -ciclodextrinei a fost evidentiata prin masuratori de dicroism circular [9]. Desi cei doi derivati de fenoxatiina au

elemente de chiralitate, si anume miscarea de flip-flap a ciclului si rotatia gruparii CH2Br, experimental acestia nu prezinta semnal

dicroic. In schimb, in prezenta ciclodextrinei s-a observat apariatia unui semnal de dicroism circular indus (Figura 7). Din

dependenta acestuia in functie de concentratia de ciclodextrina s-a gasit ca stoechiometria complecsilor formati este de 1:1,

constantele de legare fiind cuprinse intre 80-350 M-1

, in functie de tipul ciclodextrinei. Lipsa semnalului dicroic in absenta ciclodextrinelor a fost explicata prin calcule DFT-TDDFT, care au aratat ca desi o anumita conformatie poate avea semnal dicroic

(Figura 7 c), bariera de rotatie, respectiv bariera miscarii de flip-flap fiind foarte mica (0.53 kcal/mol), semnalul dicroic se

mediaza pentru toti conformerii existenti in solutie. Totodata, calculele TDDFT au permis calcularea directiilor momentelor de

tranzitie care au fost corelate cu semnul benzilor de dicroism si au indicat, conform regulilor empirice Harata-Kodaka, ca

includerea in cavitatea ciclodextrinelor s-a facut axial.

Compusi din clasa flavonoidelor-kaempferolul Interactia kaempferolului cu β-CD conduce la aparitia unor benzi de dicroism circular, ca in Figura 7 b), a caror pozitie

si semn coreleaza cu spectrul simulat pentru o geometrie plana a formei neutre a acestei molecule (Figura 7 d). In acest caz se

poate atribui, pe linga conformatia ligandului in complex, si specia care este inclusa in cavitate, anume specia neutra, desi s-a

lucrat la pH=7.4, iar pKa pentru kaempferol este 7.05.

Molecula de kaempferol prezinta un grad de libertate de rotatie - torsiunea de-a lungul legaturii dintre fragmentele

cromona si fenil. Prima valoare pKa este 7.05, astfel incat la pH neutru kaempferolul se gaseste atit sub forma neutra, cit si ca

anion deprotonat la gruparea hidroxil din pozitia 7. La includerea in cavitatea ciclodextrinei se observa aparitia unui semnal ECD

indus al kaempferolului, alcatuit din patru benzi situate la 227 (–), 260 (+), 312 (+) si 382 (+) nm (Figura 8a). Pe baza corelarii

datelor experimentale cu cele teoretice obtinute din modelarea moleculara a complecsilor de incluziune (folosind metoda

semiempirica PM3 urmata de simularea spectrelor ECD ale complecsilor cei mai stabili la nivel B3LYP/6-31G), s-au evidentiat

urmatoarele: a) desi in solutie kaempferolul se gaseste atit ca molecula neutra, cit si ca anion, specia care este inclusa in cavitatea

ciclodextrinelor este cea anionica; b) conformatia kaempferolului in complex prezinta un unghi de torsiune de -50 grade. Aceste

rezultate se coreleaza cu datele de fluorescenta 3D si timpi de viata, ce arata modificarea ponderii celor trei specii excitate ale

kaempferolului la complexare, si anume cresterea procentului de anion (A*) si tautomer (T*), specii mult mai fluorescente decat

specia normala, N* (Figura 8b). Rezultatele obtinute prin spectroscopie Raman indica modificarea la complexare a frecventelor de

vibratie ale gruparilor carbonil, legaturii C(2)=C(3) si gruparilor OH din pozitiile 3 si 5.

5

INTERACTII CHIRALE CU PROTEINELE

a) chiralitate indusa prin modificari conformationale Interactia acidului 3-carboxibenzocumarinic cu HSA si BSA poate fi studiata pe banda ICD a derivatului cumarinic.

Rezultatele sint prezentate in figura 9, unde se observa diferente atit in forma spectrului, cit si in stoechiometrie: 1:1 in prezenta de

BSA, amestec 1:1 si 1:2 in prezenta de HSA. Mai mult, rezultatele de docking molecular cuplate cu simulari de spectre au condus

la determinarea geometriei complecsilor, atit 1:1, cit si 1:2.

250 300 350 400 4500.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

CD

(m

deg

)

(nm)

Figura 6. Spectrele de dicroism circular indus ale 3-carboxi-5,6-benzocumarinei in prezenta 2-hidroxipropil-β-

ciclodextrinei.

a)

200 250 300 350 400 450

-2

0

2

4

[kaemp]=1x10-4 M etoh:pbs 1:3

[kaemp]=1x10-4 M etoh:pbs 1:3; [-CD]=1.52x10

-2 M

(

md

eg

)

(nm)

b)

c)

d)

Figura 7. Spectre ICD ale10,10-dioxid-fenoxatiinei (a) si kaempferolului (b) in prezenta ciclodextrinei si spectre ECD simulate

(c) si, respectiv (d).

6

200 250 300 350 400 450

-5

0

5

10

kaemp, exp.

kaemp:-CD 1:1, exp.

kaemp:2-HP--CD 1:1, exp.

kaemp:-CD 1:1, simulat

(

mg

rad

e)

(nm)

kaemp

330

460

350

400

350 625400 500

Wavele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0 kaemp:β-CD 1:1

330

460

350

400

350 625400 500

Wavele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0 kaemp:2-HP-β-CD 1:1

330

460

350

400

350 625400 500

Wavele

ng

th [

nm

]

Wavelength [nm]

500

0

(a) (b)

Figura 8. Spectre ECD experimentale si simulat (B3LYP/6-31G) (a) si spectre de fluorescenta 3D (b) ale complecsilor

1:1 kaempferol–ciclodextrina. Este prezentata si geometria complexului kaempferol–β-CD.

300 350 400 450

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

324 nm

357 nm

d/p=2.02

Ab

sorb

an

ce

(nm)

a)

300 350 400 450

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0 387 nm

330 nm

Ab

so

rba

nce

(nm)

b)

300 330 360 390 420 450

-4

0

4

8

12

16

20

(

md

eg

)

(nm)

c)

300 330 360 390 420 450

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

(

md

eg

)

(nm)

d) Figura 9. Spectre de absorbtie si dicroism circular ale amestecurilor de acid 3-carboxibenzocumarinic -BSA (a) si (c),

acid 3-carboxibenzocumarinic -HSA (b) si (d).

7

Spre deosebire de spectrele ICD, prelucrarea datelor de absorbtie ale acelorasi amestecuri nu permite identificarea unor

diferente structurale si de stoechiometrie intre complecsii acidului 3-carboxibenzocumarinic -HSA si acidului 3-

carboxibenzocumarinic -BSA. Se dovedeste astfel adecvarea si caracterul mai larg de aplicabilitate al metodei ICD in studiul unor

interactii moleculare complexe.

Diferentele ce apar in interactia derivatului cumarinic cu albuminele pot fi explicate prin modelarea moleculara a

complecsilor proteina-ligand. Rezultatele de docking molecular arata ca acidul 3-carboxibenzocumarinic se leaga la situsul

Sudlow I al HSA, dar la situsul Sudlow II al BSA (figura 10).

Rezultate indica posibilitatea legarii unei a doua molecule de ligand la HSA, in situsul bilirubinei, cu formarea unui

complex stabil. Se explica astfel formarea complexului 1:2 observata experimental. Pornind de la geometria liganzilor in acesti

complecsi, prin simularea spectrului de dicroism circular pentru monomer si dimer am obtinut o buna corelatie cu datele

experimentale ale complecsilor 1:1 si 1:2. Prin aceasta metoda se pot extrage maximum de informatii structurale din spectrele

experimentale ICD.

Acidul 3-carboxibenzocumarinic, desi este o molecula cu structura simpla, poate prezenta forme foarte diferite ale

spectrului ICD in diferite medii anizotrope, ceea ce o recomanda ca proba ICD. Acest fapt va fi aprofundat in etapa urmatoare,

gasirea unor probe ICD fiind unul din obiectivele propuse.

a) b)

Figura 10. Geometria complecsilor acidului 3-carboxibenzocumarinic cu HSA (a) si cu BSA (b). Este figurata pozitia

TRP214, respectiv 212 (aflat in situsul Sudlow I) si pozitia ligandului in complecsii cei mai stabili.

b) Chiralitate indusa prin cuplaj excitonic intra- sau intermolecular Asa cum s-a aratat mai sus pentru cazul kaempferolului, corelarea datelor experimentale de ICD cu rezultatele

calculelor DFT permite identificarea speciei si conformatiei unui ligand achiral ce dobandeste chiralitate prin interactia cu un

mediu chiral. In cele ce urmeaza sint prezentate rezultatele obtinute extinzind aceasta metoda la sisteme ligand–proteina in care

chiralitatea indusa a ligandului se datoreste unui mecanism de cuplaj excitonic [10]. Patru liganzi model au fost selectati in acest

scop, pentru abilitatea lor de a forma excitoni intra- si/sau intermoleculari: curcumina, auramina O, tacrina si benzo[a]piren.

Pentru a identifica natura si numarul speciilor legate la proteina, s-au simulat spectrele ECD (B3LYP/6-31G(d,p), B3LYP/TZVP)

pentru diferite conformatii ale speciilor neutre si/sau cationice ale liganzilor, in forma de monomer sau dimer, in absenta si in

prezenta L-triptofanului. Rezultatele teoretice au fost comparate cu date experimentale de ICD din literatura, obtinute pentru

interactia acestor liganzi cu alfa-1 glicoproteina [11]. Astfel, in fiecare caz, s-a identificat mecanismul responsabil pentru

inducerea chiralitatii ligandului. Auramina O si tacrina se leaga in forma cationica, ca dimeri, cuplajul excitonic avind loc intre

momentele de tranzitie apartinind la doua molecule individuale de ligand legat (Figura 11a si b). In cazul benzo[a]pirenului,

cuplajul excitonic se produce preponderent intre tranzitii electronice apartinind ligandului legat si resturilor de aminoacizi situate

in apropierea sa (L-triptofan in alfa-1 glicoproteine) (Figura 11c). Astfel, s-a aratat ca prin coroborarea rezultatelor de ICD cu

calculele teoretice putem reproduce si interpreta caracteristicile spectrale ale benzilor excitonice.

300 350 400 450 500

-400

-200

0

200

EC

D

(nm)

auramina O, dimer

auramina O + L-Trp

exp.

a)

175 200 225 250 275

-300

-150

0

150

300

EC

D

(nm)

tacrina, dimer

tacrina + L-Trp

exp.

b)

225 300 375 450

-150

-75

0

75

EC

D

(nm)

benzo[a]piren, dimer

benzo[a]piren + L-Trp

exp.

c)

Figura 11. Spectre ECD simulate ale unor excitoni intermoleculari homo- (a, b) si heterocvasidegenerati (c).

In prezenta de alfa-1 glicoproteina, tacrina prezinta un semnal ECD indus cu doua benzi la 253 nm (+) si 239 nm (-)

8

atribuit formarii unui exciton intermolecular [11

]. In cazul tacrinei, formarea excitonilor a fost studiata avind in vedere doua

aspecte: a) in scopul estimarii capacitatii metodelor teoretice de a simula spectrul ECD experimental [6], si b) pentru stabilirea

limitelor in utilizarea conceptului de “cuplaj excitonic”, asa cum este descris de modelul Kasha [12

], pentru explicarea aparitiei de

semnale +/- in spectrul ECD. S-a studiat mai intii monomerul izolat (optimizare de geometrie, simulare de spectre), caracterizindu-

se spectrele ECD si de absorbtie (in ceea ce priveste pozitia si semnul benzilor, taria oscilatorului, localizarea momentelor de

tranzitie electric si magnetic), precum si starile excitate corespunzatoare (energie, forma functiilor de unda, localizare de orbitali

moleculari). S-au construit apoi mai multe structuri pentru dimer, studiindu-se influenta factorilor geometrici asupra formei

spectrului ECD simulat. Factorii geometrici considerati au fost distanta intercromoforica dintre centrii celor doi monomeri, diedrul

dintre momentele electrice de tranzitie ale monomerilor, unghiul dintre distanta intercromoforica si momentul electric de tranzitie

al monomerului, alte unghiuri ce descriu inclinarea si descentrarea unui monomer fata de celalalt. In construirea structurilor pentru

dimer s-a pornit de la doua structuri optimizate de monomer, considerindu-se ca cele doua grupari fenil se gasesc fie de aceeasi

parte a nucleelor acridinice centrale, fie de parti opuse. Intensitatea benzilor ECD, i.e. puterea rotatorie, depinde de distanta

intercromoforica (Figura 12A), in timp ce semnul +/- al benzilor ECD a fost regasit pentru valori ale unghiului diedru dintre

momentele electrice de tranzitie intre 0 si 90 de grade, si -90 si -180 de grade (Figura 12B). S-a observat ca raportul dintre

intensitatile benzilor pozitiva si negativa scade odata cu scaderea simetriei dimerului (la inclinarea si/sau descentrarea unei

molecule de monomer, Figura 12C). Prin coroborarea acestor informatii cu date asupra localizarii orbitalilor moleculari si

compozitiei functiilor de unda s-a putut stabili pentru ce valori ale parametrilor geometrici sunt respectate regulile Kasha ale

cuplajului excitonic, respectiv care dintre semnalele +/- obtinute pot cu certitudine sa fie atribuite formarii de excitoni

intramoleculari. Influenta functionalei/setului de baza asupra formei spectrului ECD simulat este prezentata in Figura 12D.

Functionalele folosite au fost B3LYP, CAM-B3LYP si B2PLYPD, cu seturi de baza 6-31G, aug-cc-pVDZ, TZVP si 6-311++G**.

S-a constatat ca baza de orbitali atomici nu influenteaza semnificativ geometria monomerului, insa are efect asupra pozitiei

benzilor.

200 220 240 260-300

-200

-100

0

100

200

(A)

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

15A

20A

(nm)

5A

10A

180 200 220 240 260

-100

-50

0

50

100

(B)

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

(nm)

40

80

-120

-160

180 200 220 240 260 280-75

-50

-25

0

25

50

(C)

1 monomer

inclinat la 75o

monomeri

paraleli

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

I+/I

-=0.32

I+/I

-=0.92

(nm)

175 200 225 250 275-150

-100

-50

0

50

100

150

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

exp.

6-31G

TZVP

6-311++G**

(nm)

-20

-10

0

10

20

(D)

(m

deg

)

Figura 12. Influenta distantei intercromoforice (A), a diedrului dintre momentele electrice de tranzitie ale monomerilor

(B) si a simetriei dimerului (C) asupra formei spectrului ECD simulat. (D) Influenta bazei de orbitali atomici asupra alurii

spectrului ECD.

Localizarea dimerului in alfa-1 glicoproteina a fost modelata cu ajutorul programul Autodock. S-a lucrat in doua moduri,

simulind formarea succesiva de complecsi 1:1 si 1:2 si respectiv docind la proteina un dimer deja construit. Complecsii 1:2 in care

distanta intercromoforica in dimer este de 7-10 A sint mai favorizati energetic (Einter. = 9-10 kcal/mol) decit complecsii formati de

dimeri cu distante intercromoforice mici (3-4 A, Einter. = 6-7 kcal/mol). In cei mai stabili complecsi, dimerul este localizat la

intrarea in situsul de legare al glicoproteinei (Figura 13), la 11 A distanta de restul Trp25.

Un alt sistem studiat este curcumina in interactie cu HSA sau AGP. Am avut ca obiectiv rationalizarea si explicarea

datelor experimentale prin corelarea cu calcule de chimie computationala. Spectrul experimental la pH=7.4 prezinta 3 benzi, la

485, 423 si 368 nm, de semn (+), (-) si, respectiv (-) si raport de intensitati 1.0:0.7:1.4 in prezenta de HSA si la 472, 415, 360 nm,

de semn (-), (+), (+), dar raport de intensitati 1.0:0.3:0.1 in prezenta de AGP, astfel ca exista diferente conformationale intre

lingandul in stare legata la cele doua proteine. Corelarea cu spectrele simulate ale tuturor speciilor posibile ale moleculei neutre

9

indica interactia in conformatii torsionate diferite a speciei neutre la cele doua proteine la pH=7.4. La pH=9.0, forma spectrului

experimental se modifica, existind 2 benzi de tip excitonic la 497 nm (+) si 427 nm (-). Din corelarea spectrului ECD simulat al

diferitelor specii ionice posibile cu spectrul ICD experimental, s-a identificat specia care interactioneaza cu proteina in mediu

bazic.

Figura 13. Geometria diferitilor complecsi de interactie ai tacrinei cu AGP si spectrul ECD simulat.

INTERACTIA MOLECULELOR CHIRALE CU NANOPARTICULE METALICE Dupa cum se stie, tiolii se adsorb cu usurinta pe suprafata nanoparticulelor metalice de Ag si Au, de aceea am ales tioli

chirali, ca cisteina, tiocolesterol, glutationa ca molecule model pentru evidentierea interactiilor cu nanoparticulele prin

spectroscopie ICD. In afara de acestea, ne-am propus sa studiem posibilitatea inducerii unui semnal de dicroism indus al

nanoparticulelor in prezenta micelelor chirale si a proteinelor. Metodele de preparare a nanoparticulelor pe care le utilizam sint

cele clasice, prin reducere a azotatului de argint cu citrat sau hidroborura de sodiu. Am optimizat conditiile experimentale pentru

etapa de adsorbtie la suprafata si inregistrare a spectrelor. Din punct de vedere teoretic, sintem in faza de alegere a metodologiei de

lucru celei mai adecvate (functionala, set de baza, marimea clusterului metalic, procedura computationala), atit pentru a modela

adecvat sistemul complex nanoparticula-molecula chirala, cit si pentru a putea simula spectrele ECD. Rezultatele finale

corespunzatoare acestui obiectiv vor fi raportate in etapa urmatoare (vezi discutia de la concluzii).

CONCLUZII

Am demonstrat ca, prin corelarea spectrului experimental de dicroism circular indus al unor molecule achirale cu spectrul

simulat prin metode de calcul cuantic a diferitelor conformatii si specii posibile, se pot extrage informatii structurale asupra

interactiei acestor molecule cu diferite medii anizotrope.

O.1. (A.1.1., A.1.2., A.1.3.) In aceste etape s-au studiat interactii chirale ale unor molecule relativ simple si s-a confirmat faptul ca dicroismul circular

si spectroscopia Raman aduc informatii complementare in ceea ce priveste acest tip de interactii.

Corelarea datelor experimentale de dicroism circular indus cu cele teoretice permite determinarea geometriei complexului

si a modului de interactie, pe linga constantele de legare si stoechiometrie. Spectroscopia Raman completeaza imaginea prin

informatii asupra modificarilor la nivelul gruparilor functionale.

O.2. (A.2.1., A.2.2., A.2.3., A.2.4.) S-au evidentiat interactii chirale in sisteme bimoleculare molecula chirala-molecula achirala, micela chirala-molecula

achirala, molecula chirala-amestec racemic. Derivatii de cumarina interactioneaza cu S-sec-butilamina prin formare de legaturi de

H. S-sec-butilamina si micelele chirale determina aparitia unui exces enantiomeric pentru BLB.

O.3. (A.3.1., A.3.2., A.3.3., A.3.4., A.3.5., A.3.6.) In cazul complecsilor de incluziune cu ciclodextrinele, pe linga determinarea constantelor de legare si a stoechiometriei,

aspectul cel mai important este estimarea, prin corelare spectru ICD experimental-simulat, a speciei incluse si a conformatiei

ligandului. S-au studiat mai multe tipuri de complecsi cu albuminele, care au inclus excitoni de tip intra- sau intermoleculari si s-

au rationalizat rezultatele experimentale si teoretice.

O.4. (A.4.1., A.4.2., A.4.3., A.4.4., A.4.5.) In prezent exista rezultate preliminare cu privire la spectrele ECD ale unor compusi cu S in prezenta de nanoparticule si

citeva incercari pe sisteme proteine-nanoparticule. Rezultatele sint corelate cu date de spectroscopie Raman. Mentionam ca

200 220 240 260 280

-40

-20

0

20

cluster 1.1

cluster 2.1

R (

10

-40 e

rg·e

su

·cm

/Gau

ss)

(nm)

10

proiectul a inceput in ian. 2012 (directorul avea in derulare un proiect IDEI, finalizat in dec 2011), astfel ca exista un decalaj de 3

luni fata de calendarul estimat in propunerea de proiect. Acest obiectiv va fi realizat complet in urmatoarele doua luni din 2013 si

primele 3 luni din 2014.

Din rezultatele acestor etape, s-au publicat pina in prezent 3 articole: ref. 6, 7 si 9. Au fost prezentate un numar de 6

postere la conferinte internationale. O parte a rezultatelor se afla in curs de redactare si vor fi ulterior publicate in jurnale ISI dupa

cum urmeaza (titlurile nu sunt definitive):

1. A. Precupas (Varlan), S. Ionescu, M. Hillebrand, „Induced circular dichroism and molecular modeling of the

interaction between 5,6- benzocoumarin-3-carboxylic acid and human or bovine serum albumins”.

2. A. Precupas (Varlan), S. Ionescu, „Chiral interactions of bilirubin in isotropic and organized media”.

3. I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, "A Theoretical Study of Exciton Coupling in Protein–Ligand Interactions”.

4. C. Tablet, I. Matei, S. Ionescu “Induced chirality of coumarin derivatives in cyclodextrins and chiral micelles”.

5. I. Matei, C. Tablet, S. Ionescu, „What different spectral methods can tell about the kaempferol-cyclodextrin

interaction”.

6. C. Tablet, I. Matei, S. Ionescu, „H-bond complexes of coumarin derivatives through induced circular dichroism”.

BIBLIOGRAFIE 1. Nina Berova, Prasad L. Polavarapu, Koji Nakanishi, Robert W. Woody, Eds. “Comprehensive Chiroptical Spectroscopy”,

JOHN WILEY & SONS, INC., New Jersey, 2012. 2. I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, J. Molec. Model. 18:4381–4387 (2012). 3. I. Matei, S. Ionescu, M. Hillebrand, Spectrochim. Acta A. 96 709–715 (2012). 4. S. Allenmark, Chirality 15 (2003) 409–422.

5. Nina Berova, Prasad L. Polavarapu, Koji Nakanishi, Robert W. Woody, Eds. “Comprehensive Chiroptical Spectroscopy”,

JOHN WILEY & SONS, INC., New Jersey, 2012. 6. S. Ionescu, I. Matei, C. Tablet, M. Hillebrand, Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (2013) 11604–11614. 7. Sorana Ionescu, Iulia Matei, Cristina Tablet and Mihaela Hillebrand, Curr. Drug Metab., 14 (2013) 474–490. 8. Marco Pistolozzi, Carlo Bertucci, Chirality 20, 552–558 (2008). 9. R. Sandu, C. Tablet, M. Hillebrand, J. Incl. Phenom. Macrocyclic Chem., 77 (2013) 183–193. 10. N. Berova, L. Di Bari and G. Pescitelli, Chem. Soc. Rev. 36 (2007) 914–931. 11. F. Zsila, H. Matsunaga, Z. Bikadi and J. Haginaka, Biochim. Biophys. Acta 1760 (2006) 1248–1273. 12. M. Kasha, H.R. Rawls, M. Ashraf El-Bayoumi, Pure Appl. Chem. 11 (1965) 371–392.

Director de proiect,

dr. Sorana Ionescu