Polimeri bioresorbabili.doc

8/14/2019 Polimeri bioresorbabili.doc

1/24

UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCURETI

FACULTATEA:STIINTA SI INGINERIA MATERIALELOR

POLIMERI BIORESORBABILI

STUDENT:VLEJU LIVIU GRUPA:1031 B

SPECIALIZARE:INGEINERIEMEDICALA

BUCURETI2010


2/24

CUPRINS

I COLAGENUL

1.CONSIDERAII GENERALE PRIVIND BIOCHIMIACOLAGENULUI.

2.E!TRAGEREA" CARACTERIZAREA" PROPRIET#ILE IUTILIZAREA COLAGENULUI NEDENATURAT TIP I PENTRUOBINEREA BIOMATERIALELOR$.

3. METODE DE ANALIZ#..................%.

3.1. M&'()& *+,-)& )& ++/-.%.3.2.M&'()& ,&'*((,-&...%.3.3.M&'()& 4-*((,-& .%.3..M&'()& 5-(/(6-& )& &7+/8+*& + 4+'*--/(* (/+6&-&9.

3.4.1. Degradarea enzimaticin vitro.9.3.4.2.Controlul microbiologic9.

3.4.3.Testarea biocompatibilitii cu celule endoteliale.9.

. OBINEREA I CARACTERIZAREA GELURILOR DECOLAGEN...10.

.1. E'*+6&*&+ (/+6&8/8- ;-5*-/+* '-, I )- ,-&/& )& 7-


3/24

.2.3.Caracterizarea mor%ologic..1.

>. CARACTERIZAREA BIOLOGIC# A MATRICILOR DECOLAGEN1?.

>.1. B-()&6*+)+5-/-'+'&+ in vitro1&.>.2. C('*(/8/ 4-*(5-(/(6- in vitro

19. >.3. B-((4,+'-5-/-'+'&+ 8&/8/& &)('&/-+/& in vitro.19.

II.A/'& 4+'&*-+/& 5-(*&(*5+5-/&

1.Chitosan..22.

2.Poli (-hidroxi acizi).22.

3.Poli (amino acizi).23.

A,/-+'--2.

3


4/24

INTRODUCEREDatorit biocompatibilitii i biodegradabilitii excelente, structurii bine

definite,caracteristicilor biologice i modului n care interacionea cuorganismul, colagenul repreint unul dintre cele mai utiliate biomateriale. !xtrassub form de soluie apoas sau gel, colagenul fibrilar tip " poate fi modelat ndiferite forme# dispoiti$e medicale, implanturi artificiale, suporturi pentru cedareamedicamentelor i sc%elete &scaffold' pentru regenerare tisular, cu rol important n

preent n medicin.

Desi colagenul este cel mai utiliat material,s(au testat,in calitate de polimeribioresorbabili,deri$ati proteici,polia%aride,poli&amina(acii',poli&$inil alcool',)(si *(poliesteri %omo(polimeri sau coplolimeri.

I.COLAGENUL

1.CONSIDERAII GENERALE PRIVIND BIOCHIMIACOLAGENULUI

+olagenul este principala protein structural din cele mai multe esuturiconuncti$e moi, laxe, semirigide i rigide &piele, oase, tendon, membrane baaleetc.', care asigur n principal integritate structural esuturilor.

-iosintea sa este un proces complex, a$nd loc n dou etape# intra( iextracelular# /ceasta ncepe n fibroblaste i se termin cu agregarea fibrilelor nfibre 0 componente ale matricei extracelulare &!+'. olimer natural, colagenuleste constituit din 2 de aminoacii, aranai n sec$ene caracteristice, ce formeao structur conformaional foarte complex, organiat pe patru ni$ele, numitestructuri primar, secundar, teriar i cuaternar.

n n preent au fost descoperite 29 tipuri de colagen. Dintre acestea,cunoscute i caracteriate pn n preent, cel mai utiliat ca biomaterial este(/+6&8/ '-, I. olecula de colagen tip " &tropocolagen' este un %eterotrimeralctuit din trei lanuri )(polipeptidice &dou identice 0 )1 i unul diferit 0 )2'rsucite mpreun de la dreapta spre stnga n urul unei axe comune, formnd%elixul triplu. 4ormarea acestuia necesit preena 5l6 n fiecare a treia poiie a

7


5/24

lanului, aceasta fiind singurul aminoacid ce poate intra n poiiile interne ale%elixului triplu datorit $olumului mic, determinat de singurul su atom de%idrogen. 4ormarea %elixului triplu este fa$oriat, de asemenea, de preena ro i86p n poiiile i : care, datorit rigiditii inelelor pirolidinice, impun restricii

pri$ind rotaia lanurilor. +onformaia de %elix triplu este stabiliat prin legturide %idrogen ntre lanurile constituente, cu participarea grupelor %idroxil ale 86p ia moleculelor de ap, precum i prin alte tipuri de fore# ;an der


6/24

4igura 1. Ci$ele structurale de extractie a colagenului din piele prin >!+C i

>!+D

T&(/(6--/& )& &'*+


7/24

poate fi un fluid puin $iscos, dar i un material foarte $iscos. Ea p8(ul ioelectricgelul de colagen separ fibrile i fibre, de$enind dispersie.

+apacitatea de combinare a colagenului cu aciii este determinat de numrulgrupelor baice, iar cea de combinare cu baele de numrul grupelor carboxilice.

Datorit grupelor baice i acide din catenele laterale ale lanurilor polipeptidice,colagenul este un polimer amfoter. F molecul de colagen conine aproximati$ 27grupe amin n resturile de liin, %idroxiliin i arginin i 23 grupe carboxil ncele ale aciilor aspartic i glutamic. 5rupele amid din lanul polipeptidic i%idroxil din catenele laterale au nsemntate redus n ceea ce pri$ete caracterulamfoter.

Fbinerea biomaterialelor pe ba de colagen pleac de la extracte de colagennedenaturat 0 geluri sau soluii 0 care se condiione prin modificri c%imice i

fiice, uscare liber sau liofiliare. entru pstrarea conformaiei de %elix triplu,procedeele de condiionare nu trebuie s utiliee o temperatur mai mare de 3+.

Gn procedeele elaborate pentru obinerea biomaterialelor pe ba de colagennedenaturat, operaii c%eie sunt considerate renaturarea, modificarea c%imic,compatibilitatea cu compui bioacti$i, uscarea sau condiionarea sub form final.

M&'()&/& )& *&'-8/+*&conduc la crearea de legturi c%imice suplimentarentre moleculele iHsau fibrilele de colagen, mrind stabilitatea mecanic i c%imici, n consecin, reducnd biodegradabilitatea.

Ieticularea c%imic const n reacia colagenului cu alde%ide, diiocianai,carboimide, acil(aide, compui poliepoxidici i polifenolici, care conduc laformarea de legturi ionice sau co$alente ntre molecule sau fibrile.

Dintre agenii de reticulare c%imic, alde%ida glutaric &/5' este cea maiutiliat datorit eficienei mari n ceea ce pri$ete stabiliarea biomaterialelorcolagenice. Ieticularea cu /5 implic reacii ale grupelor )(amin libere aleliinei sau %idroxiliinei din lanurile polipeptidice cu grupele alde%idice.

olifenolii au fost utiliai, sub form de tanini $egetali, pentru tanarea pieilor

animale de foarte mult timp. /cetia sunt buni ageni de reticluare datoritmultiplelor interaciuni cu proteinele, mrind astfel stabilitatea colagenului din%idrogeluri sau matrici spongioase.

Dup reticulare, gelurile de colagen pot fi condiionate prin procedeele deuscare, cele mai utiliate fiind liofiliarea i uscarea liber la temperaturi de cca2BJ+. Cici unul din procedee nu produce denaturarea extractelor.

A


8/24

Eiofiliarea este o te%nic de condiionare a$antaoas, care const n uscareaprobelor congelate prin sublimarea n $id a g%eei. rocesul de liofiliare agelurilorHsoluiilor de colagen are loc n dou etape# ng%eare rapid, urmat deuscare. rin uscare se ndeprtea la nceput apa liber, apoi cea legat de grupele

polare ale colagenului. Gn locul cristalelor de g%ea se formea pori, iar colagenulse renaturea n fibrile i fibre. -iomaterialele obinute sunt spongioase, senumesc matrici i au proprieti similare matricei extracelulare. -iomaterialele pe

ba de colagen au o $arietate de forme# %idrogeluri, membrane, matrici, fire,tuburi, compoite, obinute din extracte de colagen nedenaturat .

3. METODE DE ANALIZ#

entru geluri s(au utiliat metodele de caracteriare fiico(c%imic rapid iarpentru matrici metode termice, spectroscopia 4>("I i morfologice &densitate,absorbie de ap i microscopie electronic'.

3.1. M&'()& *+,-)& )& ++/-

etodele prin care s(a fcut o prim caracteriare a gelurilor de colagen aufost# substan uscat, cenu, aot total, substane grase i p8.

3.2.M&'()& ,&'*((,-&"dentificarea grupelor funcionale, e$idenierea structurii secundare i teriare

a colagenului i e$idenierea interaciunilor sale cu alte substane s(a efectuat prinspectroscopie 4>("I, folosind un aparat "I 4>("I cu sistem />I de reflexieK"" 5olden 5ate =ingle &Lasco', cu domeniul spectral cuprins ntre 2 i 7cm(1.

+antitile de doxiciclin i acid tanic cedate din geluri i matrici n soluiareceptoare s(au e$aluat cu un spectrofotometru cu fascicul dublu M;(;"= erNin(!lmer Eambda 2.

entru a e$idenia structura triplu %elicoidal a colagenului din gelul de

colagen fibrilar tip " s(a obinut spectrul de dicroism circular &D+' cu unspectropolarimetru Lasco L(O1, utilind o cu$ de cuar cu drumul optic de ,2cm, la o $ite de scanare a spectrului de B nmHmin n domeniul 2B(19B nm.

3.3.M&'()& 4-*((,-&"maginile de microscopie electronic de baleia &=!' au fost nregistrate

utilind un microscop electronic de baleia 8itac%i =(2C cu sonda !D cureoluie de pn la 7 nm &la 2B N;, n $id naintat n caul utilirii detectorului de

O


9/24

electroni secundari' i mrire de 1B 0 3 x &tensiuni de accelerare de la ,B N; la3 N;'.

entru analia probelor biologice s(au folosit microscoapele electronice detransmisie %ilips 21+ i %ilips 7.

3..M&'()& 5-(/(6-& )& &7+/8+*& + 4+'*--/(* (/+6&-&entru e$aluarea matricilor de colagen ca sisteme de cedare controlat s(au

utiliat degradarea enimatic in vitroi controlul microbiologic i s(a determinatbiocompatibilitatea cu celule endoteliale.

3.4.1. Degradarea enzimaticin vitroIeistena la digestie enimatic a matricilor de colagen a fost obinut cu o

colagena cu acti$itatea 12B MHmg n soluie tampon fosfat cu p8 A,7. +antitateareidual a fost exprimat n procente &gHg' fa de greutatea iniial a probei.

3.4.2.Controlul microbiologic

+ontrolul contaminrii microbiene a matricilor colagenice s(a realiat la =+!E" IFD4/I =IE, conform standardelor de control microbiologic&+FE"/ 0 5uidelines on icrobial Pualit6 anagement', prin inoculare pemedii de cultur specifice, urmat de efectuarea de subculturi i identificareamicroorganismelor patogene, prin# &a' metoda amprentrii pentru determinareanumrului total de microorganisme aerobe &C>5/' i a numrului total de fungi ile$uri &C>4E'@ &b' teste bioc%imice de confirmare pentru identificarea

microorganismelor patogene.

3.4.3.Testarea biocompatibilitii cu celule endoteliale

-iocompatibilitatea matricilor cu celule endoteliale s(a examinat cu unmicroscop CiNon ec%ipat cu epifluorescen i filtru 51(-, iar fotografiile cu ocamer digital =on6 D=+(=AB.

;iabilitatea celular a fost e$aluat prin utiliarea unei metode colorimetricecare are ca substrat bromur de 3(&7,B(dimetiltiaol(2(il'(2,B(difeniltetraoliu 0>> 0 care permite e$aluarea metabolismului oxidati$. >estul se citestespectrofluorimetric la BA nm.

+elulele crescute timp de o sptmn pe matricile de colagen secionate cuultramicrotonul au fost recolorate 3 min cu acetat de uranil i 3 min cu citrat de

plumb i examinate cu microscoapele electronice de transmisie %ilips 21+ i7.

9


10/24

. OBINEREA I CARACTERIZAREA GELURILOR DECOLAGEN

.1. E'*+6&*&+ (/+6&8/8- ;-5*-/+* '-, I )- ,-&/& )& 7-abelul 33. 5elurile din seriile "(; din care s(au obinut matrici de colagen idenumirile acestora

Denumirematrice

Denumire gel dincares(a obinut matricea

Denumirematrice

Denumire gel din cares(a obinut matricea

Probe martor

1


11/24

(/ +/(3 (- +(3Probe seria I Probe seria III

+D(- +D(3 +> 0 7/ +/(>7+D 0 .1B +D(53 +> 0 B/ +/(>B

+D 0 .2 +5(53(,2 +> 0 1/ +/(>1+D 0 .2B +5(53(,2B +> 0 2/ +/(>2+D 0 .3 +5(53(,3 Probe seria IV

Probe seria II +> 0 7- +-(>7+D(/ +/D +> 0 B- +-(>B+D(>7 +/D(>7 +> 0 1- +-(>1+D(>B +/D(>B +> 0 2- +-(>2+D(>1 +/D(>1 Probe seria V+D(>2 +/D(>2 +> 0 2- 0 27% +-(>2(27%

+> 0 2- retic 0 27% +-(>2(27%(retic

$.2.C+*+'&*-+*&+ ;--(=-4- - 4(*;(/(6- + 4+'*--/(* )& (/+6&(5


12/24

35 40 45 50 55 60 65Temperature/C

0

50

100

150

200

250

300

Flow/(ml/min)

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

0.2

DC/(m!/m")

. - - - - - - - - - - .

.

- .

.

.

.

.

20 30 40 50 60 0 80 +0Temperature/C

0

50

100

150

200

250

300

Flow/(ml/min)

-2.0

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

DC/( m!/m")

. - - - - - - - - - - .

.

- .

.

.

.

.

4igura 2. +urba D=+ pentrumatricea (/ imersat n ap

4igura 3. +urba D=+ pentrumatricea (- imersat n ap

/dugarea doxiciclinei are ca efect mrirea stabilitii %idrotermice, attpentru matricile obinute din geluri cu p8 acid ct i slab baic, ,2? doxiciclin

mrind temperatura de contracie a matricei (/ cu 1,Ao+, iar a matricei (- cu7,2o+.

Ieticularea colagenului cu alde%id glutaric produce stabiliarea moleculelorde colagen, ceea ce are ca efect creterea moderat a temperaturii de denaturare 0de la 72,2o+ pentru matricea nereticulat la 7,7o+ pentru cea reticulat cu ,2B?alde%id glutaric .

>emperaturile de contracie ale matricilor obinute din gelul de colagen ceconine doxiciclin +D(/ reticulat cu diferite cantiti de acid tanic cresc cu

mrirea concentraiei acestuia. ;alorile pentru matricile +D(>1 i +D(>2 suntapropiate# 7B,A i respecti$ 7B,Oo+, ceea ce arat c temperatura de contracie numai $aria peste 1? acid tanic, deci reticularea nu mai continu, n concordancu reultatele obinute din msurtori reologice.

=tabilitatea %idrotermic a matricilor de colagen poate fi deci mrit prinadugarea glutaralde%idei, doxiciclinei sau acidului tanic att n mediu acid ct islab baic.

D&'&*4-+*&+ '&4,&*+'8*-- )& '(,-*&" >t, a onei cristaline a colagenului s(a

efectuat prin D>/ R3BQ sau D=+ R29AQ n atmosfer inert, n domeniul detemperatur B 2Oo+. >emperatura de topire repreint o msur a trieilegturilor dintre lanurile cu conformaie de %elix triplu, pe cnd S8 este omsur a gradului de reticulare &proporiei de colagen reticulat'.

+urbele D=+ n atmosfer de aot pentru matricile (/ i (-, repreentaten figurile B1 i respecti$ B2, arat c la nclire progresi$ au loc 0 ntr(ade$r 0

12


13/24

dou tipuri de procese, i anume des%idratarea iniial, urmat de procesul detopire.

Dac ntre temperaturile de contracie ale matricilor obinute din geluri cu p8acid i slab baic nu exist practic diferene, temperatura de topire a colagenului

din prima matrice este cu cca 1o+ mai mic dect a celui din a doua, deciinteraciunile intermoleculare sunt mai puternice n mediu baic, gradul deordonare al onei cristaline a colagenului din matricile obinute din gel cu p8 slab

baic fiind mai mare dect al celui din matricile obinute din gel cu p8 acid&legturile dintre )(%elixuri sunt mai puternice n caul p8(ului slab baic'.

Diferene exist i n ceea ce pri$ete $aloarea entalpiei de topire, care estemai mic cu 7,2 LHg pentru (/ dect pentru (-. /ceasta se poate explica prindiferena de reticulare din faa cristalin, mai puternic n mediu baic.

50 100 150 200 250Temperature/C

-1.5

-1.0

-0.5

0.0

0.5

DC/(m!/m")

0

50

100

150

200

250

300

Flow/(ml/min)

- - - - - - - .

.

- .

.

- .

#1

#1

#1

50 100 150 200 250Temperature/C

-1.4

-1.2

-1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0.0

DC/(m!/m")

- - - - - - - .

.

.

- . - .

#1

4igura 7. +urba D=+ obinutpentru matricea

(/ n atmosfer de aot

4igura B. +urba D=+ obinutpentru matricea

(- n atmosfer de aot

Diferene exist i n ceea ce pri$ete $aloarea entalpiei de topire, care estemai mic cu 7,2 LHg pentru (/ dect pentru (-. /ceasta se poate explica prindiferena de reticulare din faa cristalin, mai puternic n mediu baic.

Ieticularea cu alde%id glutaric a matricilor ce conin doxiciclin producescderea temperaturii de topire comparati$ cu proba martor (-. Diferenele

pentru matricile reticulate sunt ns mici, aungnd la maximum ,Ao+, i se pot

datora omogenitii ce$a mai a$ansate a probelor reticulate cu /5.+eea ce diferenia matricile de colagen ce conin doxiciclin reticulate cualde%id glutaric este entalpia de topire. /ceasta scade cu creterea concentraieialde%idei glutarice pn la concentraia de ,2B? i crete apoi pentru ,3?. Dinaceste date reult c cel mai mare grad de reticulare este obinut n caulmatricilor reticulate cu ,2B? /5. este aceast concentraie /5 rmne,

probabil, nereacionat.13


14/24

>emperaturile i entalpiile de topire ale matricilor din seria "", care conindoxiciclin i sunt reticulate cu acid tanic, sunt foarte apropiate, ceea ce arat cgradul de ordonare nu crete sensibil cu mrirea concentraiei acidului. Diferenelesunt mici i n ceea ce pri$ete entalpiile de topire, deci nici gradul de retriculare

nu crete prea mult cu cantitatea de acid tanic.>emperaturile de topire ale matricilor reticulate cu acid tanic obinute din

geluri cu p8 slab baic sunt cu aproximati$ 1o+ mai mari dect ale celor obinutedin geluri cu p8 acid@ entalpiile de topire cele mai mari s(au nregistrat pentrumatricile mare conin doxiciclin, att cnd reticularea s(a efectuat cu alde%idglutaric, ct i cu acid tanic.

.2.Caracterizarea prin spectroscopie !T"#$

-enile de absorbie caracteristice colagenului sunt situate n figura B9 la

329A &amid /', 2931 &amid -', 132 &amid "', 1B7A &amid ""' i 127 cm (1

&amid """', $alori ce corespund, n mare msur, cu datele preentate pn acum nliteratura.

odificrile structurii colagenului se determin prin urmtoarele relaiisemicantitati$e#

( raportul /"""H/17B se corelea cu meninerea integritii structurii%elixului triplu, $aloarea trebuind s fie mai mare sau egal cu 1@

( raportul /"H// se corelea cu gradul de reticulare# cu ct raportul

/"H// este mai mare cu att gradul de reticulare este mai a$ansat@ R31Q( raportul /"H/"" se corelea cu gradul de %idroli@( diferena dintre frec$enele amid " i "", , d informaii despre

preena procesului de denaturare# T 1 cm(1 indic existena colagenului

denaturat.Ea adugarea doxiciclinei se formea legturi de %idrogen puternice ntre

grupele F8, banda amid / deplasndu(se de la 329A la 3292 cm(1. =tructura triplu%elicoidal rmne ns nemodificat, raportul /"""H/17Bfiind 1,1 pentru +D(-,

foarte apropiat de cel pentru matricea martor. Ui $aloarea SV este mai mic dect1, indicnd absena colagenului denaturat.

atricile de colagen din seria "" au fost reticulate cu acid tanic. /ciunea saasupra matricilor ce conin doxiciclin este pus n e$iden de $alorile

parametrilor "I caracteristici, care arat c acestea i pstrea structura triplu%elicoidal, $aloarea raportului /"""H/17Bobinut pentru matricea ce conine doar

17


15/24

doxiciclin fiind c%iar peste 1,2. SV are $alori cuprinse ntre O i OA cm (1, ceea censeamn c acidul tanic nu degradea colagenul.

Din rapoartele /"H// i /"H/""obinute pentru matricile din seriile """ i ";reult c la concentraia de 1? /> are loc formarea celor mai puternice legturi

de %idrogen i deci cea mai puternic reticulare, aa cum reult i din analieletermice.

.2.Caracterizarea mor%ologic

=tructura morfologic a matricilor de colage este important deoareceinfluenea %idrofilia, difuia medicamentului prin reea, proprietile dedegradare i interaciunea cu celulele. orfologia matricilor s(a determinat dinmsurtori de densitate i de absorbie de ap, iar forma i dimensiunea porilor prinmicroscopie electronic de baleia.

B.2.1. Densitatea matricilor de colagenatricile de colagen studiate au densitatea aparent cuprins ntre ,2 i ,3

gHcm3, $ariind cu concentraia colagenului i a componentelor care intr ncompoiia lor.

B.2.2. / bsorbia de apIeticularea cu alde%id glutaric reduce absorbia apei, cu att mai mult cu ct

gradul de reticulare este mai mare, cea mai mic absorbie preentnd nsmatricea ce conine ,2B? /5 i nu cea cu ,3?, n concordan cu reultatele

analielor termice i spectroscopice, care demonstrea c matricea +D(,2Bpreint gradul de reticulare cel mai mare.

Gn seria "", cea mai mic absorbie s(a nregistrat pentru matricea +D(>1,pentru care s(a obinut c reticularea este maxim i prin celelalte metode decaracteriare.

+omparnd $alorile absorbiei de ap pentru matricile martor (/ i (- ipentru cele corespuntoare cu doxiciclin &+D(/ i +D(-' se constat c celeobinute din geluri acide absoarb mai mult dect cele reultate din geluri slab

baice, primele pierndu(i totui integritatea dup maximum 7 ore. entru mristabilitatea, acestea trebuie reticulate.

atricile care conin 7 sau B? />, seria """, s(au deintegrat dup 3 ore, pecnd cele care conin 1 i 2? absorb rapid apa n prima or, lent n urmtoareledou ore, apoi aceasta practic ncetea, mai ales pentru cea cu 2? />. /ceasta

1B


16/24

absoarbe cu cca 1? mai mult ap dect cea cu 1? n primele ore, dup careambele aung la $aloare apropiat a gradului de umflare.

atricile din seria "; s(au deintegrat dup numai 3 ore de la imersarea nap.

B.2.3. icroscopia electronicatricile de colagen sunt structuri poroase cu dimensiuni ale porilor cuprinse

ntre B i 1B Wm, cu pori a$nd form, orientare i dimensiuni diferite.!fectul reticulrii colagenului i al interaciunii sale cu medicamentul

ncorporat asupra morfologiei matricei s(a in$estigat prin msurarea dimensiunilorporilor utilind microscopia electronic de baleia. "maginile s(au captat la puteride mrire diferite, n funcie de dimensiunile porilor i de ct de amnunit s(a dorita se ptrunde n structura matricei.

Gn figurile A2 i A3 sunt preentate imaginile =! obinute pentru matricile decolagen martor, (/ i (-, la mrirea de 1x.

4igura . "maginea =! obinutpentru

matricea (/, mrire x1

4igura A. "magine =! obinutpentru matricea (-, mrire x1

Dei concentraia colagenului este aceeai, matricile au structuri foartediferite, aa cum se poate $edea comparnd cele dou figuri# (/ are structurlamelar n ig(ag, cu pori alungii cu lungimi de pn la 3 Wm i limi demaximum 9 Wm, interconectai prin fibrile de colagen cu diametrul de ,3 Wm, pecnd (- are structur poroas relati$ regulat, cu pori inelari cu diametrul de A 29 Wm interconectai printr(o multitudine de fibre de colagen.

atricile reticulate cu /5 au structuri poroase asemntoare, cu macro( imicropori neuniformi i aglomerri de fibrile i fibre produse de reticularea cu /5.Dimensiunile porilor sunt de 1B B Wm, structurile de$enind mai dense cu

1


17/24

creterea concentraiei /5, cea mai dens structur a$nd +D(,2B, pentru carereticularea este maxim.

odificri fa de proba martor s(au obser$at i pentru matricile ce conindoxiciclin reticulate cu /> &seria "" 0 figura O'.

4igura O. "maginea =! a matricei +D(>1, mrire x1

"maginile =! ale acestora arat c dimensiunile porilor sunt mai uniforme

dect a celor anterioare, $ariind ntre 72 i 312 m. /cestea scad cu creterea

concentraiei /># sunt cuprinse ntre B i 312 Wm pentru matricea +D(>7, 72 i2 Wm pentru +D(>B, 33 i 1O Wm pentru +D(>1, respecti$ ntre O i 1O Wm

pentru +D(>2. atricea +D(>1, cu cel mai mare grad de reticulare, preint ceamai uniform structur.

+omparnd imaginile =! ale matricilor din seria """ i "; se obser$ cstructurile formate n mediu baic sunt mult mai dense dect n mediu acid,dimensiunile medii ale porilor fiind de (A ori mai mici n caul matriciei +>(1-dect n cel al matricei +>(1/.

>.CARACTERIZAREA BIOLOGIC# A MATRICILOR DE

COLAGEN

>estarea biologic in vitro a biomaterialelor pe ba de colagen simuleacondiiile fiiologice. entru e$aluarea matricilor de colagen studiate n te s(auefectuat teste in vitrode biodegradabilitate enimatic, control microbiologic i

biocompatibilitate cu celule endoteliale. atricile corespuntoare din punctul de$edere al analielor biologice pot fi testate n continuare in vivope animale.

1A


18/24

>.1. B-()&6*+)+5-/-'+'&+ in vitro

rin biodegradare se poate e$alua, de asemenea, gradul de reticulare,

colagenaa putnd cli$a doar lanurile principale ale colagenului, nu i legturileintermoleculare.

atricea martor (-, care nu conine doxiciclin, s(a degradat total n 3 ore.atricile nereticulat i reticulate cu alde%id glutaric care conin doxiciclin,degradate parial n 3 ore, i(au pierdut integritatea dup aproximati$ 7O de ore,reultnd o multitudine de fibre de colagen precipitate n soluia de colagena.surtorile cantitati$e ale colagenului digerat n 3 de ore din matricile obinutedin geluri cu p8 acid arat c cea martor s(a degradat n proporie de 97?, iar dup

72 de ore s(a degradat total. atricile care conin doxiciclin i /> s(au degradatmult mai puin comparati$ cu cele reticulate cu /5, procentele de colagendegradat fiind cuprise doar ntre 21? pentru +D(>2 i 32? pentru ceanereticulat. /cest lucru se datorea nu numai reticulrii cu />, ci i faptului catt /> ct i doxiciclina au proprietatea de a in%iba colagenaa.

F alt explicaie a degradrii foarte lente a matricilor care conin /> const nfaptul c la temperatura de 3A+, la care s(au efectuat determinrile, acestareticulea mult mai puternic dect la temperaturi scute.

atricile de colagen care conin acid tanic din seriile """ i "; dau reiduuricuprinse ntre 3B i OB? n timp de 3 de ore.

-iodegradabilitatea matricilor de colagen este dependent deci de gradul dereticulare i de msura n care substanele medicamentoase in%ib sau nuacti$itatea colagenaei.

Dup 3 de ore soluiile de colagena n care s(au introdus matricile imicorea p8(ul. /stfel, (/ i (-, care s(au degradat n cea mai mare msur,

preint o scdere la 7,7 i respecti$ B,7. Gn sc%imb, matricile din seria " i "",care conin doxiciclin, au $alori peste ,2, excepie fcnd +D(/, care are p8(ul

B,A3 i se degradea n proporie mai mare.entru regenerarea esuturilor se recomand matrici care n mediu fiiologic

produc un p8 ct mai apropiat de cel fiiologic 0 A,2(A,7, la acest p8 celulele careformea esutul &fibroblaste, c%eratinocite, endoteliale, osteoblaste etc.'de$oltndu(se normal. atricile care se ncadrea n aceste cerine sunt cele careaparin serie " i "".

1O


19/24

Ieultatele degradrii enimatice se corelea cu reultatele obinute pentrucedarea medicamentului, datorit probabil faptului c att cedarea ct i degradareas(au fcut n aceleai condiii# soluie de -=, p8 A,7 i 3Ao+, spre deosebire deabsorbiile de ap efectuate la temperatura camerei, n ap distilat cu p8 B,B.

>.2. C('*(/8/ 4-*(5-(/(6- in vitro

/sigurarea calitii microbiene pentru biomaterialele utiliate n medicin careintr n contact direct cu esutul are un rol crucial.

entru a $erifica proprietile antimicrobiene ale medicamente nglobate nmatricile de colagen obinute n cadrul teei s(a determinat numrul total degermeni aerobi, precum i de fungi i le$uri, exprimat ca M4+Hcm 2, care se

de$olt n matricile de colagen.=(a constatat c niciuna din matricile analiate nu de$olt P. aeruginosa,

ceea ce permite utiliarea acestora n tratamentele a numeroase infecii. Gn sc%imb,(/ i (- de$olt E. Colin aceeai msur &1 M4+Hcm2', pe cnd pentru S.aureus(- este suport mai XbunY, de$oltnd 3M4+Hcm2,spre deosebire de proba(/ pe care se de$olt 1 M4+Hcm2.

atricile din seria " nu permit de$oltarea germenilor aerobi pentru niciunadin bacteriile testate. >otui, pe matricea +D(- s(au de$oltat 1 M4+Hcm 2 fungi i

le$uri. +D(,2B este stabil din punct de $edere microbilogic, datorit alde%ideiglutarice, care uneori este utiliat i ca deinfectant.atricile din seria "" nu au de$oltat niciunul din microbii testai, datorit pe

de(o parte preenei acidului tanic i doxiciclinei, care sunt substaneantimicrobiene, i pe de alt parte p8(ului scut &3,O' la care s(au obinut.

Dintre matricile din seria """, niciuna nu a de$oltatE. coli, P. Aeruginosa,fungi sau le$uri. +>(2/ de$olt ns 1M4+Hcm2 S. Aureus ceea ce se poateexplica doar prin contaminarea n timpul preparrii sau al transportului matricilor.

atricile din seria "; i ; de$olt doar S. aureus, datorit p8(ului ridicat

&A,7', care pemite de$oltarea bacteriilor.Gn concluie, pentru testarea pe celule umane se recomand matrici ce conin

doxiciclin, att din seria " ct i din seria "".

>.3. B-((4,+'-5-/-'+'&+ 8 &/8/& &)('&/-+/& in vitro

19


20/24

atricile de colagen acionea ca suporturi care facilitea de$oltareaesutului leat datorit proprietilor sale biologice. Gn plus, cele care acionea career$or pentru cedare de medicamente sunt utiliate n tratamentul i profilaxiaesutului infectat.

+elulele endoteliale constituie tipul celular maor pentru $asculariareaesutului nou format n procesul de $indecare. odul n care acestea rspund unui

biomaterial este de mare importan n utiliarea sa ulterioar. =e tie cneo$asculariaia este un pas important n $indecarea rnilor, repreentnd totodatun proces definitoriu n reuita regenerrii tisulare.

Dimensiunile porilor matricilor de colagen $aria ntre 33 i 7 m, ceea ce

0 teoretic 0 permite ptrunderea celulelor endoteliale n pori, acestea din urm

a$nd dimensiunile curinse ntre B i A m.

Gn te s(a studiat biocompatibilitatea in vitro a celulelor endoteliale cumatricile poroase de colagen care corespund din punct de $edere microbiologic#din seriile " i "", precum i matricile martor (/ i (-.

!$aluarea in vitro a biocompatibilitii matricilor studiate cu celuleleendoteliale umane &linia stabiliat !/ %6 92' a artat c att cele nereticulate&(/, (-, +D(/ i +D(-' ct i cele reticulate cu /> &+D(>7, +D(>B i +D(>1' s(au deintegrat n mediul de cultur, deci nu li s(a putut nregistracoloniarea. >otui, niciuna nu a preentat efect citotoxic.

atricile +D(,1B +D(,3 i +D(>1 i(au pstrat integritatea n mediulde cultur. De remarcat c stabilitatea acestora n mediul de cultur este nconcordan cu stabilitatea termic, enimatic i absorbia de ap.

"maginile obinute prin microscopie de fluorescen n contrast de fa icoloraiile 8oec%st ale celulelor endoteliale coloniate pe matricile de colagen dinseria " i +D(>1 arat c acestea au permis popularea i migrarea celulelorendoteliale, datorit structurii poroase i porilor interconectai, formnd astfelsuporturi pentru regenerarea tisular.

Gn ceea ce pri$ete $iabilitatea celular, nu sunt diferene semnificati$e ntrecelulele endoteliale culti$ate pe matricile supuse testrii. >otui, procentul cele maimare de $iabilitate s(a nregistrat pentru +D(,2B &OO?' i +D(>1 &O2?', iar celmai mic pentru +D(,3 &A2?'.

+elulele endoteliale culti$ate timp de o sptmn pe matrici de colagen s(auanaliat din punct de $edere ultrastructural, iar imaginile >! obinute sunt

preentate n figura 9.2


21/24

4igura 9. "magini >! ale unor celule endoteliale crescute pe matricile decolagen#

a' +D(,1B@ b' +D(,2@ c' +D(,2B i d' +D(,3 i e' +D(>1Cc 0 nucleu, ; 0 $acuole, I!I 0 reticul endoplasmatic rugos, t 0mitocondrii

=cala# a' 3.92 Zm@ b' 2,3O Zm@ c' 1, Zm@ d' 3,92 Zm@ e' 2,B3 Zm+elule endoteliale cu aspect normal de$olt matricile +D(,2B i +D(>1,

care sunt biocompatibile i nu preint efect citotoxic. atricile +D(,1B, +D(,2i +D(,3, cu toate c au fost coloniate &sunt biocompatibile', celulele preint lani$el ultrastructural $acuole, ceea ce denot c cele trei matrici au totui un uorefect toxic@ cele mai multe $acuole apar la matricea +D(,3, datorit probabil, /5rmase nereacionat n timpul reticulrii.

atricile de colagen studiate n te i selectate n urma analielor fiico(c%imice i biologice ndeplinesc toate aceste condiii, fiind recomandate pentrutestarea in vivo.

21


22/24

II.A/'& 4+'&*-+/& 5-(*&(*5+5-/&

1.Chitosan

+%itosanul este o polia%arid biosintetic care este deri$at de c%itin. +%itineste o polia%arid care apar n mod natural, care pot fi extrase din exosc%eletelecrustacerilor sau generate prin procese de fermentaie fungice. +%itosanul este o(1 ,7(polimer * legate de a 2(amino(2(deoxi(D(gluco@ i desfoar astfel o sarcin

poiti$ de la grupurile amine. Iata de biodegradare al polimerului estedeterminat de cantitatea de coninut de acetil reidual, un parametru care poate fiuor $ariat. modifi cationi c%imice de c%itosan produce materiale cu o $arietate de

proprieti fiice i mecanice . Iata de biodegradare al polimerului estedeterminat de cantitatea de coninut de acetil reidual, un parametru care poate fiuor $ariat. odificare c%imica a cationilor de c%itosan produce materiale cu o

$arietate de proprieti fiice i mecanice.De exemplu, filme c%itosan i a fibrelor pot fi formate folosindlegaturi bioc%imice, adaptate te%nici pentru modificarea de la alte polia%aride,cum ar fi tratamentul amilo cu epiclor%idrin. +um ar fi acidul %ialuronic,c%itosan nu este antigenice i este bine tolerat ca material implatant. +%itosanul afost format n membranele i matrici potri$ite pentru esut pentru mai multeaplicaii de inginerie precum i conducte de regenerare a ner$ilor g%idat.anipularea matricelor de c%itosanl poate fi realiat folosind electrostatic

proprietatilor ale moleculei. Ea concentratie ionica redusa , lanturile de c%itosansunt extinse prin intermediul interaciunea electrostatice ntre amine. Fdata cucresterea puteri ionice, distant dintre lant(lant este diminuata, ca urmare a creteriin ona de onciune i rigiditate a reultatului matrice, n medie, dimensiunea

porilor este crescuta. 5elurile c%itosan, pulberi, filme, i fibre au fost formate itestate pentru aplicaii cum ar fi de ncapsulare, membrana bariere, materialelentilelor de contact, cultura de celule, i in%ibitori ai coagulari sngelui.

2.P(/- =-)*(- +--

"n stare natural, %idroxi acii, cum ar fi glicolic, acid lactic, au fost utiliate

pentru a sintetia o serie de polimeri biodegradabili utile pentru o $arietate deaplicatii de produse medicale. +a un exemplu, suturi c%irurgicale bioresorbablerealiate din poli &a(%idroxi acii' au fost n utiliarea clinic din 19A. /ltedispoiti$e implantabile din aceste polimeri &de exemplu, dispoiti$e de fixareinterne pentru repararea ortopedice' de$in parte a protocolului c%irurgicalestandard.Eegatura esterica de poli&%6droxi acidi' sunt despicate prin %idroli,ceea ce duce la o scdere n polimer a greutati moleculare &dar nu i de mas' aimplantului. /ceast degradare iniial are loc pn la greutate molecular care

22


23/24

este mai mic de B Da, moment n care are loc degradarea celular. Degradarefinal i resorbtia a implanturilor de poli&%idroxi(acii' implica implic celuleinflamatorii &cum ar fi macrofage, limfocite i neutrofile'. Dei acest stadiu rspunstardi$ inflamator poate a$ea un efect duntor asupra unor e$enimente de$indecare, aceste polimeri au fost folositii cu succes ca matrice pentru transplant decelule si regenerarea tesuturilor. Iata de degradare a acestor polimeri estedeterminat de greutate molecular iniial, suprafaa expus, cristalinitatea, i &ncaul de copolimeri' raportul dintre monomeri %idroxi acii.

olimeri poli &%idroxi acid' au o gam modest de proprietatimecanice i o gam modest corespuntor condiiilor de prelucrare. +u toateacestea, aceste materiale termoplastice pot fi, n general, format n filme, tuburi, imatrici folosind astfel de te%nici de prelucrare standard, astfel cum laminat,extrudare, turnare de sol$ent, i spin turnare. olimeri poli &%idroxi acid', deasemenea, au fost combinate cu alte materiale, de exemplu, poli &etilen glicol',

pentru a modifica rspunsul celular determinat de implant i degradarea produselorsale.

3.P(/- +4-( +--

Deoarece proteinele sunt compuse din aminoacii, muli cercettori auncercat s de$olte polimeri sintetici deri$ate din aminoacii pentru a ser$i camodele pentru, biologice, imunologice i studii structurale. Gn plus, multe tipuridiferite de poli &aminoacii' au fost in$estigate pentru utiliarea n aplicaii

biomedicale. oli &amino acii' sunt de obicei pregtite ci polimeriare in inel de

desc%idere a C(carboxi an%idridele corespuntoare care sunt obinute prin reaciade aminoacii cu fosgen.

oli &aminoacii' au un potenial mai multe a$antae ca biomateriale.Mn numr mare de polimeri i copolimeri pot fi preparate dintr(o $arietate deaminoacii. Eanurile de pe partea laterala ofera locuri pentru fixarea de peptidemici, medicamente, ageni de reticulare, sau grupuri de nereol$at, care pot fifolosite pentru a modifica proprietile fiico(mecanice ale polimerului.Deoareceacesti polimeri elibereaa aminoaciii este probabil ca procesul de degradare sdemonstree un ni$el scut de toxicitate sistemic. oli &aminoacii' au fost

in$estigate ca material de sutura, ca nlocuitori de piele artificial, i ca sisteme deli$rare de droguri.

23


24/24

F-68*+ 1# /cesta este un exemplu pentru un grup de,amino(acid deri$at din polimeri.

APLICATII

+olagenul poate fi folosit ntr(o di$ersitate de forme# soluii inectabile ncorpul $itros al oc%iului i sub derm, pudr cu aciune %emostatic, fibre nmateriale de sutur i protee de $al$e ale inimii, filme n reparaii c%irurgicale,

burei pentru implanturi dermice, forme tubulare pentru protee $asculare saureconstrucii de organe &esofag, tra%ee'.

5elurile c%itosan, pulberi, filme, i fibre au fost formate i testate pentruaplicaii cum ar fi de ncapsulare, membrana bariere, materiale lentilelor de

contact, cultura de celule, i in%ibitori ai coagulari sngelui.oli &)(%idroxi acii' sunt folositi ca suturi c%irurgicale bioresorbable .oli &amino acii' au fost in$estigate ca material de sutura, ca nlocuitori de

piele artificial, i ca sisteme de li$rare de droguri.

27

Polimeri bioresorbabili.doc

Documents

Transcript of Polimeri bioresorbabili.doc