7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

1/7

Metode de testare a imunitatii

Explorarea functiei imunitare permite aprecierea raspunsului imun normalcare apare in cursul bolilor infectioase si a devierilor mecanismelor imunitare.Reactiile serologice permit detectarea anticorpilor sau aprecierea titrului

acestora.

Metode de testare a imunitatiiSunt reactii Ag-Ac si pot fi grupate in:1. Reactii de agregare- Aglutinare

- Precipitare2. Reactii in care intervine Complementul3. Reactii de neutralizare4. Reactii de marcare prin artificii tehnice:

- Imunofluorescenta IF- Marcarea enzimatica ELISA

- testarea radioimuna RIAReactia de aglutinare

Aglutinarea bacterianaEste o reactie Ag-Ac de agregare, in care Ag-nul este reprezentat de celulebacteriene sau fragmente de celule bacteriene in suspensie.( Ag particulat)Sub actiunea anticorpilor specifici, complexele imune Ag-Ac, formeaza reteletridimensionale in prezenta unor electroliti din mediu si in anumite conditii detemperatura si ph, constituind agregate vizibile. Reactia de aglutinare sefoloseste pentru identificarea unor bacterii sau a unor Ac. din serul bolnavilor.

Reactia de aglutinare1. Aglutinarea pe lamaSe foloseste in diagnosticul bacteriologic pentru identificarea rapida a unortulpini bacteriene izolate din produsul patologic.Pe o lama microscopica degresata se pune o picatura de ser imun si alaturi opicatura de ser fiziologic. Din cultura bacteriana pe geloza simpla se ia cuansa o cantitate mica si se se suspenda omogen in serul imun, apoi se repetain serul fiziologic.In cazul unei corespondente Ag-Ac in serul imun vor aparea grunji fini vizibilicu ochiul liber. In serul fiziologic germenul raman in suspensie omogena. Aglpe lama este o reactie calitativa. Pentru confirmare se face aglutinare in

tuburi.Reactia de aglutinare

2. Aglutinarea in tuburiSe efectueaza in 6 tuburi in care se fac dilutii crescande din serulde cercetat sau din serul imun standard.Principiul reactiei

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

2/7

La dilutii crescande de ser se adauga cantitati egale de Ag. Titrul reactiei estedat de dilutia cea mai mare in care se mai observa aglutinare.Reactia de aglutinareIn aglutinarea bacteriana se observa doua tipuri de aglutinare:

Aglutinare somatica sau O

Aglutinare ciliara sau HAglutinarea O este data de Ag-ul O somatic din peretele bacterian( endotoxina). Este un antigen de natura glucidopolipeptidica, termostabil,alcoolorezistent, distrus de formol.Aglutinarea O se evidentiaza sub forma de grunji fini care nu disociaza la oagitare brusca.Apare lent incubare la 52o C, 2 ore si 20 de h la temp. camerei.Este o agl. polara, bacteriile se unesc cap la cap.

Aglutinarea H-Flagelara, este data de Ag-ul H, prezent la bacteriile mobile.

Ag-ul H este de natura proteica, termolabil, distrus de alcool, rezistent laformol.-Apare sub forma unor flocoane care formeaza un sediment abundent si lax,care dispare la agitare.-apare dupa o incubare de 2h la 52oC sau 20 de h la 37oC. In cursul eibacteriile se unesc prin flageli.Aplicatii-identificarea unor bacterii izolate din produsul patologic: se identificaspeciile si tipurile de Salmonella, Shigella, Escherichia coli, Streptococ, etc.- diagnosticul serologic al unor infectii prin evidentiarea anticorpilor in serulbolnavului.

Ex R. Widal-in febra tifoidaR. Wright-in brucelozaR. Weil-Felix-in tifosul exantematic

Reactii de aglutinare pasiva sau aglutinare pe suportSe utilizeaza atunci cand antigenul este o solutie moleculara. In urma fixariipe un suport particulat, acesta devine aglutinabil in prezenta serului imun.Prin aceste reactii se pot identifica atat antigenle cat si anticorpii.Prticulele inerte folosite sunt: latexul, polistirenul, hematiile.

AplicatiiReactii de agl. pasiva in care Ag-ul este adsorbit pe particule de latex,

polistirenEvidentierea factorului reumatoid: particulele de latex acoperite cu IgGnormale sunt aglutinate de serurile pacientilor care contin FR( IgM care aparfata de IgG proprii).Reactia este poz. in artrita reumatoida,reactia estenegativa in RAA si in poliartrita cr.Evidentierea meningococului, pneumococului si a haemophilusului in l.c.r.

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

3/7

Aglutinarea pasiva in care Ag-ul este adsorbit pe hematii se aplica indiagnosticul tiroiditei autoimune, in poliartrita reumatoida ( testul WaalerRose), in evid. ac,. anti- toxoci.

Reactii de precipitare

Precipitarea este o reactie Ag-Ac de agregare in care Ag-ul este reprezentatde macromolecule in sol. coloidala. Punerea in contact a Ag-ului cu Ac-ulcorespunzator duce la formarea de complexe Ag-Ac care precipita atuncicand elementele aflate in reactie sunt in proportie optima.Tehnici1. Precipitarea inelaraAntigenul si serul imun sunt puse in contact in tuburi cu diametrul mic, astfelca ele sa nu se amestece ci sa formeze o interfata de contact la nivelul careiaprin creerea unei zone de concentratie optima de Ac-Ag, sa apara un inel deprecipitare. Reactia poate evidentia cantitati mici de Ag si se utilizeaza in:Precipitarea inelara

-industria alimentara- pentru detectia originii carniiIn medicina legala pentru identificarea petelor de sangeIn diagnosticul bolilor infectioase: Reactia Ascoli- in dg. retrospectiv alinfectiei cu bacilul carbunos. Ag-ul carbunos rezista in timp si la temperaturicrescute. Reactia consta in punerea in contact, a serului anticarbunos cuantigenul extras la caldura din fragmentele de organe, in tuburi capilareastfel ca cele doua lichide sa nu se amestece. La interfata de contact dintreele va aparea un inel de precipitare opalescent.

Precipitarea inelaraReactia Vincent-Bellot

Se foloseste in dg. meningitei meningococice : in l.c.r. se gaseste Ag-ul siacesta se pune in contact cu serul antimeningococic astfel ca intere ele sa seproduca o interfata de contact, nivel la care se observa aparitia unui inel deprecipitare opalescent.Identificarea grupului de streptococ: se extrage carbohidratul C dinperetele celular si se pune in contact cu serurile de grup A, B, C, D, F, G sireactia pozitiva identifica grupul de streptococ.Reactii de precipitare2. Reactii de floculareFlocularea este o reactie in care precipitarea apare prin amestecul Ag-lui cuserul imun in toata masa amestecului, sub forma de flocoane.

Reactia se utilizeaza pentru titrarea toxinelor bacteriene si a serurilorantitoxice pornindu-se de la observatia ca flocularea apare prima data ineprubeta in care exista o proportie optima intre Ag si AcReactia de precipitare Ramon este prototipul reactiilor de floculare.Prin aceasta reactie se poate determina titrul anticorpilor antidifterici in serulpacientului, flosind ca Ag toxina, sau se poate titra toxina folosind serantidifteric.Reactii de precipitare

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

4/7

3. Precipitarea in gelEste o reactie de mare sensibilitate si specificitateSe foloseste gel de agar ca mediu in care difuzeaza Ag si Ac, la locul lor deintalnire se formeaza zone de precipitare vizibile in gelul transparent.A. Difuzia simpla

Difuzeaza doar un reactant, celalalt fiind incorporat in gel.Exemple:Metoda difuziei radiale Mancini se foloseste la det. cantitativa a unor fractiuniproteice cum ar fi IgG, IgM, IgA ( imunograma)sau C3 , transferina.imunogramaImunoplacile se folosesc la determinarea cantitatii de imunglobuline in ser.Ele au inglobata in gel antiimunglobulina care trebuie determinata. In godeulcentral se pune ser de referinta iar in godeurile periferice se pun serurilepacientilor. Se incubeaza 4h la 370C si se masoara diametrul fiecarui inel deprecipitare. Printr-un calcul matematic se stabileste cantitatea de Igcontinuta in ser.

B. Difuzia dublaAmbii reactanti difuzeaza si formeaza linii de precipitare la locul de intalnire.Metoda Ouchterlony: pe o placa de sticla se toarna geloza 1% iar dupasolidificare se fac godeuri.In godeul central se pune ser imun(Ac). In godeurile periferice se pun diferiteAg. Daca exista corespondenta Ag-Ac apar linii de precipitare dupa incubareaplacii .Prin aceasta metoda putem identifica bacterii, virusuri, proteine patologice.Testul ElekEste un tip particular de dubla difuzie prin care se identifica tulpinile toxigene

de bacil difteric.Testul se face in placi Petri in care este turnat mediu de cultura. In centrulplacii pe intreg diametrul ei se scobeste un sant in care se introduce serantitoxic 100UI/ml. Perpendicular pe acest sant se insamanteaza tulpina debacil difteric pe care o testam, tulpina de bacil difteric toxigena ( martorpozitiv), tulpina de bacil difteric netoxigena ( martor negativ). Se incubeazaplaca la 370C 18 h si apoi se interpreteaza: Aparitia unei linii de precipitate inbisectoare unghiului format de tulpina de testat si santul cu serul antidifteric=tulpina toxigena.Dubla difuzie1.martor pozitiv

2. martor negativ3.tulpina netoxigena4. tulpina toxigena

Reactii de precipitareC. Difuzia in camp electric( IEF)Imunoelectroforeza este o metoda care asociaza principiul electroforezei cuprincipiul difuziunii in gel. In primul timp are loc separarea antigenelor

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

5/7

componente din antigenul complex. In al doilea timp se adauga un ser imuncorespunzator si se lasa sa reactioneze in dubla difuzie cu antigeneleseparate. Cand se intalnesc Ag si Ac coresp. apar arcuri de precipitatecaracteristice.Difuzia in camp electric

Contraimunelectroforeza( CIEL)Datorita incarcaturii electrice diferite, Ag si Ac migreaza in sens opus intr-uncamp electric si la locul de intalnire cu Ac-ul corespunzator se produce in gelo linie de precipitare.Metoda se foloseste pentru detectarea unor Ag bacteriene sau a Ac-lor dinserul pacientilor.

Reactii Ag-Ac cu participarea complementuluiComplementul este un factor esential al rezistentei naturale si alhomeostaziei imunologice naturale.Este constituit din 12 componente macromoleculare care sunt prezente

natural in umorile organismului intr-un stadiu inactiv ( molecule precursoare).Participarea complementului in reactiile imune este caracterizata princapacitatea lui de-a induce liza bacteriilor sensibilizate de Ac. ( bacteriolizasau imunohemoliza).Complementul este principalul sistem de amplificare a reactiilor Ag-AC.Efectul bactericid al complementuluiIn prezenta Ac , complementul poate determina efect bactericid asupra unorbacterii gram -.Acest fenomen se poate demonstra in vivo si in vitro.

Fenomenul de imunhemoliza

In prezenta Ac-lor specifici antihematie ( hemolizina sau serul hemolitic) si aComplementului, hematiile sunt lizate=fenomenul de hemoliza imuna sta labaza determinarii activitatii Complementului prezent in ser, plasma si lichideextravasculare.

In titratarea activitatii hemolitice a Complementului se ia in calcul dilutia ceamai mare de C care lizeaza 50% din hematii in prezenta unei cantitati optimede Ac. Antihematie. Aceasta este doza hemolitica: DH 50%.Imunoliza este indicator in reactia RFCReactia de fixare a complementuluiDaca reactia Ag-Ac are loc in prezenta C acesta se fixeaza doar pe complexul

imun format si se consuma in timpul reactiei, dispare din reactie, iar in tub nuapar modificari vizibile.Fixarea C pe sistemul Ag-Ac poate fi indirect evidentiata prin fenomenul deimunhemoliza folosind sistemul hemolitic ca indicator.Reactia de fixare a Compl. ( RFC)In reactia de fixare a C ( RFC ) intra doua sisteme:1. Sistemul care este format din Ac si Ag dintre care unul este cunoscut iarcelalalt trebuie identificat

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

6/7

2. Sistemul hemolitic cu rol de sistem indicator al fixarii C pe sistemul Ag-Ac (de fapt al activarii si consumului de C). Acest sistem este format din hematiide oaie si Ac omolog, hemolizina.Intre cele doua sisteme oscileaza complementul.Reactia de fixare a C ( RFC

Daca C se fixeaza pe complexul Ag-Ac, nu apar modificari vizibile inamastecul de reactie, care ramane tulbure.Daca reactia este negativa, fixarea C se face pe al doilea sistem ( celhemolitic) si duce la liza hematiilor cu eliberarea Hb si limpezireaamestecului.Timpii reactiei RFC1 Se pune in reactie serul de cercetat2 Se adauga Ag-ul cunoscut3. Se adauga ComplementulSe incubeaza la 370C, o ora, si 20 de ore la 40C4. Se adauga sistemul hemolitic

Se incubeaza o ora la 37oCCitire: Reactia este pozitiva in absenta hemolizeiReactia este negativa daca apare hemoliza.

Materiale necesareA. Serul de bolnav inactivat 30 la 560C pentru distrugerea C propriu sauseruri standard pentru identificare de Ag.B. Ag cunoscut sau de cercetat: (suspensii bacteriene, virale).C. Complementul din ser de cobai ( cantitatea care se foloseste se stabilesteprin titratarea C la fiecare RFC).Tehnici1. Tehnica Wasserman

RFC in tuburi, este o reactie calitativa. Nu da titrul de Ac, stabileste daca inserul de cercetat sunt Ac anti Treponema palidum.Hemoliza = R. negativaAmestec tulbure= R. pozitivaRFC2. tehnica Ida- BengstonEste o reactie calitativa care stabileste titrul Ac-lor din serul pacientului. Seface in eprubete in care se realizeaza dilutii ale serului la care se adauga Agsi C iar apoi sistemul hemolitic. Se lucreaza cu seruri pereche recoltate ladebutul bolii si in convalescenta. Titrul trebuie sa creasca de 4 ori intre celedoua seruri pentru ca reactia sa fie considerata pozitiva.

Tehnica Ida- BengstonSe foloseste pentru diagnosticul infectiei cu:LeptospiraRickettsiaClamydiaTehnica KolmerEste o reactie de fixare a complementului la rece

7/28/2019 Metode de Testare a Imunitatii

7/7

Avantajul metodei consta in faptul ca are o sensibilitate crescuta, unirea Ag-lui cu Ac-ul este favorizata de temperatura de 40C .Este o reactie cantitativa in care dilutiile de ser de bolnav puse in contact cuAg-ul si Complementul se incubeaza la 40C timp de 20 h, apoi se adaugasistemul hemolitic. Urmeaza o incubare de 1h la 37oC si citirea.

Tehnica Breadstreet- TaylorSe face in diagnosticul infectiilor virale, in infectia cu Mycoplasma, si in febraQIn aceasta reactie se face o titrare speciala a Complementului = in tabla desah, in placi cu godeuri. Incubarea se face la rece.