http://www.biodyn.ro/html/main_projects.html

Dezvoltate inventie “Metoda de masura rapida de inalta precizie a impedantei in curent alternativ sinusoidal” la managementul

punctelor critice in industria laptelui

Prezentare generala

La ora actuala se acorda o importanta deosebita controlului calitatii si

sigurantei produselor alimentare, intre acestea, laptele, produs de baza mai ales

in alimentatia copiilor, ocupand un loc aparte.

Calitatea si falsificarea laptelui creaza la ora actuala probleme semnificative

pentru industria de profil si implicit pentru consumatori si societate. Efectele se

concretizeaza in pierderi economice, alterari ale calitatii si proprietatilor

organoleptice ale produsului final si, nu in ultimul rand, constituie factori de risc

pentru sanatatea consumatorului.

In acest context, obiectivul principal al acestui proiect il reprezinta dezvoltarea

inventiei ”Metoda de masura rapida de inalta precizie a impedantei in curent alternativ sinusoidal” pentru realizarea unui sistem analitic de masura,

pentru estimarea rapida a calitatii din punct de vedere sanitar a laptelui prin

detectia eventualelor microorganisme patogene de tip Escherichia coli sau

Salmonella, datorita tulburarilor digestive importante pe care acestea le pot

produce in cazul multor consumatori.

Metoda dezvoltata are la baza utilizarea tehnicilor specifice Spectroscopiei de

Impedanta Electrochimice (EIS) in conjunctie cu reactiile de recunoastere

biospecifica (ex. antigen-anticorp) si va permite evidentierea patogenilor de

interes, direct, prin monitorizarea dinamicii de cuplare a acestora la nivelul unor

traductori activi, cu depunere de material biologic cu specificitate ridicata fata de

patogenii urmariti.

1

Aplicabilitatea metodei nu este limitata la detectia celulelor, prin utilizarea de

traductori specifici ea putand fi extinsa la practic toate substantele capabile sa

determine un raspuns imun. Mai mult, dezvoltari recente de tipul aptamerilor si al

MIP-urilor (Molecular Imprinted polimers) fac ca gama de analize posibile sa fie

practic nelimitata.

Combinand avantajele celor doua tehnici, rapiditate, posibilitatea

automatizarii, sensibilitate si specificitate ridicata, dezvoltarea inventiei

propuse in cadrul acestui proiect reprezinta o alternativa viabila la metodele

curent utilizate in laboratoarele de control biochimic si microbiologic si in

managementul punctelor critice din industria laptelui.

Astfel, in cadrul acestui proiect s-a dezvoltat o metoda noua de detectie a

calitatii, aplicabile in industria laptelui, metoda ce combina cele mai noi

descoperiri in domeniul senzorilor biomimetici (bistraturi polimerice si

functionalizate, retele de imuno-senzori) cu caracteristicile uneia dintre cele mai

versatile tehnici de analiza existente la ora actuala: spectroscopia de impedanta

(electrochimica). Metoda ofera ca si avantaje: neinvazivitate, posibilitatea

automatizarii, specificitate si sensibilitate ridicate, ca si timp de raspuns scurt.

Spectroscopia de impedanta implica masurarea parametrilor electrici

(amplitudine si faza) ai materialului studiat intr-un domeniu optim ales de

frecvente. Prin procesarea datelor masurate, pe baza unor modele echivalente,

se poate extrage informatia cu privire la proprietatile electrice ale sistemului

analizat. Aplicabilitatea tehnicii pentru determinarile propuse rezida in

posibilitatea evidentierii si caracterizarii neomogenitatilor si interfetelor in sistem,

permitand astfel caracterizarea reactiilor de cuplare specifica intre analitii tinta si

compusul bioactiv depus la suprafata senzorilor de masura (prin monitorizarea

variatiilor pe care le sufera impedanta de interfata in timpul acestui proces).

Dezvoltarea inventiei a vizat aspectele particulare legate de posibilitatea

realizarii unor masuratori de mare precizie (abordandu-se un aranjament

diferential, controlul si monitorizarea temperaturii) dar si de stabilirea domeniul

optim de frecvente utile in detectie si a altor parametri ai semnalului electric

aplicat: offset, amplitudine. Problema senzorilor a fost abordata atat prin prisma

2

geometriei, materialului si functionalizarii cat si a compatibilitatii cu microfluidica

necesara analizelor in flux.

Combinarea masuratorilor de impedanta cu metodele de recunoastere bioafina

pentru evaluarea contaminarii laptelui suscita un interes deosebit prin avantajele

pe care le ofera: tehnologie alternativa ieftina, ce nu necesita o pregatire

anterioara a probei, volume mari de proba sau cunostinte speciale de laborator

pentru cei ce o folosesc, ca si posibilitatea realizarii de analize multiple (retea de

senzori modificati acoperiti cu compusi diversi de recunoastere specifica, functie

de tipul de analit urmarit – microorganisme patogene).

Realizarea cu succes a obiectivelor acestui proiect a fost sustinuta si de

atragerea competentelor internationale angrenate in desfasurarea unor proiecte

comune, precum si de participarea intr-un consortiu international in cadrul unui

proiect European Nr. GRD 1 – 2000 – 25801 ce vizeaza analiza produselor

alimentare

Metoda si dispozitivul de masura ce urmeaza a fi realizate pe baza brevetului

”Metoda de masura rapida de inalta precizie a impedantei in curent alternativ sinusoidal” permit automatizarea si standardizarea controlului calitatii

produselor lactate, conducand la eliminarea factorilor de risc si introducerea de

tehnologii ecologice, pentru aplicarea standardelor de calitate.

Potentiali utilizatori ai rezultatelor cercetarilor din cadrul acestui proiect pot fi:

• -Agenti economici care comercializeaza produse lactate;

• -Laboratoarele abilitate de control al calitatii produselor alimentare;

• -Agentiile de protectie a consumatorului;

• -Centre si laboratoare de cercetare de profil.

Mai mult, testarea metodei dezvoltate s-a facut in stransa colaborare cu Institutul de

Sanatate Publica, Igiena alimentatiei si nutritie, partener in proiect.

Prezentarea tenhica a proiectului

3

Acest proiect a permis dezvoltarea unei noi metode de detectie a fraudelor in

industria alimentara, avand la baza cele mai noi descoperiri in domeniul

senzorilor biomimetici (bistraturi functionalizate, retele de imuno-senzori) in

combinatie cu una adintre cele mai puternice si versatile tehnici de analiza

existente la ora actuala: spectroscopia de impedanta (electrochimica). Metoda

ofera ca si avantaje: neinvazivitate, posibilitatea automatizarii, specificitate si

sensibilitate ridicate, ca si timp de raspuns scurt.

Realizarea obiectivelor proiectului a presupus o abordare multidisciplinara,

echipa de lucru reunind (bio)fizicieni, chimisti tehnologi, biologi, biochimisti,

electronisti, precum si specialisti in domeniul dezvoltarii sistemelor informatice.

Elementele de noutate ale proiectului ca si metodologia de lucru in etapele

importante ale desfasurarii acestuia sunt prezentate in continuare:

- Masuratorile de impedanta: s-au pus la punct proceduri de masura

rapide, in vederea accesului in timp real la parametrii electrici de interes

(experimentele de laborator au permis alegerea parametrilor de masura:

amplitudine, frecventa, timp de aplicare, durata intre masuratori, pentru obtinerea

unui raport optim semnal / zgomot si extinderea dinamicii de masura pentru

analiza microorganismelor patogene de tip Escherichia coli si Salmonella; Au fost

dezvoltate metode de calibrare ale sistemului de masura utilizat si de corectare a

datelor experimentale. De mentionat ca pentru eliminarea erorilor datorate unor

factori nespecifici (temperatura, cuplarea unor compusi din mediu, etc.) s-au

dezvoltat masuratori de impedanta diferentiale, intre un senzor activ si un senzor

de referinta; dezvoltarea circuitului electric echivalent al sistemului traductor –

proba a permis identificarea componentelor sensibile la prezenta celulelor; prin

experimentari au fost alesi parametrii optimi ai semnalului aplicat (amplitudine,

frecventa, timp de aplicare, durata intre masuratori) pentru obtinerea unei

comportari dielectrice stabile a traductorilor de masura.

- Biosenzori: pentru obtinerea biosenzorilor activi au fost testate diferite

biomolecule cu afinitate ridicata fata de microorganismele investigate, pentru

alegerea materialului biocatalitic cu proprietati de legare optime; Au fost

dezvoltate protocoale standardizate de imobilizare covalenta a materialului

4

biocatalitic la suprafata unor senzori specializati tip Biacore, IBIS, etc. (au fost

testate: durata imobilizarii, pH, conductivitate, temperatura, etc. pentru solutiile

folosite); A fost determinata perioada de timp in care senzorii isi pastreaza

proprietatile (sensibilitate, precizie, selectivitate, reproductibilitate, etc.) in

vederea stabilirii conditiilor optime de pastrare a acestora. Procedura de activare

a senzorilor a fost validata utilizand metode complementare (ex.:analize de

fluorescenta, rezonanta plasmonilor de suprafata).

- ME al sistemului de masura cu recirculare: in ceea ce priveste

dezvoltarea dispozitivului de masura, au fost experimentate diferite geometrii,

conditii de curgere si modalitate de dispunere a senzorilor in incinta de masura

pentru obtinerea unui semnal util relevant, rezultatele permitand intocmirea

documentatiei tehnice pe baza careia au fost realizate modulele ME; dezvoltarea

unui sistem automat de injectie in flux.

- Achizitia si prelucrarea datelor, au fost studiate modalitatile de dezvoltare ale

unui sistem informatic performant pentru transmiterea, prelucrarea datelor si

afisarea rezultatelor intr-o forma accesibila, in vederea posibilelor aplicatii ale

metodei si ansamblului de masura in statiile de control si monitorizare on line.

Experimentarile de laborator ce au fost dezvoltate in colaborare cu partenerii

(au pus la dispozitie spatii de experimentare, material pentru analiza) au permis

stabilirea parametrilor functionali, limitele de detectie si strategiile de optimizare

pentru adaptarea metodei si a dispozitivului de masura la analize pe teren.

De mentionat ca partenerii dispun de o gama extinsa de aparatura suport

de masura si testare: analizor de impedanta, microscop cu fluorescenta,

frecventmetru, osciloscoape: digital si analogic; placa de achizitie; generator de

semnal precum si tehnica de laborator de ultima generatie pentru asistarea

fazelor de experimentare si dezvoltare biosenzori, ca si medii software de ultima

generatie, ce au fost utilizate in sprijinul finalizarii cu succes a proiectului. In

acest context, sistemul dezvoltat, nu ridica probleme in utilizare, necesitand un

personal tehnic mediu, fiind pretabil pentru automatizare si functionare in flux.

5

I. Contextul si conceptia proiectului

I.1 Beneficiarul si initiatorul proiectului

CENTRUL INTERNATIONAL DE BIODINAMICA - CIB a fost infiintat prin HG

1378/2000, sub egida UNESCO, ca persoana juridica româna de drept privat,

fara scop patrimonial, cu regim juridic de fundatie de interes general si de utilitate

publica, prin transformarea Centrului UNESCO pentru Biodinamica din cadrul

Institutului National de Cercetare -Dezvoltare pentru Biotehnologie (INBT-CUB).

Activitatile Centrului International de Biodinamica acopera un spectru larg de

cercetari ce privesc realizarea unor metode rapide, neinvazive de caracterizare a

sistemelor biologice, precum si aplicatiile acestora in Biotehnologie, Medicina,

Industriile Alimentara si Farmaceutica, Ecologie etc. CIB furnizeaza si dezvolta

solutii analitice rapide si precise de analiza si control al calitatii si productiei in

domeniul alimentar si biotehnologic in scopul de a imbunatatii performantele de

productie (calitate si siguranta). CIB isi propune sa mentina un echilibru intre

cercetarea fundamentala si cea aplicata prin initierea si coordonarea de

programe de cercetare, de dezvoltare tehnologica si de formare (studii de Master

si Doctorat) la nivel regional (european), in domeniul Biodinamicii, in urmatoarele

directii: a. Cercetare fundamentala:

- analiza si controlul evolutiei sistemelor biologice;

- modelarea efectelor biologice ale campurilor electro-magnetice.

b. Cercetare aplicata in:

- realizarea de noi tehnologii si echipamente pentru evaluarea cantitativa rapida

si neinvaziva a parametrilor sistemelor biologice;

- monitorizarea on line a biomasei (in industriile alimentara si farmaceutica);

- controlul contaminarii microbiene si al calitatii produselor alimentare, cosmetice

si farmaceutice

- analiza rapida (fara utilizarea de reactivi) a probelor de sange;

6

- evaluarea tratamentelor antitumorale;

- dezvoltarea de metode alternative de evaluare a starii organelor in timpul

procedurilor chirurgicale.

I.2 Evolutia sociala si economica pe plan national

In contextul actual al aderarii Romaniei la Uniunea Europeana, al necesitatii

armonizarii legislatiei noastre la cea europena si a adoptarii de noi

tehnici/tehnologii, una din prioritatile romanesti ramane cercetarea aplicata si

gasirea de solutii viabile in industrie si economie pentru asigurarea calitatii si

cresterea sigurantei consumatorului.

Proiectul se incadreaza in prioritatile nationale privind cercetarea

fundamentala si precompetitiva si dezvoltarea de noi aplicatii cu caracter de

noutate tehnica, principalul rezultat urmarit fiind dezvoltarea unui sistem integrat de detectie a analitilor in medii lichide pentru managementul

punctelor critice. Rezultatele obtinute se adreseaza cu precadere utilizatorilor

industriali dar si unitatilor de cercetare din domeniul dezvoltarii de biosenzori,

unitatilor de invatamant superior (biologie, farmacie, medicina). De asemenea un

sistem integrat de detectie bazat pe microfluidica are numeroase aplicatii in

ingineria proceselor chimice, monitorizarea biochimica a alimentelor, solului,

apei, aerului, farmaceutica.

Sublinem aici faptul ca siguranta alimentara si sanatatea reprezinta o

preocupare deosebita pentru toti cetatenii Uniunii Europene iar produsele

alimentare trebuie sa respecte in totalitate cerintele UE.

Tinand cont de aceste prioritati europene au fost elaborate si transpuse in

legislatia nationala, atat reglementarile care se aplica tuturor produselor

alimentare, cat si reglementarile comunitare care se aplica numai anumitor

produse alimentare. Adoptarea acestor acte normative armonizate cu

reglementarile specifice europene, asigura atat protectia sanatatii si interesele

consumatorilor, cat si o competitie corecta a produselor, evitandu-se in acelasi

timp fraudele, falsificarile si barierele tehnice comerciale. Asigurarea

7

managementului punctelor critice are astfel nu numai o importanta economica

individuala (dictata de eliminarea sincopelor in productie si asigurarea calitatii)

dar este impusa prin reglementari speciale.

Mai jos sunt cateva din ordinele care armonizeaza legislatia romaneasca cu cea

europeana:

- Ordinul MAAP nr. 389/2002 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare

privind conditiile de sanatate pentru producerea si comercializarea laptelui crud,

laptelui tratat termic si a produselor pe baza de lapte (Directiva Consiliului

92/46/CEE)

- Ordinul MAAP nr.133/2000 aproba Norma sanitara veterinara cu privire la certificarea

animalelor si produselor de origine animala destinate exportului (Directiva Consiliului

96/93/CE).

- Prin Ordinul MAAP nr.177/2000 este aprobata metodologia de tiparire, emitere si

gestionare a certificatelor de sanatate pentru exportul de animale vii si produse de origine

animala.

- ORDIN nr. 45 din 24 ianuarie 2003 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare

privind procedurile detaliate pentru efectuarea de controale referitoare la respectarea

punctului de congelare a laptelui crud

- ORDIN nr. 389 din 29 august 2002 pentru aprobarea Normei sanitare veterinare privind

conditiile de sanatate pentru producerea si comercializarea laptelui crud, a laptelui tratat

termic si a produselor pe baza de lapte

- Norma din 30 mai 2002 privind denumirile sub care se vinde si conditiile de

calitate ale laptelui de consum Publicat in Monitorul Oficial, Partea I nr. 694 din

23 septembrie 2002

- Ordinul ministrului agriculturii, padurilor, apelor si mediului, ministrului

sanatatii si Presedintelui Autoritatii Nationale pentru Protectia Consumatorilor nr. 521/832/321/2003 privind aprobarea Normelor referitoare la denumirile sub

care este vandut, etichetat si conditiile de calitate ale laptelui pasteurizat partial

sau integral deshidratat destinat consumului uman, publicat in MO al Romaniei

nr. 665/19.XI.2003 (care abroga Ordinul MAFF/MHF 128/300/2001).

- Hotararea Guvernului nr. 1196/2002 pentru aprobarea Normelor generale

8

privind controlul oficial al alimentelor

- Ordonanta de urgenta a Guvernului nr. 97/2001 pivind reglementarea

productiei, circulatiei si comercializarii alimentelor, Legea nr. 57/2002 pentru

aprobarea Ordonantei de urgenta a Guvernului nr. 97/2001

- Legea nr. 245 din 09/06/2004 privind securitatea generala a produselor Adopta Directiva nr. 2001/95/CE prevede:"producatorii sunt obligati sa puna pe

piata numai produse sigure"

- Legea nr. 608 din 31 octombrie 2001 privind evaluarea conformitatii produselor - stabileste cadrul legal unitar pentru elaborarea reglementarilor

tehnice, evaluarea conformitatii si supravegherea pietei pentru produsele

introduse pe piata si/sau utilizate în Romania, din domeniile reglementate

- HOTARARE DE GUVERN nr.71/2001 pentru aprobarea Normelor metodologice

privind stabilirea procedurilor ce se utilizeaza in procesul de evaluare a

conformitatii produselor din domeniile reglementate prevazute in Legea

nr.608/2001 privind evaluarea conformitatii produselor si a regulilor de aplicare

si utilizare a marcajului national de conformitate CS

- HOTARARE DE GUVERN nr.487/2002 pentru aprobarea Normelor

metodologice privind desemnarea si notificarea nationala a laboratoarelor de

incercari precum si a organismelor de certificare si de inspectie care realizeaza

evaluarea conformitatii produselor din domeniile reglementate prevazute in

Legea nr.608/2001 privind evaluarea conformitatii produselor.

- HOTARARE DE GUVERN nr.1587/2002 privind masurile pentru organizarea si

realizarea schimbului de informatii in domeniul standardelor si reglementarilor

tehnice precum si al regulilor referitoare la serviciile societatii informationale

intre Romania, statele membre ale Uniunii Europene si Comisia Europeana OG

nr. 39/1998 privind activitatea de standardizare nationala.

- HG nr. 38/1998 privind activitatea de acreditare si infrastructura pentru valuarea

conformitatii HOTARARE DE GUVERN nr. 1198 din 24 octombrie 2002 privind

aprobarea Normelor de igiena a produselor alimentare (publicat în - Monitorul

Oficial, Partea I nr. 866 din 2 decembrie 2002).

- Legea nr.150 din 2004 privind siguranta alimentelor - reprezinta baza pentru

9

asigurarea unui nivel înalt de protectie a sanatatii oamenilor si a intereselor

consumatorilorî n ceea ce priveste alimentele, tinând cont de diversitatea

oferteialime ntare, incluzând si produsele traditionale, precum si functionarea

eficienta a pietei interne

- Hotararea de Guvern nr. 1198/2002 privind aprobarea Normelor de igiena a

produselor alimentare

- Legea nr.54/2002 de aprobare a Ordonantei de Urgenta nr.97/2001privind

reglementarea productiei, circulatiei si comercializarii alimentelor

- Ordinul Ministerului Sanatatii nr. 1956/1995 privind normele pentru

introducerea HACCP in industria alimentara

- Legea nr. 150/2004 privind Siguranta alimentelor Hotarirea de Guvern nr.

1196/2002 privind controlul oficial al alimentelor.

Rezultatele acestui proiect raspund cerintelor actuale pe plan national ce sunt in

concordanta cu cele de plan european, si anume realizarea unui sistem analitic de

masura pentru estimarea rapida a calitatii, din punct de vedere sanitar, al laptelui

prin detectia eventualelor microorganisme patogene de tip Escherichia coli sau

Salmonella, o metoda de detectie a calitatii si a fraudelor in industria alimentara.

I.3 Impactul economic si social

Prin indeplinirea integrala a activitatilor corespunzatoare prezentului proiect,

impactul sau se rasfrange asupra:

- Calitatii vietii, sanatatii si sigurantei populatiei – fara a avea, in acest stadiu,

efecte directe asupra calitatii vietii, sanatatii si sigurantei populatiei, rezultatele

proiectului (sistemul integrat - microprobe masura, microfluidica - pentru detectie

analiti tinta) deschid calea catre detectia mult mai rapida si la un pret accesibil

(cu un ordin de marime mai mic decat cel al echipamentelor utilizate in prezent) a

10

prezentei de patogeni, toxine sau substante cu cu potential nociv pentru

sanatatea si siguranta populatiei.

- Calitatii mediului – instrumentatia dezvoltata este bazata pe investigatii fizice si

biochimice neinvazive si care nu utilizeaza reactivi periculosi;

- Nivelului de calitate si eficientei economice a micilor intreprinzatori – proiectul

contribuie la automatizarea si standardizarea controlului calitatii produselor

lactate, conducand la eliminarea factorilor de risc si introducerea de tehnologii

ecologice, pentru aplicarea standardelor de calitate.

- Conditiilor de lucru – dezvoltarea de sisteme de masura inovative, automate, ce

nu presupun costuri ridicate si care permit conditii mai sigure si simple de

operare si analiza;

- Oportunitati pentru invatamant si perfectionare – Rezultatele obtinute in cadrul

proiectului, impreuna cu metodele si sistemele de lucru aferente, au constituit

obiectul unor seminarii si cursuri demonstrative, in cadrul Programului

International de Master, cordonat de catre CIB impreuna cu institutii de

invatamant superior din tara si strainatate. Prin aceasta s-a urmarit formarea

unor specialisti capabili sa utilizeze tehnicile de analiza de ultima ora cu

aplicabilitate in domenii specifice industriei alimentare si agriculturii.

I.4 Descrierea pietei careia i se adreseaza rezultatele proiectului

Prin obiectivele stabilite, proiectul raspunde unor cerinte prioritare ale

momentului actual, semnalate atat la nivel national, cat si european, prin actiunile

cheie din cadrul Programului 6 si 7 al Comunitatii Europene, privind controlul

calitatii si sigurantei alimentelor si alinierea la cerintele de calitate ale UE.

Reglementarile internationale si nationale prevad standarde calitative si

cantitative riguroase in ceea ce priveste existenta microorganismelor patogene

de tip Escherichia coli sau Salmonella, deoarece prezenta acestora s-a dovedit a

fi daunatoare sanatatii omului, conducand la aparitia unor suferinte cronice

constand in tulburari gastrice, reactii alergice, stari de oboseala, etc.

11

Spre deosebire de tehnicile convenţionale, metoda propusa in cadrul acestui

proiect face posibila obtinerea directa a informatiei dorite, fara a fi nevoie de

operatii de pretratare si tratare a probelor. Procedura de determinare relativ

simpla, costul scazut si rapiditatea raspunsului asigura acestor metode de

investigare o aplicabilitate imediata si o piata larga de desfacere.

Pe piata romaneasca activeaza un numar mare de firme cu activitate in domeniul

industriei laptelui care pot fi potentiali utilizatori ai sistemului dezvoltat, dintre care

mentionam doar cateva:SC.INTERAGRO.SRL - ZIMNICEA | jud. TeleormanCOMALAT - NANOV | jud. TeleormanTeo-Cori-Bia 2006 - Cateasca | jud. ArgesAgroindustriala Baneasa – BucurestiAlto Impex - BucurestiEUROCHEESE PRODUCTIE SRL – BucurestiMARION INVEST TRADE '94 SRL - Bucurestibrailact sa - Bucurestilacto baneasa srl - Baneasa | jud.Ilvas S.A. - BucurestiAlmera International - Galati | jud. GalatiCALITATEA SRL - Merisor | jud. MaramuresHoruvio S.R.L - Santu | jud. Muresindlacto mures srl - Targu Mures | jud. MuresGefa Impex SRL - TALMACIU | jud. SibiuROMLACTA SA - Pascani | jud. IasiIM Heuvelland SRL - Rep.Moldova | jud. IasiS.C. AGROBIO SRL - Ghidfalau | jud. CovasnaGORDON-PROD SRL - Bulgareni | jud. Harghitamontrepcom - Targu Mures | jud. Muresdincudana - Pitesti | jud. Argessinelli srl - Bistrita | jud. Bistrita-Nasaudecolact prod s.r.l. - Paulesti | jud. PrahovaSEKAM PROD S.R.L. - NOVACI | jud. GorjZada - Radauti | jud. Suceavararaul sa - Campulung Moldovenesc | jud. SuceavaTYROM S.A - Baraolt | jud. Covasnasimultan - Timisoara | jud. TimisTEA CONSULT SRL - Brasov | jud. BrasovCarpalat SRL- Sibiu | jud. Sibiutudia srl - Suceava | jud. SuceavaHORTICOLA SEVIS- Sibiu | jud. SibiuCOPPROD SRL CLUJ- Cluj-Napocaprolacta srl- copacel jud bihor

I.5 Principalii concurenti pe plan national si/sau international

Pe plan national, metoda propusa valorifica experienta pe care colectivul CIB

o are in domeniul spectroscopiei de impedanta, privind analiza si caracterizarea

12

solutiilor omogene si neomogene precum si a interfetelor de interes: membrane

sau suprafete de reactie. Demersul nostru vizeaza punerea la punct a tehnicilor

de lucru cu substrate cu inalta specificitate, in vederea imbunatatirii limitei de

detectie prin spectroscopie dielectrica a prezentei unor microorganisme

patogene in lapte. Metodele vor fi testate in conditii de lucru reale, utilizand

materiale brute.

Pe plan international exista metode si tehnici care determina diferiti

parametrii ai laptelui conform cerintelor actuale. Cu exceptia determinarilor

clasice de microbiologie, mari consumatoare de timp, se disting analizoarele

bazate pe citometrie in flux, kit-urile Elisa, Bactoscanerele. Aceste instrumente

fac analiza laptelui la costuri foarte ridicate si de cele mai multe ori nu au

specificitate pentru un anumit microorganism (ex. Bactoscan). Pretul

echipamentelor seminautomate si automate variaza de la 100 000 euro la 300

000 sau mai mult.

Pe piata sunt disponibile sase tipuri de BactoScan FC cu diferite capacitate si sensibilitati 50 probe/ora 50L (sensibilitate scazuta)50H (sensibilitate inalta)100 probe/ora100L (sensibilitate scazuta)100H (sensibilitate inalta)150 probe/ora150L (sensibilitate scazuta)150H (sensibilitate inalta).Pretul unui BactoScan FC 50 de sensibilitate mare este de aproximativ 150000 euro MicroFoss™

Un sistem automat care se impune in ultima perioada este BIACORE Q (~

150 000 euro) care permite analiza unui singur canal si nu are aplicatii dezvoltate

pentru analiza microorganismelor patogene. Este in curs de lansare un sistem

hibrid tot de la BIACORE care va masura simultan pe 8 canale, pretul estimat

fiind de 250000 euro.

I.6 Principalii clienti

13

Principalul rezultat al acestui proiect a fost punerea la punct a sistemului de

masura specific (senzori activati si dispozitiv integrat de masura cu recirculare)

ce a permis determinarea rapida a prezentei unor aditivi alimentari (de tipul

proteinelor vegetale) in compozitia produselor lactate. Pretul scazut, ca si

performantele crescute asigura o piata larga de desfacere, costurile de realizare

putand fi rapid amortizate.

Dispozitivul aferent va putea fi utilizat de organele oficiilor de protectia

consumatorului, pentru un mai bun control al produselor si reducerea riscului

imbolnavirilor

Potentiali utilizatori ai rezultatelor cercetarilor din cadrul acestui proiect pot fi:

- Laboratoare de analiza

- Directiile sanitar veterinare si directiile de sanatate publica

- Fabricile de lapte

- institute de invatamant superior din domeniile de interes (biologie, chimie, fizica,

medicina, farmacie)

- centre si laboratoare de cercetare – dezvoltare de profil.

I.7 Organizarea si managementul proiectului

Complexitatea colaborarii intr-un consortiu multi-disciplinar a fost abordata din

punctul de vedere al coordonatorului proiectului prin definirea unui set de

obiective detaliat si interconectat. Fiecare obiectiv contine termene, necesar

uman si material bine definite, fiind structurat in pasi / sarcini interne cu propria

lor secventa logica pe verticala si cu interactii orizontale cu alte obiective, pentru

schimburi de informatii, feed-back intern si controlul calitatii.

Coordonarea generala a proiectului: CIB a actionat ca si coordonator al

proiectului. Respectarea regulilor managementului de catre coordonator asigura

colaborarea intre organizatiile partenere si incadrarea in timp a sarcinilor conform

planului de lucru stabilit. Din punct de vedere al coordonarii proiectului, sarcinile

CIB sunt: de a coordona si sincroniza pachetele de lucru individuale; de a

coordona intalnirile in cadrul proiectului; de a monitoriza planul de asigurare a

calitatii proiectului in stransa colaborare cu partenerii; de a centraliza rapoartele

14

si documentatia financiar-contabila furnizate de toti partenerii. Managementul

proiectului este facilitat de compententa stiintifica a partenerilor. Membrii

consortiului au experienta in domeniul proiectelor multi-disciplinare in domeniu,

avand in derulare o serie de proiecte atat pe plan national, cat si in cadrul FP5 .

Comitetul de conducere al proiectului: La inceputul proiectului a fost constituit un

comitet de conducere al proiectului, ce reuneste cate doi reprezentanti ai fiecarui

partener. Comitetul de conducere al proiectului s-a intrunit la inceputul proiectului

si cel putin o data la trei luni. Acest comitet: a pregatit la prima intalnire in plen,

pentru a fi discutate si aprobate de catre toti partenerii, calitatea si liniile de

orientare ale rapoartelor; analizeaza toate materialele furnizate de proiect;

analizeaza progresul proiectului inainte de fiecare intalnire de monitorizare a

modului de realizare a proiectului; actioneaza ca arbitru in cazul aparitiei unor

dispute intre parteneri. Deciziile vor fi luate, atat cat este posibil, de unanimitatea

partenerilor. Atunci cand nu se poate ajunge la consens, coordonatorul

proiectului si-a asumat aceasta hotarare.

Rezolvarea conflictelor: Cooperarea intre parteneri, precum si drepturile si

obligatiile care le revin in consortiu au fost definite intr-o conventie a consortiului.

In cazul unor dispute, partenerii au incercat sa rezolve amiabil problema, ajutati

de catre Comitet.

Intalniri de monitorizare a proiectului: La fiecare termen major al proiectului, au

fost realizate intalniri care au implicat echipele coordonatoare, conducatorul

obiectivului, precum si ceilalti parteneri implicati direct. O data pe an, au fost

organizate intalniri in plen cu toti participantii la proiect, permitand partenerilor sa

discute directiile majore ale proiectului.

Seminarii tematice: Seminariile tematice au fost cel mai potrivit mod de a asigura

participarea externa a echipelor multidisciplinare. Pentru a asigura o cercetare cu

adevarat comparativa si integrata, seminariile si intalnirile de proiect au inclus

vizite de studiu in zonele in care se fac studii de caz.

Pagina Web: Documentele relevante ale proiectului, agendele si ghidurile vor fi

facute accesibile pe un spatiu rezervat pe pagina de web pusa la dispozitie de

coordonator.

15

Comunicatii zilnice: Comunicatii informale zilnice, utilizand comunicatiile

electronice, telefonice, etc. au permis schimbul rapid de informatii intre toti

partenerii implicati in proiect, asigurand luarea de decizii in timp real si rezolvarea

eficienta a tuturor problemelor aparute. Ori de cate ori a fost necesara pentru

progresul real al proiectului, a fost organizata o intalnire directa. Coordonatorul a

asigurat toate comunicatiile intre parteneri. Conducatorul pachetului de lucru

asigura comunicatiile intre ceilalti parteneri implicati direct si coordonator.

Criterii de calitate: La inceputul proiectului, criteriile de calitate si de realizare a

rapoartelor au fost pregatite de Comitetul de Conducere al Proiectului si

aprobate la prima intalnire in plen. Comitetul de Conducere al Proiectului verifica

si aproba fiecare material furnizat de proiect in concordanta cu aceste criterii de

calitate.

Politica consortiului in ceea ce priveste asigurarea dreptului de proprietate

intelectuala, a licentelor pentru tehnologii este bazata pe regulamentele in

vigoare ale UE. Acolo unde este cazul, fiecare partener isi va proteja rezultatul

cercetarilor proprii prin patente, permitandu-se astfel diseminarea rezultatelor

fara risc.

I.8 Realizarea proiectului

Proiectul a dus la extinderea cercetarilor desfasurate de CIB in domeniul

dezvoltarii de tehnici neinvazive si rapide de analiza utilizand spectroscopia de

impedanta, in vederea obtinerii unei metode si a unui sistem analitic pentru

detectia rapida a microorganismelor (Escherichia coli si Salmonella) din lapte.

Datorita avantajelor deosebite, acuratete, timp de raspuns de ordinul

minutelor, utilizarea de senzori specifici, dispozitiv de masura portabil, pret

scazut, metoda raspunde performantelor cerute de aplicatiile in flux si pe teren,

asigurand o manevrabilitate si fiabilitate ridicate.

Probleme rezolvate in cadrul proiectului au fost:

- Dezvoltarea unei metode sensibile de analiza, bazata pe combinarea tehnicilor

imunochimice cu cele fizice pentru cresterea acuratetii si a specificitatii

determinarii unor microorganisme patogene (Escherichia coli si Salmonella);

16

- Testarea diferitelor biomolecule ce prezinta afinitate fata de patogenii

investigati, pentru alegerea materialului biocatalitic cu proprietati de legare

optime;

- Dezvoltarea unor protocoale standardizabile de activare a interfetei unor

senzori specializati, care sa permita imobilizarea covalenta a materialului

biocatalitic la suprafata senzorului (se vor testa: durata imobilizarii, pH,

conductivitate, temperatura, etc. pentru solutiile folosite).

- Determinarea perioadei de timp in care senzorii isi pastreaza proprietatile

(sensibilitate, precizie, selectivitate, reproductibilitate, etc.) in vederea stabilirii

conditiilor optime de pastrare a senzorilor realizati, stiut fiind faptul ca biosenzorii

disponibili comercial la aceasta ora pot fi pastrati pana la 6 luni-1 an.

- Realizarea si testarea unui dispozitiv unitar biosenzori / front-end, avand si

posibilitati de recirculare (avand in vedere ca de regula analitii urmariti pot sa fie

prezenti in concentratii destul de mici in probele analizate, recircularea asigura o

scadere a timpului de detectie, prin cuplarea mai rapida a analitilor de interes la

suprafata senzorului).

In acest context, obiectivele propuse in cadrul acestui proiect se

adreseaza unor prioritati semnalate atat la nivel european, prin actiunile cheie

din cadrul Programului 6 al Comunitatii Europene, cat si national, privind

optimizarea proceselor sau bioproceselor de productie si alinierea la cerintele de

calitate ale Uniunii Europene.

Experienta acumulata si realizarile colectivelor implicate in realizarea

acestui proiect, creaza premisele dezvoltarii unei metode de analiza rapide, de

evaluare a prezentei unor analiti in probe lichide. Proiectul si-a atins obiectivele

in intervalul stabilit, fara riscuri majore, dat fiind evaluarea obiectivelor proiectului,

a resurselor de care colectivele implicate dispun, a potentialului de piata ridicat

precum si posibilitatea atragerii de colaboratori internationali in domeniu (un

proiect international privind dezvoltarea si caracterizarea unor biosenzori cu

aplicabilitate la analiza calitatii unor produse din industria alimentara, propus

pentru aceasta perioada, reuneste colective de cercetare si parteneri industriali

din Germania, Romania, Spania, Franta si Elvetia).

17

Planul de realizare a proiectului raspunde cerintelor impuse de tipul de proiect,

incluzand etapele obligatorii ca si o serie de alte etape de lucru eligibile,

necesare realizarii si finalizarii in bune conditii a proiectului.

18

2. 9 Graficul etapelor de realizare

Obiective masurabile ale acetui proiect sunt cela enumerate mai jos:

1. Dezvoltarea unei metode dielectrice in conjunctie cu tehnici de recunoastere

specifica pentru determinarea prezentei de microorganisme cu grad ridicat de

risc pentru sanatatea consumatorilor pe baza brevetului ”Metoda de masura

rapida de inalta precizie a impedantei in curent alternativ sinusoidal”.

2. Dezvoltarea unor proceduri reproductibile de imobilizare a materialului

biocatalitic de recunoastere specifica la suprafata unor senzori specializati,

pentru activarea interfetei (se vor testa: durata imobilizarii, pH, conductivitate,

temperatura, etc. pentru solutiile folosite).

3. Realizarea ME al sistemului unitar biosenzori / front-end dedicat analizelor.

4. Testarea metodei; verificarea si omologarea sistemului pentru detectia

microorganismelor in produse lactate;

5. Prezentare si demonstrare publica a functionalitatii si utilitatii ME si metodei

de analiza dezvoltate.

S-au dezvoltat urmatoarele activitati care sunt prezentate pe scurt mai jos:

2004: - studii privind specificatiile generale si cerintele de analiza ale metodei;

2005: - elaborarea metodei dielectrice de evidentiere a prezentei

microorganismelor patogene in produsele lactate.

- experimentari de laborator privind dezvoltarea unor protocoale de activare a

unor senzori specializati pentru determinarea analitlor de interes. Aceasta etapa

a vizat si elaborarea specificatiilor tehnice (dimensiune, material, aranjament),

pentru a obtine sensibilitatea si specificitatea cerute de aplicatia dorita;

- intocmirea documentatiei tehnice de executie (proiectare) si realizarea

modelului experimental al dispozitivului unitar biosenzori / front-end;

2006: - testarea si validarea metodei; detectia microorganismelor patogene din

lapte in conditii reale. Aceasta ultima etapa a evidentiat parametrii tehnici ai

metodei: timp de analiza de 30 minute, posibilitatea detectiei directe a 10^5

celule/ml. Desi reflecta o imbunatatire substantiala fata de referintele de

literatura, pentru implementarea in sistemul HACCP, este nevoie de etapa de

preimbogatire. Chiar si asa, timpul pana la obtinerea raspunsului este redus de la

19

2 zile la 12 ore. Trebuie intreprinse eforturi pentru obtinerea validarii AOAC a

metodei (www.aoac.org).

Prin obiectivele si rezultatele pe care si le subsumeaza, obiectivele

proiectului au raspuns directiilor tematice generale ale programului “Invent”

privind stimularea valorificarii rapide in economie a brevetelor de inventie.

Proiectul vizeaza in mod deosebit obiectivele stabilite in subprogramul 1 :

realizarea si testarea de modele functionale, precum si imbunatatirea unor

metode brevetate, avand ca obiectiv specific dezvoltarea unui sistem de

masurare cu limite de detectie reglementate de UE in domeniul securitatii si

calitatii produselor lactate.

Mai jos sunt prezentate pe scurt etapele proiectului si sumele alocate acestor

activitati:

Etape/ Activităţi/ Parteneri Termene

Necesar resurse financiare *)(Valoare mii RON)

Total(mii RON)

Din careFinanţaredin buget program

Finanţaredin alte surse(cofinanţare)

Etapa I: Specificatii generale/cerinte de analiza ale metodei ce trebuie dezvoltate

15 Nov2004

118 114 4

Etapa II: Elaborare metoda de evidentiere rapida si specifica a prezentei unor patogeni cu grad ridicat de risc

15 Nov - 1 Martie2005

207 200 7

Etapa III: Teste de laborator ale metodei si traductorilor modificati pentru detectia specifica a E. coli si Salmonella

1 Martie – 15 Iulie2005

237 229 8

Etapa IV: Proiectare si Realizare dispozitiv modular pentru detectia E. coli si Salmonella cu traductori specifici integrati in punctele critice in industria laptelui

15 Iulie-15 Nov2005

277 277

Etapa V: Testarea si validarea sistemului si a metodei de analiza

15 Nov-1 Martie2006

248 248

20

Etapa VI: Diseminare rezultate 1 Martie – 15 Sept2006

50 50

Etapa VII: Dezvoltare tehnologica a sistemului de evaluare a prezentei E. coli si Salmonella in probe preluate in punctele critice din lantul de productie al laptelui.

1 Martie – 15 Sept2006

108 81 27

2.10. Evaluarea riscurilor

Experienta acumulata si realizarile colectivelor implicate in derularea

acestui proiect, au creat premisele obtinerii unei metode rapide, cu dispozitivul

de masura aferent, pentru determinare rapida a prezentei microorganismelor

patogene de tip Escherichia coli sau Salmonella ce apar in compozitia produselor

lactate.

Obtinerea validarii AOAC este o etapa esentiala pentru implementarea

metodei in sistemul HACCP.

2.11. Concluzii

Metoda si sistemul dezvoltate, avand la baza know-how-ul Centrului

International de Biodinamica raspund unor prioritati semnalate atat la nivel

national, cat si european (prin actiunile cheie din cadrul Programelor 5 si 6 al

Comunitatii Europene), privind optimizarea proceselor de productie si alinierea la

cerintele de calitate ale Uniunii Europene pot fi cu succes implementate pe piata

in conditiile obtinerii tuturor aprobarilor si realizarii testelor de validare extinse in

maxim 1 an.

Abordarea este noua si permite obtinerea de importante economii de timp

la analizele/incercarile necesare unei probe (30 minute). In conditiile imbunatatirii

calitatii sistemului de microfluidica acest timp va putea fi scazut.

O atentie deosebita trebuie acordata cresterii reproductibilitatii senzorilor

functionalizati, atat in ceea ce priveste functionalizarea cat si regenerarea. Dupa

21

etapa de functionalizare, calitatea senzorului este reflectata in nivelele de

raspuns obtinute (±10% variabilitate). Respectarea conditiilor de regenerare

asigura pastrarea capacitatii de legare (asa numitul parametru de recovery) in

intervalul 85%-95%.

Imbunatatiri trebuie aduse si softului de analiza date pentru considerarea

unor bucle de corectie.

Obtinerea validarii AOAC este o etapa esentiala pentru implementarea

metodei in sistemul HACCP.

22