1

Facultatea de Zootehnie Specializarea: Controlul i expertiza produselor alimentare Lucrare practic nr.7

Analiza toxicologic a reziduurilor de pesticide (continuare)

C. Determinarea reziduurilor de raticide

C2. Determinarea reziduurilor de alfanaftiltiouree (ANTU).

ANTU este un raticid de sintez care se prezint sub forma unei pulberi cenuiu brune sau cenuiu violete, foarte puin solubil n ap i instabil la lumin i aer. Sursele de toxic sunt momelile preparate n scopul combaterii roztoarele, cele mai susceptibile la intoxicaie fiind suinele i carnivorele.

ANTU produce creterea permeabilitii capilarelor pulmonare, producndu-se astfel edemul pulmonar acut i moartea prin asfixie. Pentru identificarea alfanaftiltioureei din produsele biologice este omologat metoda reaciei de culoare cu para-nitroanilin.

Principiul metodei: alfanaftiltioureea nclzit la fierbere cu hidroxid de potasiu soluie alcoolic, formeaz la adaos de para-nitroanilin diazotat cu un mic exces de acid clorhidric, un precipitat rou floconos. Reacia este specific i sensibil.

A. Izolarea: se trateaz probele cu alcool etilic pe baie de ap cu refrigerent ascendent. Se filtreaz i se evapor la sec. Se extrage reziduul cu cloroform, n care trec grsimile i ANTU. Se evapor cloroformul. Reziduul se saponific cu hidroxid de potasiu soluie alcoolic, apoi se dilueaz cu ap, se aciduleaz i se extrage cu eter etilic. Extractul etilic se spal de 2 3 ori cu soluie hidroxid de sodiu soluie normal (pentru ndeprtarea acizilor grai), apoi se usuc cu sulfat de sodiu anhidru i se evapor la sec. Reziduul conine ANTU aproape pur.

B. Identificarea se face cu un amestec 2:1 din soluie de para-nitroanilin (0,5 g para-nitroanilin, 50 ml HCl, ap distilat pn la semn) i soluie azotit de sodiu (0,5 g azotit de sodiu, 100 ml ap distilat).

Peste reziduul obinut se adaug 10 ml hidroxid de potasiu soluie alcoolic 0,1% i se aduce la fierbere, pe baie de ap. Se trage apoi soluia fierbinte ntr-o eprubet i se adaug 3 5 picturi de reactiv de culoare (amestecul 2:1 amintit anterior). Apariia unui precipitat rou floconos indic prezena ANTU-ului.

Carnea i organele animalelor intoxicate, cu excepia pulmonilor, se dau n consum condiionat, local sau la fabricarea de preparate, dac nu prezint modificri organoleptice i prin examenul de laborator nu se detecteaz urme de toxic. Laptele nu se d n consum dac prezint modificri organoleptice. Oule se dau n consum necondiionat.

C3. Determinarea reziduurilor de fosfur de zinc i ali derivai cu fosfor.

Fosfura de zinc (Zn3P2) i cea de aluminiu (AlP) sunt raticide preferate datorit aciunii lor rapide i a descompunerii lor ntr-un timp foarte scurt, cadavrele nefiind astfel surse de toxic. Sursele de toxic sunt reprezentate de momelile cu fosfur de zinc. Fosfura de aluminiu se folosete pentru gazarea spaiilor nchise, ocazional producndu-se intoxicaii pe cale respiratorie.

2

Manifestrile clinice sunt predominant digestive, respiratorii i nervoase. Cadavrele prezint congestie i edem pulmonar, hemoragii subpleurale, hidrotorax, congestie hepatic i renal. Atrage atenia mirosul aliaceu al coninutului gastric.

Reaciile de identificare ale toxicului din produsele biologice se bazeaz pe identificarea hidrogenului fosforat eliberat de fosfurile metalice n mediul acid care, mpreun cu reactivul Wilmet (acidul selenios) formeaz un compus de culoare roie. Reacia este negativ pentru hidrogenul arseniat (H2As), servind la diferenierea acestuia de hidrogenul fosforat (H3P).

Zn3P2 + 6 HCl = 2H3P + 3 ZnCl2 Modul de lucru: se dizolv 0,9 g biselenit de sodiu (NaHSeO3) n 8,6 ml ap distilat i se

adaug 0,5 ml HCl concentrat. Cu aceast soluie se mbib benzi de hrtie indicatoare de 10 x 60 mm, care se usuc i se pstreaz n spaii bine nchise i la ntuneric.

Din materialul de cercetat se iau 5 10 g, care se introduc ntr-un pahar conic, cu dop rodat. Se adaug civa mililitri HCl concentrat i se astup imediat cu dopul, de care se fixeaz hrtia mbibat cu reactiv Wilmet. Dac n proba de analizat exist sulfur metalic, aceasta elibereaz H3P care coloreaz hrtia indicatoare n rou.

Carnea animalelor intoxicate acut cu fosfor se poate da n consum condiionat, local. n intoxicaia subacut sau cronic, carnea i organele prezint modificri organoleptice i se confisc.

C4. Determinarea reziduurilor de stricnin.

Stricnina a cunoscut o larg utilizare ca raticid. n prezent, stricnina intr n componena unor preparate eupeptice (stimuleaz apetitul i secreiile digestive) i ruminatorii (stimuleaz actul rumegrii). Intoxicaiile pot aprea prin consumul cadavrelor animalelor intoxicate sau prin supradozarea preparatelor farmaceutice.

Manifestrile clinice sunt predominant nervoase: crize de hiperexcitabilitate i de tetanie generalizat. Atrage atenia rigiditatea cadaveric pronunat care se instaleaz rapid dup moartea animalului. Mai apar echimoze, peteii i cianoza pronunat a mucoaselor.

Izolarea stricninei din produsele biologice se realizeaz prin extracie cu cloroform, dup alcalinizare cu NaOH 10%. Stricnina se identific pe reziduul obinut prin evaporarea la sec a extractului cloroformic.

Reacii de culoare: a) Reacia Bauer (cu bicromat de potasiu i acid sulfuric): peste reziduul de pe sticla de ceas se

adaug o pictur soluie de bicromat de potasiu 10% i se evapor la sec pe baie de ap. Reziduul se reia cu acid sulfuric hidratat (H2SO4) format dintr-un amestec de 98 g H2SO4 concentrat i 36 g ap. n prezena stricninei n proba de analizat mediul de reacie se coloreaz pentru scurt timp n violet, care vireaz n rou cireiu, i apoi incolor.

b) O variant a acestei reacii include adugarea de bicromat de potasiu pulbere i cteva picturi de H2SO4 concentrat. Cu o baghet se trag cteva dre pe sticla de ceas; n urma baghetei apar urme colorate violet, care vireaz n rou i apoi dispar (n prezena stricninei).

c) Reacia Mandelin: cu sulfovanadatul de amoniu strincina d o coloraie albastr violet, ce vireaz la rou prin adugare de ap sau soluie alcalin.

C. Determinarea reziduurilor de erbicide

Erbicidele sunt pesticide utilizate n agricultur pentru distrugerea buruienilor, sau ca defoliante. Att clorfenoxiderivaii acizilor grai ct i compuii triazinici se identific prin cromatografie n strat subire.

3

Erbicidele se izoleaz din proba de analizat prin extracie cu solveni organici adecvai (eter etilic/de petrol, alcool eticlic, sau aceton) dup care extractul se concentreaz i se spoteaz pe placa cromatografic, unde sunt puse n eviden cu ajutorul unor reactivi specifici.

Pentru determinare se folosesc plci de silicagel G cu grosimea cuprins ntre 0,25 0,5 mm, activate ntre 45 minute i 2 ore la 110 0C.

Probele de analizat se spoteaz pe placa cromatografic n paralel cu substana de referin. Ca sisteme de eluie se pot folosi diferite amestecuri ce includ benzen, cloroform, acetat de etil, ciclohexan, eter de petrol, acid acetic glacial etc.

Relevarea compuilor se realizeaz prin pulverizarea plcii cromatografice cu soluie de azotat de argint, ce poate fi i n amestec 1:1 cu amoniac 25%, urmat de expunere la lumina ultraviolet. Apar spoturi cenuii pe fond alb, iar cnd se folosete ca revelator bicromatul de potasiu n acid acetic concentrat, spoturile sunt colorate galben, pe fond rocat.

Limita de detecie este de 5 g. Limitele maxime admise ale reziduurilor de erbicide n alimente sunt cuprinse ntre 0,02 0,10 ppm.

Analiza toxicologic a reziduurilor de nitrai/nitrii

Nitraii (NO3-) i nitriii (NO2-) sunt componeni naturali ai solului, provenind din mineralizarea substanelor organice de origine vegetal i animal. Mineralizarea azotului se datoreaz, n primul rnd, microorganismelor existente n sol. n rile cu climat temperat, acest proces se desfoar cu maximum de intensitate n sezonul cald.

O parte din nitrai i nitrii este absorbit de rdcinile plantelor i servete ca materie prim pentru sinteza proteinelor i a altor compui cu azot, iar alt parte este antrenat de apele de suprafa sau de cele care traverseaz solul, regsindu-se n ruri, lacuri, apele subterane.

n mod natural, ntre nitraii i nitriii din sol, ap, plante se stabilete un echilibru, care poate fi ns rupt de utilizarea intensiv n agricultur a ngrmintelor organice naturale (gunoi de grajd) i mai ales a celor azotoase sintetice. Produii lor de degradare mbogesc solul i se pot acumula n plantele cultivate pn la niveluri duntoare pentru consumatori.

Prin intermediul furajelor i al apei, nitraii i nitriii ajung i n organismul animalelor ale cror produse intr n alimentaia omului. Ambele categorii de substane sunt mai utilizate ca aditivi alimentari n preparate din carne i uneori n laptele destinat produciei de brnzeturi, pentru ameliorarea nsuirilor senzoriale i prelungirea duratei de pstrare.

Nitraii i nitriii n alimentele de origine vegetal

Plantele absorb din sol azotul n principal sub form de nitrai sau de amoniac (NH3). Primele transformri pe care le sufer nitraii n plante constau n dou reduceri succesive, catalizate de enzimele nitratreductaz i nitritreductaz:

NO3- NO2-NO. Oxidul de azot este transformat mai departe, tot pe cale enzimatic, n hidroxilamin, amide i

aminoacizi. Transformarea nitrailor n nitrii se face preponderent n rdcin i n frunze. Spre deosebire de nitrai, coninutul de nitrii din plante este foarte redus. Aceasta se datoreaz faptului c, n procesele de transformare pe care le sufer nitraii n plante, etapa nitriilor este tranzitorie: pe msur ce nitriii se formeaz sub inflena nitratreductazei, ei sunt redui mai departe cu aceeai vitez de ctre nitritreductaz n oxizi de azot. Aa se explic de ce cantitile de nitrai n spanac, sfecl, elin, ridichi i alte legume pot ajunge i pn la 2000 3000 mg/kg, n timp ce nitriii nu depesc 1-5 mg/kg.

4

Stagnrile din cursul procesului tehnologic de fabricare al conservelor din fructe i legume, precum i depozitarea acestora n locuri necorespunztoare (att nainte ct i dup procesare), favorizeaz dezvoltarea microorganismelor de degradare i acumularea unei cantiti mari de nitrii prin reducerea nitrailor. Pstrarea materiei prime i a produsului finit la temperaturi cuprinse ntre 0 i +4 0C, oprete practic procesul de transformare a nitrailor n nitrii.

Legumele care se caracterizeaz prin sisteme reductoare puternice, cum sunt spanacul, salata verde, radacinoasele, care transform rapid nitraii n nitrii, nu se depoziteaz dect un timp scurt nainte de a fi supuse prelucrrii. Splarea cu mult ap a legumelor fragmentate sau fierberea de scurt durat cu aruncarea apei, pot reduce nitraii cu pn la 30% din cantitatea iniial. Aceste practici prezint neajunsul c, n aceleai timp, se pierd i cantiti nsemnate din substanele nutritive hidrosolubile: vitamina C, vitamine din grupul B, elemente minerale. n afar de fructe i legume, nitraii au fost pui n eviden i n produsele de panificaie sau n vinuri.

Nitraii i nitriii n produsele de origine animal

Dei animalele pot ingera cantiti mari de nitrai din furaje i ap, totui coninutul de nitrai i nitrii al crnii i oulor este foarte redus. Aceasta se explic prin faptul c nitraii ajuni n intestinul subire se absorb cu uurin, trec n snge i sunt excretai prin urin. n cazul rumegtoarelor, o mare parte din nitraii existeni n furaje sunt folosii ca materie prim pentru sinteza substanelor organice azotoase de ctre microorganismele care populeaz stomacul lor.

O cantitate mic de nitrai se poate secreta n lapte. n general, concentraia acestora nu depete 40 50 mg/l. Nitriii sunt practic abseni n lapte. La analiza a 200 de probe de lapte provenite din mai multe judee, au fost gsii nitrai n concentraii medii de 21,1 mg/l i nitrii n concentraii medii de 0,34 mg/l.

Legislaia unor ri accept adugarea de nitrai sau de nitrii n laptele destinat preparrii brnzeturilor. Scopul const n prevenirea alterrii precoce (produs n special de bacteriile coliforme) i mai ales a balonrii tardive a brnzeturilor maturate fermentate (tip cacaval Olanda, Trapist) prin dezvoltarea germenilor din gupa Clostridiilor (Clostridium butiricum, tyrobutiricum, sporogenes etc.). n tolerarea utilizrii nitrailor i nitriilor n laptele destinat brnzeturilor se are n vedere c mare parte din aditiv se elimin n zer iar cantitile reziduale din brnz scad treptat n timpul maturrii produsului finit. Nu trebuie uitat ns c nitriii au o puternic aciune oxidant asupra unor substane nutritive din lapte (vitamina A, din grupul B, unii aminoacizi).

n preparatele din carne (unc, salamuri, crnai etc.) nitraii i nitriii se utilizeaz n mod curent pentru meninerea culorii roz-roie i pentru efectele lor bacteriostatice, antioxidante i de dezvoltare a aromelor. Pentru a difuza uniform n masa de carne, nitraii i nitriii se adaug de obicei n sarea uscat sau n saramur. Sub inflena florei reductoare din saramur i din carne, nitraii trec n nitrii. Acetia oxideaz mioglobina i hemoglobina din resturile de snge n nitrozomioglobin i, respectiv, nitrozohemoglobion, care i pstreaz culoarea roie i dup tratamentul termic. n lipsa lor, mezelurile fierte sau oprite ar avea o culoare gri-cenuie.

Deoarece elementul activ este constituit din nitrit, astzi exist tendina de a se utiliza numai aceasta sub denumirea tehnologic de silitr tare. Nitraii (silitra moale) sau amestecul de nitrai-nitrii sunt indicai pentru mezelurile cu lung durat de preparare i pstrare (de exemplu, salamuri crude tip Sibiu, pastram etc.). Nitriii au i o evident aciune bacteriostatic bactericid n special fa de bacteriile anaerobe n grupa crora intr i clostridiile. Prin acest efect se prelungete durata de pstrare a preparatelor din carne i se face profilaxia botulismului. Sarea i pH-ul acid poteneaz efectul bacteriostatic.

ntr-un raport recent al O.M.S., pe baza a 500 de referine bibliografice s-a stabilit c nitraii i nitriii n concentraiile existente curent n alimentele de origine animal nu prezint pericol pentru

5

sntatea adulilor i copiilor, ns s-a atras atenia asupra riscului pentru sugari, n special n primele 3 luni de via. Raportul menioneaz existena unui risc al expunerii umane la compuii N-nitrozo, dintre care cei mai muli s-au dovedit mutageni, iar unii teratogeni i cancerigeni n experienele pe animale. Majoritatea toxicologilor accept ns acest risc, avnd n vedere riscul mult mai mare i imediat determinat de toxiinfeciile cu Clostridium botulinum. S-au fcut totui recomandri de nlocuire sau de reducere a nitriilor n preparatele din carne prin folosirea unor factori fizici i chimici antibotulinici alternativi. Diveri autori au raportat c se poate realiza un control al dezvoltrii lui Cl. botulinum prin reducerea umiditii, pstrarea la temperaturi mai mici de 3,3 0C, iradiere, mrirea concentraiei de sare, acidifierea mediului, folosirea de acid ascorbic, ascorbai sau izoascorbai, antioxidani fenolici, polifosfai, extracte de condimente.

n ara noastr, concentraia nitriilor n produsele finite este limitat la 70 mg/kg. n multe ri se accept cantiti de pn la 200 mg/kg. Riscul formrii de nitrozamine a adus ns n actualitate problema revizuirii acestor norme, n sensul reducerii lor.

Efectele nocive ale nitrailor i nitriilor

Nitraii ca atare au o toxicitate redus. Pentru a determina tulburri trebuie ingerate cantiti mari, de pn la 10 g n doz unic. n general, predomin tulburrile digestive: grea, vrsturi, crampe, diaree, uneori sangvinolent. n condiiile unui aport ce nu depete limitele obinuite, nitraii se absorb integral n prima parte a intestinului subire i se elibereaz prin urin i saliv.

Nitriii sunt mult mai toxici ca nitraii. Acetia se gsesc n cantiti mici n alimente, ca produs natural. Concentraia lor poate crete pn la niveluri periculoase prin aciunea reductoare a microorganismelor asupra nitrailor.

n mod obinuit, cantitile de nitrii formate n intestinul gros sunt mici, pentru c majoritatea nitrailor se absorb la nivelul intestinului subire i se elimin prin urin. O serie de condiii favorizeaz ns producia i trecerea n snge i esuturi a unor cantiti mari de nitrii: consumul de alimente i ap cu concentraii mari de nitrai, eventual nitrii; exacerbarea florei intestinale n tulburri digestive acute i cronice (colite, enterocolite, scderea aciditii gastrice, ulcere gastrice etc.) sau n infecii respiratorii superioare (rinite, sinuzite, amigdalite) cnd flora din nazofarinx este nghiit i nsmneaz tubul digrestiv.

Efectul methemoglobinizant al nitriilor este aciunea major a creterii concentraiei sangvine a acestor compui. Methemoglobina se formeaz n mod obinuit n eritrocitele normale dar cu un ritm mult mai lent, pe msur ce se produce este reconvertit n hemoglobin. Din aceast cauz, nivelul methemoglobinei rmne ntotdeauna sczut, sun 0,8% din hemoglobina total la adult i sub 1,5% la sugarul mic. Methemoglobina este un compus similar hemoglobinei, doar c ionul feros (Fe2+) (ion central al hemoglobinei) a fost ionizat la ionul feric (Fe3+), incapabil s asigure transportul oxigenului n snge. Aadar, principalul simptom n intoxicaia cu nitrai /nitrii este cianoza, perceptibi cnd methemoglobinemia depete 10% din totalul hemoglobinei. Alte semne clinice, precum cefalee, ameeli, polipnee, tahicardie, astenie, apar la peste 20% methemoglobin. Cei mai sensibili sunt copiii n primii ani de via, i n primul rnd sugarii, datorit persistenei hemoglobinei fetale (mai oxidabil dect hemoglobina adulilor) i a insuficienei enzimelor de reducere a methemoglobinei.

Principiul metodei de determinare a coninutului de nitrii n probele de ap: ionii de nitrit reacioneaz cu acidul sulfanilic, n mediu puternic acid, formnd compui de diazoniu, care apoi se cupleaz a pH 2 2,5 cu alfa-naftilamina, cu formarea unei coloraii roii purpurii. Intensitatea coloraiei se msoar colorimetric la 520 nm.

Princpiul metodei de determinare a nitrailor din ap: ionii de nitrat reacioneaz cu acidul fenoldisulfonic, formnd un derivat fenolsulfonic, de culoare galben. Intensitatea culorii se msoar

6

fotometric, la lungimea de und de 410 nm, pentru coninuturi de pn la 10 mg NO3/l, i la lungimea de und de 480 nm, pentru coninuturi de 10 100 mg NO3/l. Pentru dozarea nitrailor i nitriilor din furaje, principiul metodei de lucru este: extracia nitriilor din proba de analizat cu ap cald, deproteinizarea extractului, formarea unui complex de culoare roz-roie rezultat n urma reaciei dintre nitrii, clorur de sulfanilin i diclorhidrat de N i fotocolorimetrarea la lungimea de und de 538 nm a complexului colorat obinut. Determinarea nitrailor se face prin reducerea lor la nitrii n prezena cadmiului metalic, urmat de reacia de culoare i colorimetrare ca la nitrii.