LP. 7 Reacţiile antigen-anticorp în laboratorul de microbiologie.

Obiective:1. De a defini noţiunile de antigen şi anticorp, zona de echivalenţă, fenomen de prozonă şi de a prezenta

aplicaţiile practice ale reacţiilor antigen-anticorp.2. De a defini noţiunile de titru, diagnostic serologic, criteriile de diagnostic serologic al unei infecţii acute.3. De a discuta principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp utilizate în laboratorul de microbiologie:

clasificare, principiu, indicaţii, exemple.

1. Antigen substanţă străină care, pătrunsă într-un organism competent, determină răspuns imun (imunogenitate) şi reacţionează specific cu efectorii imunitari apăruţi ca rezultat al acestui răspuns (specificitate).

Anticorp imunoglobulină produsă în organism sub acţiunea unui antigen şi care are proprietatea de a reacţiona specific cu antigenul corespondent.

Reacţia antigen-anticorp este stabilă în zona de echivalenţă (cantităţile celor doi reactivi sunt aproximativ egale).

Fenomen de prozonă = absenţa reacţiei în prezenţa unui exces de anticorpi rezultat fals negativ.

Aplicaţiile practice ale reacţiei antigen-anticorp se bazează pe specificitatea cuplării celor două elemente

Se pot urmări:- identificarea unui antigen necunoscut (în produse patologice sau tulpini izolate în laborator) prin

anticorpul omolog prezent în seruri imune de referinţă- identificarea unui anticorp necunoscut prin antigenul omolog (diagnostic serologic)

Se pot obţine:- relaţii calitative simpla identificare a unui reactiv- relaţii cantitative determinarea titrului reactivului cercetat

2. Titru inversul diluţiei maxime a unui reactiv, la care mai este vizibilă reacţia cu cantităţi constante şi definite ale reactivului omolog.

Diagnostic serologic urmărirea răspunsului imun al pacienţilor la antigene ale microorganismului infectant prin teste in vitro.

Criteriile de diagnostic serologic al unei infecţii acute:

- probe de ser prelevate în dinamică (serul I / acut şi serul II / de convalescent, recoltate la interval de 10-14 zile)

seroconversia absenţa anticorpilor în prima probă şi apariţia lor în cea de a doua dinamica semnificativă creşterea de cel puţin patru ori a titrului anticorpilor în a doua probă de

ser faţă de prima

- o singură probă de ser titrul semnificativ dozarea anticorpilor IgM (anticorpii răspunsului imun primar) diagnosticul unei infecţii acute diagnosticul precoce al unor infecţii congenitale

3. Principalele tipuri de reacţii antigen-anticorp:

A. Reacţii de precipitare- sensibilitate scăzutăPrincipiu: un antigen solubil formează cu anticorpul omolog un complex insolubil.

Clasificare după mediul în care se desfăşoară reacţia:a. Reacţii în mediu lichid:

reacţia de precipitare inelară la interfaţa reactivilor → rezultate calitative → identificarea unor antigene e.g.,

gruparea streptococilor (Lancefield) reacţia de floculare în amestecul reactivilor → rezultate cantitative

→ dozarea proteinelorb. Reacţii în mediu gelificat:

Imunodifuzia radială simplă (tehnica Mancini) → antigenul difuzează radial dintr-un godeu în stratul de gel care conţine ser imun monospecific → în jurul godeului se formează un halou de precipitat al cărui diametru este direct proporţional cu concentraţia antigenului.→ folosită pentru determinarea concentraţiei proteinelor plasmatice

Imunodifuzia dublă radială (tehnica Ouchterlony)→ antigenul şi anticorpul difuzează radial din godeuri practicate la distanţă convenabilă în stratul de gel.→ în zona dintre godeuri, unde reactivii au realizat proporţii echivalente, apare o linie de precipitare→ utilizată pentru caracterizarea antigenelor în amestec

Testul Eleck → demonstrarea toxigenezei bacilului difteric

Imunoelectroforeza Contraimunoelectroforeza

B. Reacţii de aglutinare - Reacţii sensibilePrincipiu cuplarea unui antigen în suspensie cu anticorpul omolog determină apariţia unui aglutinat sub formă de mase vizibile, care se depun şi lasă supernatantul limpede

Clasificare după modul de prezentare a antigenului în reacţiea. Reacţii de aglutinare directăAntigen o suspensie bacteriană

Calitative reacţii de aglutinare pe lamă → identificarea unui antigen bacterian Cantitative reacţii de aglutinare în tuburi → cuantificarea anticorpilor în serul pacienţilor (e.g., reacţia

Widal pentru diagnosticul febrelor enterice) → confirmarea rezultatelor aglutinării pe lamă

b. Testul Coombsc. Reacţii de aglutinare pasivă se utilizează particule pe suprafaţa cărora a fost adsorbit un antigen

bacterian (e.g., hematii reacţia de hemaglutinare)d. Reacţia de latexaglutinare = anticorpi specifici fixaţi pe suprafaţa particulelor de latex

→ identificarea antigenelor direct în prelevate patologice.e. Reacţia de coaglutinare anticorpul este fixat prin fragmentul Fc pe proteina A din învelişul

stafilococilor aurii.

C. Reacţia de fixare a complementuluiPrincipiu două complexe antigen-anticorp îşi dispută complementul

Ag de referinţă – Ac necunoscutAg necunoscut – Ser imun

Cuplu hemoliticHematii de oaie – Ser antihematii

complexul format în prima reacţie fixează complementul, încât a doua reacţie nu mai are loc şi hematiile rămân intacte.

D. Reacţii de neutralizarePrincipiu = sunt implicate antigene virale sau toxine a căror legare de receptori celulari este urmată de efecte definite = după reacţia cu anticorpii omologi, aceste antigene nu se mai pot fixa pe receptorii celulari, sunt neutralizate.

Clasificare: Neutralizări = supravieţuirea animalelor receptive după injectarea amestecului imunoser-virus / toxină. Reacţii de inhibare a hemaglutinării → identificarea virusurilor hemaglutinante

→ serodiagnosticul infecţiilor determinate de virusuri hemaglutinante

E. Reacţii cu anticorpi marcaţi: Imunofluorescenţa- tehnica directă = foloseşte anticorpi marcaţi fluorescent, specifici pentru fiecare antigen- tehnica indirectă = foloseşte anticorpi marcaţi anti-imunoglobuline

= elementele de identificat pot fi atât antigenele, cât şi anticorpii

Reacţiile imunoenzimatice (EIA)Principiu: anticorpul poate fi marcat cu o enzimă; după formarea complexului cu antigenul şi îndepărtarea reactivului necuplat, pentru estimarea activităţii enzimatice, se adaugă substratul cromogen al enzimei → reacţia de culoare dezvoltată este apreciată vizual sau spectrofotometric.- ELISAa. pentru detectarea antigenului – direct

b. pentru detectarea anticorpului – indirect

c. competitiv

- Immunoblotting (Western blot) – confirmarea infecţiei cu HIV

antigene diferite fixate pe benzi de nitroceluloză

reacţie () = lipsa hemolizei reacţie () = hemoliză

hemaglutinine hematii hemaglutinare ()hemaglutinine Ac omologi hematii sedimentare ()

Ac specific adsorbit pe suport insolubil proba în care urmărim Ag Ac marcat cu enzimă

Ag adsorbit pe suport insolubil ser în care urmărim Ac anti-Ag Ac anti-Ig marcat cu enzimă

proba de ser testată (Ac)

Ac anti-Ig umană marcat enzimatic

Reacţie colorimetrică

În sală se găsesc:- fotografie testul Eleck- ser imun anti-Yersinia enterocolitica pentru reacţia de aglutinare pe lamă şi cultură pură a tulpinii de

testat- reacţia Widal (aglutinare în tuburi)- planşă prezentare reacţia ELISA- lame curate- oglindă concavă- pipetă şi vârfuri sterile

spălare

spălare