Lp Bacterio
Transcript of Lp Bacterio
Disciplina: Microbiologie
Specializarea: Medicina generala
LP
1
Schema diagnosticului bacteriologic, virusologic, parazitologic
Nr.crt. BACTERIOLOGIE VIRUSOLOGIE PARAZITOLOGIE
METODE
DIRECTE
1 Recoltarea
produsului
patologic
Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat Diferita in functie de pp recoltat
2 Examenul
direct al
produsului
patologic
1. examen macroscopic
2. examen microscopic –
microscopie optică
o preparat nativ
o coloraţie negativă
o coloraţie simplă
o coloraţii compuse
3. evidenţierea antigenelor
bacteriene prin metode serologice
4. detectarea ADN-ului
microbian (reacţii de hibridizare,
amplificare genică – PCR)
1. examen macroscopic-nu
2. examen microscopic
o evidenţierea incluziilor
virale – microscopie optică
o microscopie electronică
3. reacţii antigen-anticorp
(evidenţierea antigenului)
4. detectarea ADN-ului - reacţii de
hibridizare, amplificare genică
(PCR)
Examen coproparazitologic:
1. examen macroscopic
2. examen microscopic
o metode directe
preparat nativ, în ser
fiziologic
preparat nativ în soluţie lugol
frotiu colorat
o metode de examinare în strat
gros
o metode de concentrare
o metode larvoscopice
o amprenta anală
3. detectarea ADN-ului - reacţii
de
hibridizare, amplificare genică
Disciplina: Microbiologie
Specializarea: Medicina generala
LP
2
(PCR)
3 Cultivare Izolarea germenului în cultură
pură
însămânţarea si cultivarea
pe medii de cultură
inoculare la animale de
laborator
Cultivarea virusurilor
culturi celulare, linii
celulare
animale de laborator
oul de găină embrionat
Cultivarea paraziţilor
însămânţarea se face
pentru paraziţii unicelulari pe
medii
încălzite la 37°C, 1sau mai multe
zile
animale de laborator
4 Identificare Identificarea germenului izolat
din cultură pură
1. cercetarea caracterelor de
cultură si morfotinctoriale
2.cercetarea caracterelor
biochimice si de metabolism
3.determinarea structurii
antigenice prin:
reacţii de aglutinare
reacţii de precipitare
reacţii de umflare a capsulei
4. tehnici de detectare a ADN
microbian
5. Determinarea patogenităţii
germenului izolat prin:
o teste in vitro
Identificarea virusului izolat
1.prin examen microscopic
2. modificările caracteristice
apărute pe
culturile celulare,
OGE
animale de experienţă
3. reacţii antigen-anticorp
4. detectare a ADN–ului -reacţii de
hibridizare, amplificare genică
(PCR)
1.reacţii antigen-anticorp
2. tehnici de detectare a ADN
microbian
Disciplina: Microbiologie
Specializarea: Medicina generala
LP
3
o teste in vivo (boala
experimentală)
5 Antibiograma DA
METODE
INDIRECTE
6 1. detectarea anticorpilor din
serul bolnavilor (anticorpii se
urmăresc în dinamică)
1. detectarea anticorpilor din
serul bolnavilor
o Seroconversia: cresterea
titrului de anticorpi în probele de ser
recoltate la interval de 10-14 zile
o (demonstrarea unei infecţii
recente, actuale
1. Detectarea anticorpilor din
serul bolnavilor
o anticorpii se urmăresc în
dinamică
reacţii biologice
cutanate de diagnostic
(IDR) - rar
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul:
Staphylococcus, Streptococcus, Enterococcus
Caracteristica generală a grupului cocilor piogeni
Familia Staphylococcaceae
Genuri-
- Staphylococcus;
- Gemella;
- Macrococcus;
- Salinicoccus;
Familia Streptococcaceae:
Genuri:
- Streptococcus;
- Lactococcus;
Familia Neisseriaceae:
Genul: Neisseria .
Caracter comun - capacitatea de a condiţiona procese supurative-distructive.
Morfologic reprezintă coci (sferici, lanceolaţi, riniformi), imobili, nesporogeni, unele
specii formează capsule.
În funcţie de caracterele tinctoriale se disting:
1. Coci gram pozitivi (Staphylococcaceae, Streptococcaceae)
2. Coci gram negativi (Neisseriaceae)
Cocii piogeni se deosebesc prin:
Caractere de cultură: exigenţe nutritive, tipul de respiraţie;
Infecţii nespecifice;
Infecţii specifice (gonoreea, scarlatina).
Familia Staphylococcaceae
Genul Staphylococcus
Se disting 2 grupuri (varietăţi):
1. stafilococi coagulazo-pozitivi - SCP - foarte virulenţi (S. aureus, S.
intermedius);
2. stafilococi coagulazo-negativi - SCN - potenţial-patogeni (aproximativ 30
specii: S. epidermidis, S. saprophyticus, S. capitis, S. haemolyticus, S. hominis).
Habitat: 20-70% din populaţie sunt purtători:
S. aureus - cavitatea nazală, intestine;
S. epidermidis – tegument;
S. saprophyticus - mucoasa uro-genitală, tegument;
Staphylococcus aureus
Caractere morfobiologice:
Caractere morfo-tinctoriale: coci gram+, în frotiu se aranjează în grămezi neregulate
(ciorchine) în perechi sau izolat. Sunt imobili, nesporogeni, necapsulaţi (uneori
microcapsule)
Caractere de cultură: facultativ anaerobi, nepretenţioşi la cultivare, cresc pe medii
uzuale, pH-7,0–7,5. Cultura apare peste 24 h de incubare la 37°C.
Medii selective cu caracter diferenţial-diagnostic:
- geloză salină (3 % NaCl) cu gălbenuş de ou (GGO);
- mediul Chapman (7,5 % NaCl, manitol);
- geloză - sânge .
Colonii S, 2-3 mm, opace, bombate, pigmentate (galben-auriu, galben-citric, alb), pe
geloză - sânge cauzează hemoliză. Pe GGO coloniile sunt înconjurate cu un halou opac
(acţiunea lecitinazei). Pe mediul Chapman coloniile sunt înconjurate de un halou galben
(fermentarea manitolului).
Caractere biochimice: catalazo - pozitivi, fermentează glucoza şi manitolul.
Factori de patogenitate
I. Factori structurali:
- peptidoglicanul (induce secreţia citokinelor de către celulele limfocitare,
responsabile de starea de şoc);
- acizii lipoteichoici (induc o stare de hipersensibilitate tardivă);
- proteina A (asigură fixarea Fc al IgG, împiedică opsonizarea şi fagocitoza);
- microcapsula, rol antifagocitar;
- adezine, proteine care asigură fixarea S. aureus pe diverse molecule plasmatice
ale gazdei, ulterior adeziunea la ţesuturi:
a. proteine fixatoare de fibronectină şi laminină. Fibronectina este prezentă pe
suprafeţe epiteliale şi endoteliale, precum şi în cheaguri sanguine.
b. “Clumping factor”, proteina fixatoare de fibrinogen. Asigură aderarea la
cheaguri şi ţesuturi lezate, protejează stafilococii de fagocitoză.
c. proteina fixatoare de colagen. Tulpinile ce posedă astfel de adezine cauzează
osteomielite şi artrite septice.
II. Toxine:
- α-toxina (alfa-hemolizina). Deteriorează membranele celulelor gazdei
(trombocite, monocite, hematii) prin integrare şi formarea porilor;
- ß-toxina (sfingomielinaza). Prezentă la tulpinile izolate de la bovine cu mastită.
- γ şi δ-toxine. Efect leuco - şi hemolitic;
- leucocidina, efect litic faţă de leucocite şi macrofage, factor important în procese
dermonecrotice;
- exfoliatine (epidermolizine) A şi B. Manifestă tropism cutanat.
Mecanism: se fixează de unele proteine cutanate (profilagrină şi filagrină), inducând
desprinderea intra-epidermică dintre stratum granulosum şi stratum spinosum, cu
formarea leziunilor buloase (pemphigus neonatorum, impetigo bulos, dermatită
exfoliantă/sindromul pielii opărite).
III. Coagulaze:
- coagulaza liberă - proteină extracelulară care se leagă de protrombina gazdei cu
formarea unui complex. Astfel activată, trombina determină conversia fibrinogenului în
fibrină şi coagularea plasmei. Reprezintă cauza tromboflebitelor septice şi protejează
cocii de fagocitoză;
- coagulaza legată (Clumping factor) este un determinant superficial al S. aureus
fixator de fibrinogen. Antifagocitar. Provoacă fenomenul de aglutinare a stafilococilor în
prezenţa fibrinogenului.
IV. Stafilokinaza (fibrinolizina) - activator al plasminogenului (asociat cu bacteriofagi
lizogeni). Complexul stafilokinază-plasminogen manifestă activitate proteolitică, cauzând
dizolvarea trombilor (responsabilă de localizări septice secundare).
V. Enzime de patogenitate:
- hialuronidaza – facilitează diseminarea bacteriilor
- alte enzime: proteaze, lipaze (inclusiv lecitinaza), ADN-aze, fosfataze.
Rol în diseminarea infecţiei şi producerea leziunilor.
Se disting multiple serotipuri de S. aureus, iar receptorii pentru bacteriofagi permit
clasificarea în lizotipuri (fago-variante).
Epidemiologia infecţiilor stafilococice
Sursa de infecţie:
- omul bolnav sau purtători sănătoşi de germeni. Rareori - bovinele bolnave de
mastită;
- contact direct sau diseminare manuportată;
- contact indirect (alimente, praf, îmbrăcăminte).
Factori favorizanţi: diabet, tratament imunosupresiv, arsuri, plăgi,
Formele clinice ale infecţiilor cu S. aureus:
- infecţii cutanate şi subcutanate: foliculite, furuncule, cărbuncule, abcese,
hidrosadenite, mastită, panariţiu, infecţie de plagă (frecvent de origine nosocomială);
- exfoliatina determină epidermoliza buloasă (dermatita exfoliativă, sindromul
pielii opărite, sindromul Lyel) la copii, pemphigus neonatorum la nou-născuţi (boala
Ritter) şi impetigo bulos la mature;
- infecţii ale mucoaselor: mastoidite, sinuzite, otite, angine;
- infecţii ale seroaselor: artrite, pleurezie, peritonită, meningită;
- infecţii osoase: osteomielită, spondilodiscită, infecţie de proteză;
- infecţii viscerale: abces pulmonar, cerebral, flegmon perirenal, pielonefrite.
S. aureus poate coloniza corpuri străine (catetere, proteze, etc). După implantare ele sunt
acoperite cu proteine matriciale ale organismului (fibronectină, fibrinogen, laminină).
Stafilococii prin adezinele sale se leagă specific de aceste proteine matriciale, se
multiplică şi secretă exopolizaharide, constituind un biofilm. El protejează bacteriile de
AB, anticorpi, celule imunitare şi constituie un focar de diseminare a infecţiei.
Septicemii şi endocardite. Cauzate şi întreţinute de un focar infecţios primar (infecţie
cutanată, pneumonie) complicat de tromboflebită.
În mediu spitalicesc au caracter nosocomial (catetere intravasculare, proteze valvulare
cardiace, articulare, stimulatoare cardiace).
Risc major de metastaze septice (endocard, oase, articulaţii)
Sindromul şocului toxic stafilococic: febră, hipotensiune arterială, erupţie scarlatiniformă
în special pe palme şi plante, urmată de descuamare, stare de şoc, leziuni viscerale
(cerebrale, renale, hepatice, musculare). Mortalitate 3-5%.
Descris în 1978 în SUA la femei care utilizau tampoane periodice şi sufereau de vaginită
cu S. aureus. Tulpini responsabile de acest sindrom pot fi izolate din diverse leziuni
stafilococice.
Intoxicaţii alimentare (doza toxică - 1μg la 100 g aliment). Incubaţie scurtă (1-6 ore).
Vome, diaree, deshidratare, absenţa febrei
Enterita fulminantă - gravitate extremă şi mortalitate înaltă. Consecinţa unei
antibioterapii, urmare a multiplicării tulpinii de stafilococ producător de enterotoxină în
intestin.
Infecţii cauzate de SCN
S. epidermidis produce un polizaharid de adeziune (glicocalix), care-i permite fixarea pe
implante din polimeri sintetici, metalici, din ceramică (formarea unui biofilm).
S. epidermidis determină infecţii asociate cu un corp străin (proteze, catetere, sonde de
intubare, stimulatori cardiaci) frecvent de origine nosocomială (endocardite, endoftalmii,
peritonite la pacienţi cu dializă peritoneală, bacteriemii, infecţie de plagă).
S. saprophyticus este responsabil de 10-20% din infecţiile acute ale tractului urinar, în
special cistită la femei tinere. La bărbaţi rareori - uretrită.
S. lugdunensis - infecţii de plagă, endocardite.
Imunitatea antistafilococică este mixtă: celulară şi umorală.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Staphylococcus
Diagnosticul de laborator este numai bacteriologic, direct, etapele fiind următoarele.
Recoltarea şi transportul produsului patologic:
- se face cât mai repede, la debutul bolii, înainte ca pacientului să primească
antibiotice/chimioterapice, corect, asepsie;
- se recoltează: secreţii purulente (în abcese, celulite, infecţii ale plăgilor şi
arsurilor), lichide (prin puncţie sinusală, articulară, pleurală); exsudat nazal sau exsudat
faringian, sânge, LCR, spută, urină, secreţie vaginală, lichid de vărsătură, materii fecale.
Diagnostic direct:
Examinarea microscopică a p.p. (Gram, RIF) cu realizarea a minim 2 frotiuri pe care le
colorăm cu A.M. şi Gram:
- se examinează la microscop şi se notează prezenţa celulelor (unele fiind
modificate), prezenţa celulelor inflamatorii (leucocite) şi prezenţa cocilor gram-pozitivi,
cu diametrul de 0,5-1,5 μ, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi
neregulate, intra sau extraleucocitar.
Cultivarea pe medii de cultură a p.p. se face pentru a obţine colonii izolate (cultură pură),
necesară în etapele următoare. Se folosesc medii de cultură obişnuite. Coloniile sunt de tip
S, de 1-3 mm, pigmentate (auriu). Stafilococii se pot multiplica pe medii hiper clorurate,
tolerând o concentraţie de NaCl (mediul Chapman, pentru p.p. contaminate).
Identificarea microorganismului implicat patogenic se va realiza pe baza:
• caracterelor morfo-tinctoriale: coci gram-pozitivi, 0,5-1,5 μ., dispuşi în lanţuri
scurte, perechi, izolaţi sau în grămezi neregulate;
• caracterelor de cultură: colonii de tip Sv pigmentate auriu;
• caracterelor biochimice: fermentează zaharuri cu producere de acid (S. aureus
este manito-pozitiv); sunt catalazo - pozitivi;
• caracterelor antigenice;
• caracterelor de patogenitate: se recomandă îndeosebi efectuarea testul
coagulazei;
• sensibilităţii la bacteriofagi (în centrele de referinţă).
• altor caractere (în centre de referinţă: studiul acizilor graşi celulari, hibridarea
moleculară, ribotipie, teste biochimice extinse, identificarea toxinelor, identificarea prin
biologie moleculară a rezistenţei la antibiotice etc.).
Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
Diagnostic indirect (serologic)
Se examinează seruri sanguine pentru depistarea anticorpilor anti-stafilolizine-alfa (titru>
2 UI/ml) - în caz de infecţii profunde sau cronice sau anti-acizi teichoici (titru> 1:16) - n
caz de endocardite sau focare inaccesibile.
Familia Streptococcaceae:
Genuri:
- Streptococcus: fragili şi exigenţi la cultivare;
- Lactococcus: anterior streptococi din grupul N.
Genul Streptococcus
Reuneşte specii facultativ anaerobe/anaerobe - aerotolerante caracterizate prin morfologie
tipică (coci Gram+ în lanţuri, imobili, nesporogeni, capsulaţi), metabolism fermentativ şi
lipsa catalazei.
Clasificarea streptococilor:
1. După aspectul hemolizei pe geloză - sânge:
- streptococi alfa-hemolitici (hemoliză incompletă, zonă verzuie în jurul
coloniilor);
- streptococi beta-hemolitici (hemoliză completă, zonă clară în jurul coloniilor);
- streptococi nehemolitici (gamma-hemoliză):
2. Clasificarea imunologică Lancefield:
După antigenul polizaharidic C din peretele celular se disting 20 grupe serologice (A - H,
K - W). Streptococii care nu posedă acest Ag nu se încadrează în clasificarea Lancefield
(S. pneumoniae). Ei se identifică după caractere de cultură şi biochimice.
3. După habitat şi patogenitate:
- streptococi piogeni, virulenţi, beta-hemolitici (aparţin grupurilor A, B, C, G);
- streptococi orali, comensali, nehemolitici sau alfa-hemolitici, negrupabili după
Lancefield;
- streptococi fecali, specii comensale sau condiţionat patogene ale tractului
digestiv uman şi animal;
- streptococi lactici, reprezintă flora laptelui şi produselor lactate:
Diferenţierea streptococilor patogeni de cei saprofiţi se efectuează în baza criteriilor
Sherman:
- creşterea în BP la 10 şi 45°C;
- creşterea în bulion cu 6,5% NaCl;
- creşterea în mediu cu pH 9,6;
- hidroliza esculinei pe mediu cu 40% bilă;
- liza culturii în bulion biliat;
- sensibilitatea la bacitracină şi optochină;
- hidroliza hipuratului de sodiu.
Streptococcus pyogenes (gr. A)
Bacterie strict umană, posibil portaj oro- şi nasofaringean (20%).
Caractere morfologice: lanţuri scurte sau perechi de coci sferici Gram+, imobili,
capsulaţi, nesporogeni.
Caractere de cultură: facultativ-anaerobi, cultivă pe medii elective. Pe geloză - sânge,
după 18-24 ore incubare la 37° C - colonii S mici (0,5 - 1mm), bombate, transparente sau
translucide, cu zonă de β-hemoliză.
În bulion glucozat, bullion - ser formează depozit la fundul şi pe pereţii tubului.
S. pyogenes este sensibil la bacitracină.
Structura antigenică a S.pyogenes (Lancefield-Griffith):
- polizaharidul C din peretele celular, specific pentru grupul A (după Lancefield).
Poate fi identificat în RP, latexaglutinare, co-aglutinare;
- proteinele de suprafaţă: M (fimbriale), R şi T (uneori asociate cu acizii lipo-
teicoici), care permit diferenţierea S.pyogenes în 90 serotipuri (după Griffith).
Proteina M manifestă reactivitate imunologică încrucişată (mimicrie antigenică) cu
constituenţi normali ai organismului (miozină, sarcolemă, sinoviale), determinând
procese imunopatologice (manifestări post-streptococice). Ag proteice de tip se identifică
în RP (Ag M) şi RA (Ag T);
în MCP a S. pyogenes există Ag comun cu membrana bazală a glomerulilor
renali.
Factori de patogenitate
1.Factori de structură
- capsula din acid hialuronic. Efect antifagocitar;
- proteina M, adeziune, antifagocitarã;
- acizii lipoteichoici, adeziune la celule epiteliale;
- proteina F, receptor de fibronectină:
2. Toxine:
- streptolizinele O (oxigen-labilă) şi S (oxigen-stabilă). Sunt toxine citolitice. SLO
manifestă efect cardiotoxic, hemolitic. Inhibă chimiotaxisul PMN şi reduce activitatea
celulelor imunocompetente. Induce formarea Ac neutralizanţi - antistreptolizine O
(ASLO). SLS nu este imunogenă. Manifestă activitate citolitică şi leucotoxică;
- toxinele eritrogene (pirogene) A, B şi C sunt codificate de profagi. Responsabile
de scarlatină. Au activitate de superantigen, producând inflamaţie asociată cu stare de
şoc.
3. Enzime de patogenitate: hialuronidaza, streptodornaza B (ADNaza), lipoproteinaza,
streptokinaza (fibrinolizina). Facilitează diseminarea rapidă în ţesuturi.
Epidemiologia infecţiilor provocate de S. pyogenes
Sursa de infecţie: bolnavii şi purtătorii sănătoşi (faringe şi amigdale, mai rar – intestin,
tegument, vagin).
Mecanismele şi căile de transmitere:
- aerogen (picături Pflugge);
- contact direct (leziuni cutanate):
Patogeneza şi formele clinice ale infecţiilor provocate de S. pyogenes:
- infecţii ale mucoaselor;
- sfera ORL: rinite, faringite, angine eritematoase (risc de reumatism articular
acut), abcese periamigdaliene, adenite cervicale, sinusite, otite, mastoidite;
- infecţii cutanate şi subcutanate: erizipel (leziune cutanată eritematoasă, edem,
febră), impetigo (leziuni cutanate superficiale: papulă-pustulă-crustă), celulită, fasciită
necrozantă (leziuni necrotice subcutanate, durere, eritem, gangrenă, febră, şoc,
mortalitate 30% - 48 h), mionecroză (sindromul Meleney), eritemul nodos, infecţii ale
plăgilor şi arsurilor;
- scarlatină (angină streptococică însoţită de erupţie cutanată şi descuamare în
convalescenţă, enantem, febră, adenopatie);
- sindromul şocului toxic streptococic, determinat de tulpini producătoare de
toxină eritrogenă (febră, hipotensiune, erupţie generalizată, descuamare în convalescenţă,
afectarea organelor). Letalitate 30%;
- septicemii ;
- alte infecţii: endometrite, pneumonii;
- infecţii post-streptococice;
- RAA (reumatismul articular acut), mai frecvent la copii de vârstă şcolară. Apare
după infecţii faringiene repetate şi este determinată de acţiunea directă a streptolizinei,
depozite de complexe imune (RHS III), precum şi prin interacţiunea autoAc şi al Ac anti
- streptococici cu autoantigene din miofibrile, valvule cardice şi sinoviale (RHS II);
- glomerulonefrita acută (GNA). Maladie a copilului de vârstă preşcolară. Survine
după 10-20 zile de la o infecţie cutanată, mai rar faringeană. Se caracterizează prin
perturbarea funcţiei renale, edem şi hipertensiune arterială;
- patogenie: efect toxic direct, reacţii autoimune, bazate pe asemănarea unor Ag
streptococice din MCP şi membrana bazală glomerulară (RHS II şi III), persistenţa
formelor L;
- coreea (infecţie a SNC prin RHS II).
Imunitatea antistreptococică este specifică de tip, asigurată de Ac anti-proteina M. Ac
anti - eritrotoxină protejează de eritemul scarlatinos.
Streptococcus agalactiae (gr. B):
Alfa-hemolitic. Streptococ piogen animal (bovidee), ocazional găzduit de om în
rinofaringe, vagin şi intestin.
Rol în patologie:
- la gravide: infecţie urogenitală, infecţie de plagă, amniotite, endometrite, avort
sau naştere prematură;
- la nou-născut: infecţie precoce (septicemie, pneumopatie în primele 10 zile de
viaţă) sau tardivă (meningită);
- la adult: infecţie de plagă, osteo-artrite, infecţii urogenitale, septicemii,
endocardite, meningite.
Streptococi din grupul C (S. equisimilis, S. equi) şi din grupul G:
Beta-hemolitici cu rezervor animal şi uman (tegument, mucoase).
Responsabili de infecţii cutanate, faringite, septicemii post-partum, infecţii osteo -
articulare, meningite, pneumopatii, endocardite. Rareori urmate de GNA. Excepţional pot
cauza scarlatină.
Streptococii din grupul D: S. bovis, S. equinus
Fac parte din flora comensală a tubului digestiv al omului şi animalelor.
Rol în patologia umană: endocardite, septicemii neonatale, cholecistite, peritonite,
infecţii urinare, meningite, osteomielite vertebrale, artrite, abces cerebral.
Streptococii negrupabili (lipsiţi de antigene polizaharidice de perete): S. mitis, S.
mutans, S. oralis, S. sanguis
Prezenţi în cavitatea bucală, joacă rol în geneza cariei dentare, în infecţii materno-fetale,
bacteriemii şi endocardite.
Streptococcus pneumoniae:
- habitat natural: mucoasa tractului respirator superior. 5-10% adulţi şi 20-40% copii
- purtători sănătoşi de germeni;
- caractere morfo - tinctoriale: diplococi ovoizi sau lanceolaţi, Gram+, imobili,
nesporogeni, capsulaţi.
- caractere de cultură: se cultivă pe medii elective (geloză - sânge, geloză - ser, bulion -
ser), pH optimal 7,8. Pe geloză - sânge, peste 18-24 ore de incubare la 35-37°C în
atmosferă cu 5-10% CO2, formează colonii S mici (0,5-1,5 mm), opace, bombate, cu o
zonă de hemoliză alfa (verzuie). Din cauza autolizei pneumococilor centrul coloniilor se
deprimă. Tulpinile necapsulate formează colonii R.
Structura antigenică:
- antigene capsulare, de origine polizaharidică. Permit clasificarea pneumococilor în
90 serotipur;
- antigenul proteic R, mascat de Ag capsulare;
- antigenul proteic M.
Factori de patogenitate:
- capsula (rol antifagocitar);
- adezine;
- sIgA - protează;
- acidul lipoteichoic (implicat în reacţii inflamatoare cu semne generale şi leziuni
tisulare, posibil şoc);
- autolizinele (eliberarea unor factori bacterieni cu rol în virulenţă);
- pneumolizina (hemolizina). Efect citolitic şi citotoxic asupra celulelor epiteliale
şi endoteliale. Reduce activitatea bactericidă a PMN;
- hialuronidaza;
- neuraminidaza:
S.pneumoniae se diferenţiază de alţi streptococi prin:
- sensibilitatea la optochină
- liza culturii de pneumococi în prezenţa sărurilor biliare (activarea autolizinelor)
– testul de solubilitate în bilă;
- patogenitatea pneumococilor pentru şoarece;
- prezenţa capsulei;
- hidroliza inulinei.
Epidemiologia infecţiilor cu pneumococi:
- sursa de infecţie - purtătorii sănătoşi (naso-faringe) sau bolnavii.
- calea de transmitere - aerogenă.
Infecţiile cauzate de S.pneumoniae:
- infecţii respiratorii: pneumonia francă lobară acută, broncho-pneumonii,
bronşite, otite, sinusite, mastoidite;
- meningite (în special la copii);
- bacteriemii cu artrite, peritonită, pericardită, endocardită.
Imunitatea antipneumococică este specifică de tip, prin Ac anti-capsulari.
Diagnosticul de laborator al infecţiilor streptococice Prelevate: în funcţie de forma clinică (tampon faringean sau cutanat, puncţie a ţesutului
sub - cutanat, LCR, puroi, sânge, etc)
Metodele de diagnostic:
1. Diagnosticul direct:
- examenul microscopic (frotiu Gram – orientativ, RIF);
- examenul bacteriologic (de bază);
- detectarea serologică a Ag specifice (Ag capsulare pot fi identificate în reacţii
de latexaglutinare, “reacţia de umflare a capsulei” cu Ac specifici);
- identificarea ADN prin tehnici de biologie moleculară.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Streptococcus: în faringita
streptococică
Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.
Recoltarea şi transportul p.p:
- produs patologic: secreţia purulentă de la nivelul faringelui;
- se recoltează dimineaţa înainte ca pacientul să mănânce şi rar după ce s-a spălat pe dinţi,
fără să fi utilizat gargarisme cu diferite soluţii;
- dacă aceste condiţii nu au fost respectate, recoltarea se va face după minim 4 ore;
- produsul recoltat trebuie prelucrat cât mai repede posibil, nu trebuie să treacă mai mult
de 2-3 ore de la recoltare până la cultivare (preferabil 1-2 ore), în caz contrar este necesar un
mediu de transport.
Examinarea microscopică a p.p.:
- se notează prezenţa celulelor, celulelor inflamatorii (leucocite) şi a cocilor Gram-
pozitivi aşezaţi separat, în perechi sau în lanţuri.
Cultivarea:
- se face pe agar – sânge;
- cultura apare în 18-48 ore;
- coloniile au aspect de tip S, sunt mici şi înconjurate de o zonă de fi-hemoliză (clară, cu
diametrul mai mare decât diametrul coloniei).
Identificarea se face pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale (coci Gram-pozitivi, dispuşi în lanţuri;
• de cultură (colonii de tip S, 0,5-1 mm, înconjurate de P-hemoliză);
• biochimice (hemoliză de tip beta, multiplicarea streptococilor de grup A este inhibată de
bacitracină şi sunt rezistenţi la trimetoprim-sulfametoxazol);
• antigenice (determinarea polizaharidului specific de grup, determinarea tipurilor M).
Antibiograma nu este necesară decât la pacienţii alergici la beta-lactamine sau în cazuri
speciale. Sunt sensibili la penicilină.
Dacă se doreşte confirmarea (retrospectiv) unei infecţie invazivă sau trebuie să se confirme
bolile poststreptococice, se apelează la reacţia ASLO.
Diagnosticul de laborator serologic
Diagnosticul serologic este util pentru:
- certificarea etiologiei bolilor poststreptococice (RAA, GNA);
- identificarea unei eventuale stări de hipersensibilitate;
- diagnosticul retrospectiv al unei infecţii streptococice;
- evaluarea evoluţiei clinice şi eficacităţii tratamentului.
Diagnosticul serologic se realizează de obicei prin reacţia ASLO, care identifică titruri
ale anticorpilor anti-streptolizină O. Testarea se face în dinamică, pe seruri recoltate la
interval de 7-10 zile. Pentru zona noastră geografică se acceptă ca normal un titru de 200
(maxim 250) unităţi ASLO. Este strict necesară realizarea controlului intern şi extern de
calitate. Există şi alte teste care se folosesc mai rar în ţara noastră.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Streptococcus pneumoniae
Sunt coci Gram-pozitivi, alungiţi, dispuşi în diplo, încapsulaţi, nesporulaţi, imobili.
Pneumococii sunt aerobi, facultativ anaerobi. Pe geloză - sânge determină α-hemoliză.
Creşterea este favorizată de 5% CO2. Streptococcus pneumoniae este condiţionat
patogen. Poate produce infecţii ale tractului respirator superior şi inferior, urechii medii,
sinusurilor, dar şi meningită, endocardită.
Diagnosticul microbiologic în pneumonia pneumococică
Diagnosticul pneumoniei este clinic, radiologic şi bacteriologic (direct).
Recoltarea şi transportul p.p.: spută cu respectă regulilor impuse pentru recoltarea şi
transportul produselor patologice.
Examinarea microscopică a p.p.:
- se notează prezenţa celulelor (macrofage alveolare), celulelor inflamatorii (PMN)
şi cocilor Gram-pozitivi, în diplo, cu o capsulă comună.
Cultivarea:
- se face pe geloză - sânge, cu incubare în atmosferă de 5% CO2 la temperatura de
35-37°C,
- apar colonii de tip S sau de tip M, cu α-hemoliză.
Identificarea se realizează pe baza:
• caracterelor morfo - tinctoriale: coci gram-pozitivi, alungiţi, lanceolaţi, în diplo,
capsulaţi;
• caracterelor de cultură: colonii de tip S sau M, înconjurate de o zonă de a-
hemoliză;
• caracterelor biochimice: fermentarea inulinei, autoliza accelerată de săruri
biliare (testul bilolizei), sensibilitate la optochin (etil-hidrocupreină);
• caracterelor antigenice: folosim seruri specifice anti-K polivalente şi
monovalente, în reacţia de umflare a capsulei.
• caracterelor de patogenitate: inoculare la şoarecele alb.
Antibiograma este obligatorie şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice. Pentru
verificarea sensibilităţii la penicilină se utilizează microcomprimate cu oxacilină.
Genul Enterococcus
Definiţie. Încadrare
Germenii din genul Enterococcus sunt coci Gram-pozitivi, ovali sau coco-bacili, dispuşi
izolat, în perechi sau lanţuri scurte. Sunt aerobi facultativ anaerobi, imobili, nesporulaţi,
catalazo-negativi, oxidazo-negativi. Enterococii au fost iniţial incluşi în grupa D
Lancefield a genului Streptococcus. În 1984, pe baza diferenţelor genetice, prin
hibridarea ADN-ADN, genul Enterococcus a fost separat din genul Streptococcus. În
prezent genul Enterococcus cuprinde 19 specii dintre care 3 sunt mai frecvent implicate
în patologia umană: E. faecalis, E. faecium şi E. durans (tabel I).
Caractere generale
Habitat: sunt componenţi ai florei comensale a tractului digestiv şi genito-urinar, al
omului şi animalelor de unde jung în mediul extern. Pot fi prezenţi, de asemenea în
tractul biliar ceea ce atestă capacitatea lor de a supravieţui la concentraţii mari de bilă.
Supravieţuiesc în apă, sol, alimente, insecte.
Caractere morfo - tinctoriale: sunt coci sferici, ovalari sau coco-bacilari, Gram pozitivi,
dispuşi în diplo, lanţuri scurte sau izolat. Sunt imobili, necapsulaţi, nesporulaţi.
Caractere de cultură
Cresc pe medii suplimentate cu 5% sânge de berbec, incubate aerob la 37ºC, cu limite ale
temperaturii de creştere între 10ºC şi 45ºC. Pentru izolarea enterococilor din produse
patologice contaminate se folosesc medii de cultură selective: agar - bilă - esculină - azid
sau agar Columbia cu supliment de colistin şi acid nalidixic. Pe mediile solide formează
colonii de tip S, α-, β- sau nehemolitice. Pe agar cu bilă - esculină - azid formează colonii
alb-cenuşii cu halou negru iar pe mediile selective cu antibiotic coloniile sunt mai mici.
Caractere biochimice
Sunt bacterii catalază şi oxidază negative. Cresc în bulion îmbogăţit cu 6,5% NaCl,
hidrolizează esculina în prezenţa a 40% bilă sau săruri biliare, produc pirolidonil-
arilamidază, leucinaminopeptidază.
Pe baza fermentării manitolului, sorbozei, sorbitolului şi a capacităţii de hidroliză a
argininei, enterococii sunt clasificaţi în 5 grupe în cadrul cărora speciile se diferenţiază în
funcţie de fermentarea arabinozei, rafinozei şi zaharozei(tabel I). Grupa I, cuprinde 5
specii diferenţiate pe baza fermentării arabinozei, rafinozei şi a utilizării piruvatului;
Grupa II cu 5 specii identificate pe baza producerii de pigment, a mobilităţii şi a
capacităţii de a tolera teluritul; Grupa III cu 3 specii şi 2 variante recunoscute pe baza
utilizării piruvatului şi a fermentării arabinozei, rafinozei şi zaharozei; Grupa IV cuprinde
2 specii diferenţiate pe baza producerii de pigment şi a fermentării sorbitolului; Grupa V
cu 1 specie şi 3 variante cuprinde tulpini care nu descompun arginina.
Structură antigenică
Toate speciile din genul Enterococcus posedă un antigen de suprafaţă care corespunde
serogrupului D în clasificarea Lancefield a streptococilor.
Caractere de patogenitate
Patogeneza infecţiilor cauzate de enterococi este puţin cunoscută. În patogenitatea
tulpinilor de enterococ sunt implicaţi următorii factori de virulenţă:
- hemolizina/bacteriocina - o proteină codificată plasmidic cu acţiune litică pe
hematiile umane. Acţionează ca bacteriocină asupra altor coci Gram pozitivi.
- factorul de agregare - o proteină de suprafaţă, codificată plasmidic, care
determină agregarea enterococilor. Poate media aderenţa enterococilor la celulele
epiteliului urinar conferind tulpinilor capacitatea de a cauza infecţii urinare. Poate iniţia
aderenţa la ţesutul endocardic tulpinile care posedă acest factor fiind cauzatoare de
endocardită;
- gelatinaza - o peptidază extracelulară similară elastazei produsă de
Pseudomonas aeruginosa. A fost identificată la un număr mare de tulpini de enterococ
izolate de la pacienţi cu endocardită şi de la pacienţi spitalizaţi;
- acidul lipoteichoic. Tulpinile de enterococ ce posedă acidul lipoteichoic
determină un răspuns inflamator exagerat din partea gazdei. E. faecium poate avea un
înveliş subţire de carbohidrat care conferă tulpinii rezistenţă la fagocitoză.
Rezistenţa faţă de factori fizici şi chimici
Germenii din genul Enterococcus au o capacitate deosebită de a supravieţui în variate
condiţii adverse. Sunt foarte rezistenţi la antibiotice ceea ce pune probleme deosebite în
mediul de spital transformându-i în importanţi agenţi etiologici ai infecţiilor nosocomiale.
Prezintă două feluri de rezistenţă:
1. rezistenţă intrinsecă, de nivel scăzut, mediată de gene cromozomale,
netransferabilă altor bacterii;
2. rezistenţă dobândită, de nivel înalt, mediată de plasmide şi transpozoni,
transferabilă altor bacterii.
Enterococii sunt în mod natural rezistenţi la cefalosporine, sulfamide, lincosamide,
aztreonam, clindamicină, trimetoprim-sulfametoxazol şi faţă de dozele uzuale de
aminoglicozide. Au o mare capacitate de a dobândi rezistenţă faţă de unele antibiotice:
- rezistenţă de nivel înalt faţă de aminoglicozide, penicilină şi vancomicină;
- au toleranţă faţă de antibioticele cu acţiune pe peretele celular (penicilină,
vancomicină) care doar le inhibă nu le distrug;
- faţă de penicilină au dezvoltat 2 mecanisme de rezistenţă prin:
- beta-lactamază;
- modificarea afinităţii proteinei de legare a penicilinei (PLP5). Penicilinele
de semisinteză au efect bacteriostatic asupra enterococilor.
Rezistenţa dobândită faţă de vancomicină are implicaţii serioase asupra tratamentului şi
controlului infecţiilor cauzate de tulpini de enterococ vancomicino-rezistent (VRE). Se
cunosc 5 fenotipuri de rezistenţă la vancomicină codificate genetic: VanA, VanB, VanC,
VanD, VanE cele maifrecvente fiind primele două.
Fenotipul VanA manifestă rezistenţă de nivel înalt faţă de vancomicină şi teicoplanină,
este mediat de transpozonul Tn 1546. Acesta conţine 7 gene şi este prezent mai ales la E.
faecium.
Fenotipul VanB este rezistent la vancomicină şi sensibil la teicoplanină. Este mediat de
transpozonul Tn1547 prezent la E. faecium şi E. faecalis.
Fenotipul VanC prezintă rezistenţă de nivel scăzut faţă de vancomicină, este sensibil la
teicoplanină. Este mediat de 2 gene cromozomale: vanC 1prezentă constitutiv la E.
gallinarum şi vanC2 prezentă constitutiv la E. casseliflavus. Aceste gene sunt
netransferabile.
Fenotipurile VanD şi VanE sunt descrise la un număr mic de tulpini de enterococ.
Posibilitatea transferării genelor de rezistenţă de la Enterococcus la Staphylococcus
aureus (posibilă in vitro dar nesemnalată în clinică) creşte importanţa acţiunilor de
limitare a circulaţiei tulpinilor de enterococ vancomicino-rezistent.
Patogenie. Boala la om
Enterococii sunt bacterii condiţionat patogene care pot fi implicate etiologic în:
- infecţii ale tractului urinar, nosocomiale (15%) sau comunitare, la pacienţi cu
uropatii obstructive, mai frecvent la bărbaţi vârstnici;
- ocupă locul al III-lea în etiologia endocarditei subacute;
- bacteriemie la vârstnici sau la pacienţi cu imunitatea deprimată;
- infecţii mixte (asocieri cu enterobacterii sau bacterii anaerobe) ale plăgilor
chirurgicale sau ale ulcerelor de decubit, peritonite, infecţii biliare, abcese intra
abdominale. Specia mai frecvent implicată în patologia umană este E. faecalis (90%)
urmată de E. faecium (8%). Ocazional au fost izolaţi din infecţii umane tulpini de E.
raffinosus, E. durans, E. casseliflavus, E. avium.
Diagnostic de laborator în infecţiile produse cu enterococ
Produse patologice: urina, materiile fecale, secreţii din plăgi.
Semnificaţia clinică a prezenţei enterococilor în prelevatele patologice trebuie stabilită
cu grijă dată fiind uşurinţa cu care contaminează prelevatele.
Examenul microscopic este util pentru prelevatele în mod curent sterile.
Izolarea bacteriei se face pe agar cu sânge de berbec sau pentru prelevatele contaminate
pe medii selective: agar bilă - sculină - azid sau medii cu supliment selectiv colistin +
acid nalidixic pe care sunt inhibate bacteriile Gram negative.
Identificarea se face pe baza caracterelor microscopice, biochimice.
Identificarea preliminară se face pe baza următoarelor reacţii pozitive:
- testul la bilă - esculină;
- toleranţa la 6,5% NaCl;
- producerea de pirolidonil-arilamidază, leucinaminopeptidază;
- sensiblitate la vancomicină.
Identificarea definitivă are la bază:
Caracterele fenotipice:
- fermentarea zaharurilor utilă în încadrarea în grupe şi pentru identificarea speciilor
în cadrul grupei;
- hidroliza argininei;
- testul toleranţei la telurit;
- testul mobilităţii;
- pigmentaţia;
- utilizarea piruvatului din mediul de cultură
Identificarea unor markeri epidemiologici care permit tiparea şi subtiparea tulpinilor de
enterococ:
- metode clasice: bacteriocinotipia, lizotipia,antibiotipia, serotipia;
- metode moleculare: determinarea profilului plasmidic, analiza endonucleazei de
restricţie a ADN-genomic, analiza profilului de macrorestricţie prin electroforeză în câmp
pulsat.
Antibiograma este obligatorie, după izolarea şi identificarea tulpinii de enterococ şi se
efectuează testând antibioticele: beta-lactamice, aminoglicozide, glicopeptide. Este
indicată determinarea CMI ş i a producerii de beta-lactamază în vederea conducerii unui
tratament eficient care să ducă la vindecarea pacientului şi totodată să evite selectarea de
tulpini rezistente.
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de enterobacterii:
Escherichia coli, Klebsiella, Proteus, Shigella, Salmonella
Familia Enterobacteriaceae cuprinde:
bacterii condiţionat patogene: Escherichia coli, Klebsiella, Proteus;
bacterii patogene: Shigella, Salmonella.
Patogenie şi produse patologice
Escherichia coli spp. produc:
infecţii ale tractului intestinal (enterocolite). În aceste infecţii sunt implicate
tulpinile patogene de Escherichia coli: EPEC, EHEC, EIEC, EAEC, EAggEC.
Produsele patologice (p.p.) sunt reprezentate de: materii fecale, bilă, alimente, vărsături;
infecţii extraintestinale:
- infecţii urinare (UPEC) - pp: urină;
- infecţii intra-abdominale şi ale plăgilor - pp: puroi;
- meningită - p.p.: LCR;
- bacteriemie - p.p.: sânge.
Klebsiella spp. (K. pneumoniae, K. oxytoca, K. ozaenae, K. rhinoscleromatis) produc:
pneumonii (K. pneumoniae) - p.p.: spută;
infecţii urinare (K. pneumoniae, K. oxytoca) - p.p.: urină;
infecţii din sfera ORL: ozena (K. ozaenae), rinoscleromul (K. rhinoscleromatis) -
p.p.: secreţii nazale;
infecţii ale ţesuturilor moi, ale urechii medii - p.p.: puroi;
infecţii digestive - p.p.: materii fecale, bilă, vărsături, alimente;
meningită, septicemie - p.p.: LCR, sânge.
Proteus spp. (P. mirabilis, P. vulgaris) sunt implicate în:
toxiinfecţii alimentare - p.p.: materii fecale, vărsături, alimente;
infecţii urinare - p.p.: urină;
meningită - pp: LCR;
abces cerebral (P. mirabilis) - p.p.: puroi;
pneumonii - p.p.: spută;
infecţii din sfera ORL: - p.p.: secreţii nazale;
septicemie - p.p.: sânge.
Shigella spp. (S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei) produc:
dizenteria bacilară - p.p.: materii fecale emise spontan (recoltate pe sondă Nelaton de la
purtători), vărsături, alimente.
Salmonella spp. (S. typhi, S. paratyphi, S. enteritidis) produc:
salmoneloze: febre tifo-paratifoide;
salmoneloze digestive: toxi-infecţii alimentare, gastro-enterite;
manifestări extra-digestive:
- bacteriemii nontifoidice;
- infecţii pleuro-pulmonare;
- afecţiuni osteo-articulare: osteite, osteomielite, artrite septice, etc.;
- infecţii nozocomiale;
- infecţii cardio-vasculare: pericardite, arterite;
- infecţii urinare;
- infecţii abdominale: colecistite, abces al ficatului, splinei;
- infecţii ale SNC: meningite, abces al creierului, abces epidural, etc.
Produsele patologice se recoltează în cazul:
febrei tifoide (S. typhi). de la bolnavi:
în prima săptămână - sânge;
în a II-a săptămână. - materii fecale, bilă, suc duodenal;
în a III-a săptămână - materii fecale, sânge pentru serodiagnostic;
în a IV-a săptămâmă - sânge pentru serodiagnostic;
- de la purtător: materii fecale după administrarea unui purgativ, bilă;
gastroenterite (S. enteritidis) - p.p.: materii fecale, vărsături, alimente;
septicemii - p.p.: sânge.
Diferenţierea enterobacteriilor
Familia Enterobacteriaceae include germeni care se pot multiplica pe medii simple, sunt
aerobi sau facultativ anaerobi, utilizează glucoza cu sau fără producere de gaz, sunt
oxidazo-negativi şi catalazo-pozitivi. Formează colonii de tip „S” („R” în cazul culturilor
"vechi") sau „M” (pentru speciile capsulate), pot fermenta lactoza (Escherichia coli,
KlebsielIa spp.) sau sunt lactoză negativi (Salmonella spp., Shigella spp.). Diferenţierea
enterobacteriilor se realizează prin:
Examen direct:
se efectuează doar din produse patologice normal sterile;
se pot evidenţia bacili G-, ciliaţi (Escherrichia coli, Proteus) sau capsulaţi
(Klebsiella).
Izolare:
- pe medii selectiv-diferenţiale pentru enterobacterii (Leifson, Levine, SS - pentru
Shigella şi Salmonella);
- pe medii diferenţiale (geloză lactozată);
- pe medii geloză sânge.
Identificare: caractere morfotinctoriale
Bacteria Coloraţie Dispoziţie Cili Capsulă
Escherichia coli Bacili G- Neregulat Peritrichi -
Klebsiella Cocobacili G- Diplo - +
Proteus Bacili polimorfi G- Neregulat Peritrichi -
Shigella Bacili G- Neregulat - -
Salmonella Bacili G- Neregulat Peritrichi -
caractere de cultură
Bacteria Cultivare pe mediu de cultură solid
Escherichia coli Formează colonii tip „S”, este lactozo +
- pe geloză - lactoză produce colonii galbene;
- pe mediu Levine formează colonii violete cu luciu metalic;
- pe geloză-sânge formează colonii cenuşii, unele tulpini produc
hemoliză β;
- pe MacConkey cu D-sorbitol (EHEC nu fermentează sorbitolul
sau îl fermentează tardiv). Coloniile suspecte, sunt de tip „S”, 1-3
mm, necolorate (coloniile sorbitol-pozitive au o culoare roz).
Klebsiella Formează colonii mari de tip „M”, cu aspect de "curgere" pe
suprafaţa mediului de cultură (tendinţă de confluare). Este lactozo
+.
Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt selective şi
este parţial inhibată pe cele moderat selective.
Proteus - pe medii cu bilă produce colonii tip „S”, transparente, lactozo - ;
- pe medii fără bilă nu formează colonii. Prezintă fenomen de
căţărare, colonii cu caracter invadant, margini dantelate ce pot
acoperi toată suprafaţa mediului;
- fenomenul Dienes:
- dacă tulpinile provin de la aceeaşi specie şi sunt
însămânţate pe aceeaşi placă prin creştere se suprapun;
- dacă tulpinile sunt diferite, între ele rămâne o zonă de
demarcaţie.
Shigella Formează colonii tip „S”, transparente, lactozo -
Salmonella Formează colonii tip „S”, transparente, lactozo -;
colonii “ochi de pisică” pe mediu SS.
caractere biochimice
- importante pentru diferenţierea enterobacteriilor;
- toate descompun glucoza:
enterobacteriile condiţionat patogene sunt L+:
- pe geloză lactozată formează colonii galbene, culoarea mediului virează în
galben;
- pe mediu Leifso produc colonii roşii, culoarea mediului virează în roşu;
enterobacteriile patogene sunt L-:
- colonii transparente, culoarea mediului rămâne neschimbată.
Caractere biochimice
Bacteria TSI MIU Simmons
G L Z H2S Uree I M
Escherichia coli + + + - - + + -
Klebsiella + + + - + V - +
Proteus + - - + + V + +
Shigella + - - - - V - -
Salmonella + - - + - - + +
Identificare antigenică
Bacteria Tipul de reacţii
Escherichia coli Reacţii de aglutinare pe lamă:
- cu seruri polivalente;
- apoi ce seruri monovalente pentru EPEC, EIEC, EHEC
(O157H7).
Klebsiella Reacţia de umflare a capsulei (determină prezenţa antigenului K)
Proteus Reacţii de aglutinare pe lamă anti O şi anti H
Shigella Reacţii de aglutinare pe lamă cu seruri specifice de grup
Salmonella Reacţii de aglutinare pe lamă:
- cu seruri polivalente de AgO;
- cu seruri monovalente pentru serogrupurile A, B, etc.;
- cu seruri monovalente pentru serotip;
- determinarea antigenului Vi.
Determinarea patogenităţii
Klebsiella pneumoniae inoculată la şoareci intraperitoneal sau subcutanat determină
septicemie mortală;
Shigella - testul keratoconjunctivitei la cobai (testul Sereny).
Antibiograma
se efectuează la toate tulpinile isolate;
tulpinile de Proteus spp. pot prezenta multirezistenţă, mai ales cele izolate din
infecţii nozocomiale.
Diagnostic serologic
În febra tifoidă: detectarea şi titrarea anticorpilor faţă de Ag O, Ag H ai S. typhi şi
paratyphi A, B (reacţia Widal).
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de Escherichia coli
Genul Escherichia cuprinde în bună parte germeni comensali. Specia reprezentantivă este
Escherichia coli. Deşi, majotitatea tulpinilor de E. coli sunt saprofite sau condiţionat
patogene, există şi tulpini patogene (patotipuri: E. coli enteroagregativ, E. coli
enterohemoragic, E. coli enteroinvaziv, E. coli enteropatogen, E. coli enterotoxigen, E.
coli aderent difuz). Diagnosticul de laborator este bacteriologic, direct.
Diagnosticul de laborator microbiologic în infecţiile cu localizare digestivă
Recoltarea şi transportul se efectuază cu respectarea regulilor impuse pentra aceste
operaţii. Se recoltază materii fecale, lichid de vărsătură etc.
Examinarea macroscopică este urmată de examen de laborator. În cazul infecţiei
produsă de E. coli enterohemoragic (EHEC), materiile fecale pot avea aspect hemoragic,
cu lambouri de mucoasă epitelială. De obicei se face frotiu. Examinarea se face între
lamă şi lamelă şi se pot observa hematii şi PMN.
Cultura. Cultivată pe MacConkey cu D-sorbitol, tulpina EHEC nu fermentează sorbitolul
sau îl fermentează tardiv. Coloniile suspecte, sunt de tip „S”, 1-3 mm, necolorate
(coloniile sorbitol pozitive au o culoare roz).
Identificarea se face pe baza:
- caracterelor morfotinctoriale: bacili gram-negativi;
- caracterelor de cultură: colonii de tip „S”, cu caracterele menţionate mai sus;
- caracterelor biochimice (se examinează numai acolo unde sunt condiţii de
biosiguranţă, conform unei Directive Europene): fermentează glucoza (cu producere de
gaz), lactoză-pozitivi, nu fermentează (sau fermentează tardiv) sorbitolul, nu produc H2S,
pot produce indol, sunt urează-pozitivi, mobili (există şi tulpini imobile) etc.;
- caracterelor antigenice: prin reacţii de aglutinare sau latex aglutinare (seruri
monovalente anti O157 şi anti H7).
Antibiograma este recomandată pentru supravegherea apariţiei fenomenului de
rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice; se realizează prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul în infecţiile urinare În principal se recoltează urină. În funcţie de forma clinică se poate recolta şi sânge (în
pielonefrita acută) sau chiar şi LCR. Înainte de recoltarea urinei, pe lângă regulile impuse
este necesar să se realizeze toaleta locală. Atunci când nu se poate recolta prima urină de
dimineaţă, trebuie aşteptat pentru recoltare 3-4 ore după micţiune. Dacă p.p. nu este
prelucrat imediat (în maxim 30 de minute după recoltare), trebuie menţinut la
temperatura de refrigerare, iar transportul trebuie realizat la +4°C. Se recoltează urina
"din mijlocul jetului". Există şi alte tehnici de recoltare, neinvazive sau invazive (puncţie
şi aspiraţie suprapubiană, cateterizare uretrală, cu riscurile respective).
Examenul macroscopic (urina poate fi tulbure) implică pregătirea „sedimentului urinar".
Examinarea preparatului se face între lamă şi lamel, stabilindu-se numărul de bacterii şi
respectiv numărul de PMN pe câmp (dacă există leucociturie).
Cultura. Pentru cultivare se pot utiliza mai medii diferite. Se face o urocultură cantitativă
pentru determinarea numărului de bacterii/ml de urină. Urina se diluează 1/1.000 şi apoi
se însămânţează 0,1 mililitri de urină diluată. Pentru calcul numărului de bacterii/mL
urină, numărul de colonii apărute după cultivare se multiplică cu 10 şi respectiv cu 1000.
Interpretare urocultură cantitativă: dacă numărul de bacterii/ml este mai mare de
100.000, se consideră urocultura ca fiind pozitivă. Lipsa coloniilor sau un număr de
maxim de 10.000 bacterii/ml, semnifică o urocultură negativă.
Dacă urocultură este pozitive, bacteria izolată se identifică pe baza caracterelor prezentate
mai sus şi se tratează pacientul conform antibiogramei.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Klebsiella
Bacteriile din genul Klebsiella sunt enterobacterii imobile, nesporulate. Degradează
glucoza cu producere de gaz şi fermentează lactoza. Specia tip este Klebsiella
pneumoniae (bacili Gram negativi, capsulaţi). Este un microb condiţionat patogen. Poate
produce TLA de tip infecţios, infecţii ale tractului respirator superior, infecţii urinare
etc., inclusiv infecţii nosocomiale.
Pentru diagnostic, se ia ca exemplu cazul de pneumoniei produse de Klebsiella
pneumoniae. Diagnosticul integral include elemente clinice, paraclinice şi de laborator;
diagnosticul bacteriologic permite stabilirea etiologiei şi tratamentului corespunzător.
Recoltarea şi transportul preparatului patologic se face cu respectarea regulilor
cunoscute. Se recoltează spută.
Examenul macroscopic poate evidenţia aspectul mucoid, de culoare roşu închis, "în
jeleu de coacăze" al sputei.
Examenul microscopic al p.p. permite observarea prezenţei macrofagelor alveolare,
celulelor inflamatorii (PMN) şi a barililor gram negativi, de dimensiuni relativ mari, cu
capsulă (halou, vizibil).
Cultura. P.p. se cultivă pe medii de cultură obişnuite (18-24 ore, 35-37°C) şi se
examinează coloniile izolate, pentru identificare. Se recomandă utilizarea mediilor slab
selective (MacConkey), deoarece Klebsiella pneumoniae nu se dezvoltă pe medii înalt
selective şi este parţial inhibată pe cele moderat selective. K pneumoniae formează
colonii lactoză-pozitive, mari, de tip „M”, cu aspect de "curgere" pe suprafaţa mediului
de cultură (tendinţă de confluare).
Identificarea microorganismului se face pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale: barili gram-negativi, dimensiuni mari, capsulaţi, dispuşi în
lanţuri scurte, perechi sau izolaţi;
• de cultură: colonii lactoză pozitive, de tip „M”, mari (2-3 mm la 24 de ore, peste 4
mm la 48 ore), bombate, vâscoase, cremoase, în "picătură de miere", care dau aspectul de
"curgere" pe suprafaţa mediului de cultură, cu tendinţă la confluare;
• biochimice: glucoza pozitiv (cu producere de gaz), lactoză pozitiv, nu produce
H2S, imobil, urează pozitiv, indol negativ, se dezvoltă folosind citratul ca unică sursă de
C;
• antigenice: se utilizează seruri cu Ac cunoscuţi pentru identificarea tulpinilor de
Klebsiella, prin aglutinare, coaglutinare sau latex aglutinare (în laboratoare de referinţă);
• testarea sensibilităţii la bacteriofagi.
Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Proteus
Genul Proteus face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde trei specii cu
importanţă medicală: Proteus mirabilis, Proteus vulgaris şi Proteus penneri. Germenii
din genul Proteus sunt ubicuitar răspândiţi în natură, putându-se întâlni în sol, ape
reziduale, ape de suprafaţă, în materiile organice în putrefacţie, în intestinul omului, în
alimente şi în produse patologice. Sunt bacili Gram-negativi, aerobi sau facultativ
anaerobi, nu fermentează lactoza, produc urează, sunt ciliaţi peritrichi sau lofotrichi şi
foarte mobili. Sunt polimorfi: au forme variate, de la bastonaşe scurte până la forme
lungi, filamentoase. Nu prezintă capsulă şi nici spori. Sunt germeni condiţionat patogeni.
Pot produce TLA de tip infecţios, infecţii ale tractului urinar (ITU), dar chiar şi alte
infecţii (tegumentare, genitale, infecţii nosocomiale etc.).
Diagnosticul de laborator în cazul infecţiilor tractului urinar (ITU) produse de Proteus
Diagnosticul de laborator microbiologic este, bacteriologic, direct.
Recoltarea şi transportul p.p. se realizează cu respectarea regulilor impuse. Produsul
patologic este urina, care poate fi tulbure, purulentă. Transportul trebuie realizat în
maxim 30 minute, iar dacă nu e posibil, p.p. trebuie transportat "la rece" (+ 4°C).
Examenul microscopic al produsului patologic include realizarea preparatului proaspăt
între lamă şi lamelă, din sedimentul urinar. Acest tip de examinare este foarte important,
uşor de realizat, ieftin şi permite observarea unor elemente utile, care orientează
diagnosticul şi stabilirea numărului de leucocite/câmp. De asemenea, mobilitatea poate fi
evaluată.
Cultura. Bacteriile din genul Proteus se cultivă pe medii de cultură simple, nu sunt
pretentioase nutritiv. Pe geloza simplă şi pe geloză-sânge cresc avand o caracteristica
unică în familia Enterobacteriaceae de a invada mediul, fenomen numit ,,fenomen de
căţărare’’, ,,fenomen de invazie’’ sau de ,,roire’’. Din locul inocularii, valuri succesive
de cultură migrează concentric până la marginea mediului sau până la întâlnirea cu valul
migrator al altei colonii. Pentru ca rezultatul să fie pozitiv, numărul de bacterii/ml de urină
trebuie să fie >100.000.
Identificarea microorganismului se va realiza pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale: bacili gram-negativi, cu polimorfism (bacili, cocobacili, forme
filamentoase de peste 30 μm);
• de cultură:
- fenomenul de invazie (dacă însămânţăm o tulpină la periferia unei plăci Petri cu
mediu simplu, cultura se "dezvoltă în valuri concentrice", pe toată suprafaţa mediului). Pe
anumite medii selective (cu săruri biliare), invazia este inhibată şi se obţin colonii izolate,
de tip „S”, lactoză negative;
- fenomenul "liniei de demarcaţie" (dacă pe o placă cu mediu solid cultivăm 2
tulpini diferite, în 2 puncte opuse, tulpinile se vor dezvolta invadând până în apropierea
liniei de întâlnire, unde se va crea o "linie de demarcaţie" între cele 2 tulpini);
- fenomenul de "căţărare";
• biochimice: sunt microorganisme lactozo negative (alte caractere biochimice se pot
studia pe mediile mulţi test, TSI, MTU etc.), glucoză pozitive (cu formare de acid şi
gaze), produc H2S, mobile, urează pozitive, fenilalanină pozitive, se pot dezvolta folosind
citratul ca unică sursă de carbon. Specia Proteus vulgaris este singura care produce indol;
• antigenice. Speciile de Proteus prezintă:- antigen somatic O, cu specificitate de
grup şi antigen flagelar H, cu specificitate de tip.
Antibiograma este obligatorie şi se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice. Sunt,
în general, destul de rezistente la dezinfectanţi şi antiseptice obişnuite. Sunt destul de
răspîndite în mediul spitalicesc şi au rezstenţă destul de mare la antibiotice.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Shigella
Genul Shigella face parte din familia Enterobacteriaceae şi reuneşte 4 subgrupe: A.
Shigella dysenteriae (13 serotipuri), B. S. flexneri (6 serotipuri), C. S. boydii (18
serotipuri) şi D. S. sonnei (1 serotip cu 2 faze, R şi S). Sunt bacterii strict adaptate
omului, întotdeauna patogene. Sunt întâlnite în intestinul şi materiile fecale ale
bolnavului, convalescentului şi purtătorului aparent sănătos. Sunt bacili Gram-negativi,
neciliaţi, necapsulaţi, nesporulaţi. Sunt bacili gram negativi, imobili, nesporulaţi,
necapsulaţi, aerobi sau facultativ anaerobi, glucoză pozitivi (fără producere de gaz),
oxidază negativi, lactoză negativi. Subgrupele se pot diferenţia, pe baza fermentării
manitei (subgrupul A este manită negativ).
Omul reprezintă rezervorul de Shigella. Bacteriile sunt eliminate în mediul extern prin
materiile fecale, contaminând apa, alimentele, solul. Transmiterea este directă fecal-orală.
Poarta de intrare este tractul digestiv, prin consum de apa şi alimente contaminate.
Speciile mai frecvent întâlnite sunt S. dysenteriae şi S. flexneri, fiind şi cele maivirulente.
Controlul infecţiei se face prin igiena personală şi comunitară.
Produc infecţii la nivelul tractului intestinal. Dizenteria poate să apară după ingestia a
numai 10-100 bacterii. Shigella spp. pot produce şi toxiinfecţii alimentare de tip infecţios.
Shigelele produc exotoxine care acţionează ca enterotoxine (toxina Shiga în cazul
infecţiei cu Shigella dysenteriae, cu efect neurotoxic, citotoxic, enterotoxic).
Diagnosticul de laborator este bacteriologic (direct) şi trebuie stabilit rapid.
Recoltarea şi transportul p.p. (materii fecale) se efectuează cu respectarea regulilor
cunoscute.
Examenul macroscopic al materiilor fecale poate indica prezenţa unor cantităţi mici de
mucus, puroi, sânge. Transportul trebuie să fie realizat rapid (se recomandă însămânţarea
la patul bolnavului; altfel, trebuie să fie folosit un mediu de transport, Cary-Blair).
Recoltarea se poate face şi cu ajutorul sondei Nelaton, din colonul sigmoid.
Examenul microscopic al p.p. este foarte important. El poate oferi un răspuns concret,
rapid şi util. Se examinează preparatul între lamă şi lamelă, iniţial cu obiectivul 40x.
Dacă se evidenţiează numeroase PMN, mecanismul producerii bolii este de tip invaziv,
iar dacă se remarcă un procent de peste 75% PMN, alături de hematii, acest aspect este
sugestiv pentru dizenteria bacteriană.
Cultura. Prima izolare se face pe medii slab sau moderat selective şi medii diferenţiale
(ADCL, Istrate-Meitert). Dacă apar colonii lactoză negative, coloniile transparente,
lactozo-negative sunt însămânţate pe medii (TSI, MIU, MILF, Simmons-citrat, uree),
pentru identificare biochimică prezumptivă.
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, unele tulpini posedă capsulă;
de cultură: produc colonii de tip „S”, lactoză negative, 1-2 mm, transparente;
biochimice: sunt glucoză pozitivi, fără producere de gaz, lactoză negativi, nu
produc H2S, imobili, urează negativi, indol negativi (excepţie S. flexneri), oxidază
negatvi, citrat negativi, lizină negativi;
antigenice: se utilizează seruri imune polivalente anti-subgrup sau seruri imune
specifice de tip (reacţii de aglutinare pe lamă, conform schemelor de lucru). Antigenele
mai importante sunt: antigenul somatic O, care stă la baza împărţirii în 4 grupe
antigenice; Grupul A: S. Dysenteria; Grupul B: S. Flexneri; Grupul C: S. Boydii; Grupul
D: S. sonnei şi antigenul K;
testarea sensibilităţii la bacteriofagi (lizotipia) poate fi utilizată în scop
epidemiologic.
Antibiograma este recomandată. Se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată
atât în special în scopul supravegherii apariţiei unor tulpini rezistente, cât şi pentru
stabilirea tratamentului antimicrobian corespunzător.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Salmonella
Genul Salmonella face parte din familia Enterobacteriaceae şi cuprinde o singura specie,
Salmonella enterica. Aceasta specie cuprinde peste 2300 serotipuri diferenţiate pe baza
antigenelor somatice O şi flagelare H. Principalul habitat al salmonelelor este tractul
intestinal al omului şi animalelor. Aceste doua surse vor determina poluarea solului,
apelor reziduale, apelor de suprafaţă în care pot supravieţui de la câteva luni la câţiva ani,
în condiţii de temperatură şi pH favorabile.
Genul Salmonella include bacili gram negativi, aerobi facultativ anaerobi, mobili cu cili
peritrichi, necapsulaţi, nesporulaţi, nu fermentează lactoza, produc H2S, utilizează citratul
ca unică sursă de carbon. Pot produce salmoneloze minore (TIA) şi salmoneloze majore
(febra tifoidă). În cazul TIA/enterocolitelor, diagnosticul de laborator este bacteriologic,
direct. În cazul afecţiunilor sistemice, diagnosticul poate fi bacteriologic şi serologic.
Diagnosticul de laborator în infecţiile cu localizare digestivă
Recoltarea şi transportul p.p. se efectuează cu respectarea regulilor cunoscute.
Preparatul patologic este reprezentat de materii fecale.
Examenul microscopic al p.p. se face între lamă şi lamelă şi se remarcă prezenţa
granulocitelor.
Cultura. Salmonella spp. se cultivă pe următoarele medii de cultură: un mediu lichid de
îmbogăţire (bulion selenit) şi două medii selectivo-diferenţiale (MacConkey şi ADCL).
După 18-24 ore la 35-37°C, pe mediile solide pot apărea colonii bacteriene suspecte
(lactozo-negative) din care se obţine cultura pură. Cultura de 18-24 ore din bulion selenit
se repică pe medii solide. Pe mediile selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-
negative de tip „S”. Producerea de H2S, evidenţiată prin apariţia unei pete de culoare
neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească ,, în ochi de pisică’’. Pe
mediul Wilson-Blair formează colonii opace, rugoase, cu margini neregulate, negre, cu
luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru Salmonella sunt mediile cu selenit, azid de
sodiu şi bulionMuller-Kauffmann.
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
morfotinctoriale: sunt bacili gram-negativi;
de cultură: pe medii selective şi diferenţiale determină colonii lactozo-negative de
tip „S”, necolorate (pe mediu MacConkey). Producerea de H2S, evidenţiată prin aparţia
unei pete de culoare neagră în centrul coloniilor, face ca acestea să se numească ,, în ochi
de pisică’’ (pe mediu ADCL). Pe mediul Wilson-Blair formează colonii opace, rugoase,
cu margini neregulate, negre, cu luciu metalic. Mediile de îmbogăţire pentru Salmonella
sunt mediile selenit azid de sodiu şi bulionMuller-Kauffmann;
biochimice: fermentează glucoza (cu producere de gaz), sunt germeni lactoză-
negativi, produc H2S, indol negativi, lizină pozitivi şi utilizează citratul ca unică sursă de
carbon;
antigenice: reacţii de aglutinare pe lamă prin utilizarea serurilor imune cu Ac anti-
O şi ulterior Ac anti-H, cu respectarea protocolului de lucru. Salmonella prezintă trei
tipuri importante de antigene: antigenul somatic O, este rezistent la căldură şi alcool,
prezintă specificitate de grup; antigenele de suprafaţă (înveliş, antigenul Vi este un
antigen specific de suprafaţă întlânit doar la trei serovaruri Salmonella: typhy, paratyphy
C, Dublin; antigenele flagelare H, sunt proteine labile termic situate la nivelul cililor.
Fenomenul de variaţie de fază se întâlneşte la multe tipuri de salmonele, astfel putând să-
şi schimbe tipul de specificitate al flagelilor cu un altul.
LPS (lipopolizaharidul) bacteriilor din genul Salmonella este conţinut de învelişul celular
şi eliberat după liza bacteriană şi funcţionează ca endotoxină. Aceasta poate juca un rol
important în patogeneza multor manifestări clinice: febră, activarea sistemelor de
coagulare, scăderea contractilităţii miocardului, şoc septic. Patogenitatea salmonelelor
este datorată factorilor de virulenţă, adezinele şi toxinele enterotoxinele termo-stabilă
(ST), termo-labilă (LT), verotoxina (toxina Shiga-like), citotoxina implicată în invazia şi
distrucţia celulară, antigenul Vi cu rol de adezină, fimbrii.
sensibilitate la bacteriofagi.
Antibiograma este recomandată în cazul pacienţilor foarte în vârstă sau în cazul copiilor
foarte mici, prematuri, cu alte boli adăugate şi pentru supravegherea apariţiei
fenomenului de rezistenţă la antibiotice şi chimioterapice. Sunt sensibile la cloramfenicol,
streptomiocină, tetraciclină, ampicilină, dar au apărut şi tulpini plurirezistente.
Diagnosticul de laborator în febrele enterale (febra tifoidă)
Diagnosticul cert este reprezentat de izolarea şi identificarea bacteriei S. typhi din p.p.
Diagnosticul bacteriologic, direct respectă etapele prezentate anterior.
În prima săptămână de boală, p.p. este reprezentat de sânge; ulterior pot fi recolte materii
fecale, urină, lichid biliar, măduvă hematogenă etc. Dacă p.p. este reprezentat de materii
fecale, se respectă procedura indicată mai sus (există şi unele particularităţi). Coloniile de
S. typhi pot să nu prezinte centrul de culoare neagră pe ADCL. S. typhi nu produce gaz
din glucoză, H2S fiind produs în cantitate mică. Nu foloseşte citratul ca unică sursă de
carbon. Pentru identificarea AgO este necesară o inactivare prealabilă (termică). Prezenţa
AgVi poate crea probleme în identificarea AgO. Lizotipia poate fi foarte utilă. Testarea
sensibilităţii la antibiotice şi chimioterapice este indicată în toate infecţiile produse de S.
typhi.
Diagnosticul serologic se realizează cu respectarea principiile generale. Serodiagnosticul
Widal (folosind culturi vii) nu se mai practică astăzi. Tehnica actuală poartă numele de
analiză serică cantitativă (aglutinare în tuburi), în cadrul căreia se utilizează serii de
tuburi (câte o serie pentru fiecare Ag cunoscut folosit). Pentru a evidenţia Ac anti-O (TO
- S. typhi, AO - S. paratyphi A, BO - S. paratyphiB) şi anti-H (d - S. typhi, a-S. paratyphi
A, b -S. paratyphi B) se folosesc 6 serii de tuburi. Se pregătesc diluţiile, se incubează
pentru Ac anti-O timp de 18-20 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei, iar
pentru Ac anti-H timp de 2 ore la 52°C şi 10 minute la temperatura camerei şi apoi se
procedează la citirea reacţia. Un titru de 1/250 în cazul Ac anti-O şi unul de 1/2.500 în
cazul Ac anti-H sunt sugestive. Creşterea de 4 ori a titrului, la 2 determinări succesive
confirmă diagnosticul.
În cazul convalescenţilor şi purtătorilor este recomandată reacţia de aglutinare în tuburi
pentru identificarea prezenţei şi titrului Ac anti-Vi (titru mai mare de 1/40).
1
Diagnosticul de laborator al infecţiilor virale: Hepatita, infecţii
virale respiratorii, infecţia HIV/SIDA
Virusuri
Particularităţi
Virusurile reprezintă structuri acelulare cu potenţial infecţios, cu dimensiuni de ordinul
nm (20-400 nm). Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic (AN:
ADN sau ARN). Virusurile sunt lipsite de metabolism propriu, fiind paraziţi obligaţi
intracelulari. Nu cresc şi nu se divid, se reproduc în celule vii, nu pot fi cultivate pe medii
artificiale. Manifestă rezistenţă naturală la antibiotice.
Clasificarea virusurilor
- după tipul AN (cu genom ARN/ADN);
- după dimensiuni (mici: 20-50 nm; medii: 50-150 nm, mari: peste 150 nm);
- după tipul de simetrie a capsidei (helicoidală, cubică, mixtă);
- după compoziţia chimică: virusuri simple constituite din acid nucleic (AN) şi înveliş
proteic - capsida (ansamblu numit nucleocapsidă); virusuri complexe alcătuite din
nucleocapsidă şi un înveliş extern, lipoglicoproteic (supercapsidă, peplos);
- după gazdă (om, animal, insectă, bacterie);
- după sensibilitatea în mediul extern, la substanţe chimice, etc.
Diagnosticul hepatitelor virale
Hepatitele virale reprezintă probabil cel mai comun tip de infecţie virală din lume.
Cercetările asupra etiologiei acestor boli au dat rezultate remarcabile în ultimii 25 ani.
Astfel, sunt identificate şi bine caracterizate o serie de virusuri hepatotrope: virusurile
hepatitelor A, B, C, D şi E. În ultimii doi ani au mai fost descrise două virusuri cu
tropism hepatic la om: virusurile hepatitei F si G.
Diagnosticul hepatiei virale A
Hepatita A. Virusul hepatitei A (HAV) a fost descoperit în anul 1972. Este un
picornavirus (aparţine genului Enterovirus) şi se prezintă sub forma unei particule sferice
de 27 nm care conţine ARN. Viremia este de foarte scurtă durată şi, de aceea,
determinarea HAV în sânge este lipsită de importanţă. Hepatita A este cea mai uşoara
formă de hepatită, se vindecă în 99% din cazuri, se transmite pe cale orală prin apă şi
alimente infectate, mâini murdare, alimente crude consumate nespălate; virusul se
elimina prin materiile fecale; de obicei, boala se vindecă rapid şi complet, nu duce la
hepatită cronică. După o scurtă perioadă de incubaţie, virusul este excretat în fecale,
fazele preicterică şi icterică apărând la aproximativ două săptămâni. Încă de la debutul
acestor faze apar de regulă şi IgM anti-HAV şi cresc transaminazele. Nivelurile crescute
ale IgM anti-HAV sunt prezente doar în faza acută şi dispar în aproximativ 10 săptămâni.
Din acest moment, apar IgG anti-HAV care conferă protecţie. În practică se dozează doar
IgG. Din punct de vedere evolutiv este notabilă absenţa portajului cronic. Receptivitatea
la boală este generală. Profilaxia se realizează prin izolarea bolnavilor şi controlul
2
contacţilor, educaţie sanitară, protecţia apei şi alimentelor, controlul igienico-sanitar.
Există şi profilaxia specifică, în cazuri individuale, cu gamaglobulină.
Produs patologic:
- sânge, salivă - pentru evidenţierea anticorpilor;
- materiile fecale;
- biopsie din ficat pentru evidenţierea virusului.
Examen direct (nu se practică de rutină) se face din biopsie hepatică prin reacţii
imunohistochimice şi din materii fecale prin reacţii antigen-anticorp (greu evidenţiabile la
începutul bolii) pentru evidenţierea virusului din materii fecale prin ME şi evidenţierea
antigenelor virale.
Izolare: nu se practică de rutină; deşi virusul poate creşte pe linii celulare, nu produce
efect citopatic.
Diagnosticul serologic urmăreşte dinamica apariţiei anticorpilor:
- IgM: apar odată cu primele simptome de boală - ajung la titru maxim în 1-3
săptămâni, dispar în 3-6 luni;
- IgG: apar după aproximativ o lună de la infecţie, ajung la titru maxim în 3-6 luni,
apoi persistă la un nivel detectabil toată viaţa;
- anticorpii se detectează prin ELISA.
Diagnosticul Hepatitei virale B
Hepatita B este o boală de natură infecţioasă, agentul patogen fiind virusul hepatitei B
(HBV).Virusul este de tip ADN (adenovirus) (aparţine familiei Hepadnaviridae), iar
boala mai este cunoscută şi sub denumirea de hepatită serică. Particula virală de 27 nm
este alcătuită dintr-o anvelopă lipoproteică care conţine antigenul HBs şi o nucleocapsidă
centrală (miez) care conţine ADN circular şi ADN-polimerază. Capsida formează
antigenul central (HBc) căruia îi este asociat (sub formă mascată) antigenul HBe. Acesta
din urmă poate fi regăsit în sângele circulant sub formă liberă sau asociată. Mai trebuie
mentionat că antigenul HBs prezintă numeroase subtipuri. Virusul hepatitei B este
prezent în sange şi în ţesuturi, se elimină prin salivă, lacrimi, secreţii genitale, spermă,
sînge menstrual, care sunt şi principalele elementele de transmitere a bolii; se poate
transmite de la mamă la copilul nou născut în timpul sarcinii; din 100 de bolnavi adulţi cu
hepatită acută B, 95 se vindecă, 5 fac hepatită cronică şi 2 mor prin complicaţii ale
hepatitei cronice (ciroză sau cancer de ficat); dacă hepatita acută B a fost făcută în
copilarie, sub vârsta de 5 ani, riscul de a deveni purtator este de cca 90%, iar cel de
cronicizare este de 25-80%. Dacă hepatita acută a fost contractată în perioada de adult,
riscul de cronicizare este mult mai mic de 3-10%.
Produs patologic:
- sânge pentru detectarea markerilor virali (antigene şi anticorpi);
- ţesut hepatic - detectarea antigenelor virale;
- virusul se mai elimină prin secreţii genitale, salivă.
Izolare: virusul HBV nu este cultivabil.
Diagnostic:
Cei mai utilizaţi markeri virali în aprecierea evoluţiei sau nu a infecţiei cu virus B sunt:
3
Antigenul HBs (Ag HBs) o proteina de la suprafaţa virusului B al hepatitei:
- apare la 4 săptămâni de la contactul cu virusul B;
- în hepatita cronică persistă mai mult de 6 luni;
- dispare în caz de vindecare dar uneori persistă în organism chiar dupa vindecare,
situaţie numită de “purtător sănătos (inactiv) de virus B hepatitic”.
Anticorpii HBs (Ac HBs) sunt anticorpii impotriva proteinei S a virusului:
- apar atunci când se elimină virusul din corp, dar şi în cazul vaccinării;
- prezenţa sa în organism, nu înseamna că ai virusul, ci ca ai anticorpi împotriva
virusului, obtinuţi prin vindecarea unei hepatite sau în urma vaccinarii împotriva
virusului B;
- cine are acesti anticorpi, este imun la virusul hepatitei B.
Antigenul HBc (Ag HBc) este o substanţă care se găseşte în interiorul virusului, prezenţa
sa arată ca virusul se găseşte în interiorul organismului uman, în sânge şi ficat.
Anticorpii impotriva HBc (Anti-HBc) sunt anticorpii impotriva proteinei C, prezenţa lor
nu înseamnă vindecarea hepatitei, decât dacă se asociază şi cu prezenţa AcHBs. Sunt
doua tipuri de anticorpi anti HBc: Anti HBc IgM, care arată un contact recent cu virusul
hepatitei B (infecţie acută) de cel mult 6 luni; Anti HBc IgG, care arată o infecţie veche
(cronică) cu virusul hepatitei B şi faţă de cel anterior, persistă toată viţta (nu numai 6
luni).
Antigenul HBe (Ag HBe) este o proteina a virusului hepatitei B:
- se găsşste în sînge doar dacă este prezent şi virusul;
- de obicei dispare la vindecarea bolii;
- există şi variante de virus hepatitic B fără acest antigen (mutanţi), destul de
frecvente şi în România, mai ales dacă pacientul a facut tratament cu lamivudină.
Anticorpii impotriva HBe (Anti HBe) sunt anticoprii împotriva proteinei E a virusului B:
- apariţia lor într-o hepatită acută înseamană vindecarea bolii;
- persistă o perioadă îndelungată în sânge;
- apariţia lor într-o hepatită cronică poate însemna vindecarea sau lipsa de îmulţire a
virusului.
Acidul nucleic al viruslui B (AND-VHB):
- detecţia sa în sânge înseamnă prezenţa virusului;
- în funcţie de concentraţia sa, se poate spune că persoana are:
hepatită cronică cu virus B, dacă concentratia >2.000 UI/ml;
purtator inactiv de virus B, dacă concentraţia <2.000 UI/ml;
hepatita B ocultă, dacă concentraţia este <200 UI/ml.
Markeri virali detectabili din sânge prin ELISA:
- Ag HBs, Ac anti HBs;
- Ag HBe, Ac anti HBe;
- Ag HBx, Ac anti HBx (cercetare);
- Ac anti HBc;
- din sânge se mai poate evidenţia ADN-ul viral prin PCR, polimeraza (cercetare).
Markeri virali detectabili din biopsie hepatică prin imunohistochimie:
-Ag HBs;
- Ag HBc;
- AgHBx (markerul cronicizării şi al malignizării - cercetare);
4
- ADN viral.
Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge:
AgHBs:
- se evidenţiază primul, apare în perioada de incubaţie (la 1-2 săptămâni de la
infecţie) scade în convalescenţă;
- dispare odată cu apariţia anticorpilor antiHBs;
- detectarea lui după 6 luni de la infecţie semnifică cronicizare.
AgHBe:
- se evidenţiază încă din perioada de incubaţie, imediat după apariţia AgHBs;
- dispare în convalescenţă odată cu apariţia anticorpilor antiHBe;
- detectarea lui indică infectivitatea persoanei.
Anticorpi antiHBc:
- primii anticorpi produsi, apar odată cu simptomele bolii şi persistă mai mulţi ani;
- se determină IgM sau Ig totale (IgG+IgM);
- detectarea IgM indică replicare virală.
Anticorpi antiHBe: apar după anticorpii antiHBc.
Anticorpi antiHBs:
- apar la câteva luni sau ani de la infecţie, după anticorpi antiHBe;
- detectarea lor indică instalarea imunităţii.
Dinamica apariţiei markerilor virali în sânge
Profiluri serologice posibile în hepatita virală B:
Prezenţa AgHBe = infectivitate:
- AgHBs + IgM antiHBc = hepatită acută;
- AgHBs + Ig totale antiHBc (> 6 luni) = infecţie persistentă;
- AgHBs + Ig totale antiHBc + AgHBe (> 6 luni) = hepatită cronică.
Prezenţa Ac anti HBs = vindecare:
- Ac anti HBs + IgM anti HBc (titru crescut) = infecţie recentă, vindecată;
- Ac anti HBs + Ig totale antiHBc (titru scăzut) = infecţie în antecedente,
vindecată;
- Ac anti HBs (fără alţi markeri) = imunitate postvaccinală;
- Persistenţa AgHBs după 6 luni = infecţie persistentă.
5
Diagnosticul Hepatitei virale C
Hepatita C. Virusul hepatitei virale C (HCV) este denumit şi virusul hepatitei non A-B,
like-B sau virusul posttransfuzional. Aparţine familiei Flaviviridae şi se prezintă sub
forma unei particule cu diametrul de 50-60 nm care conţine o anvelopă lipidică cu
proteine transmembranare şi ARN monocatenar.
Majoritatea subiecţilor infectaţi cu HCV prezintă modificări clinice minime şi doar câţiva
necesită spitalizare. Perioada de incubaţie este de 3-150 zile (cel mai frecvent fiind de 8
săptămâni). Mai mult de 60% din cazurile infectate prezintă niveluri uşor crescute ale
transaminazelor pe o perioadă mai mare de un an, iar biopsia hepatică arată în majoritatea
cazurilor caracteristici de afectare hepatică, iar în 10% din cazuri ciroză. O variaţie
marcată într-o perioadă scurtă de timp a nivelului transaminazelor este o trăsătură a
hepatitei C. Debutul formei acute este nespecific şi la 25% din cazuri este urmat de icter.
Boala nu poate fi diferenţiată de hepatita B doar prin examen clinic. Virusul este prezent
în sânge şi ţesuturi, care reprezintă principalele elemente de transmitere; transmiterea prin
contact sexual şi de la mamă la copil în timpul sarcinii sunt foarte rare; poate să evolueze
către hepatită cronică mai frecvent decât hepatita B - 80% din cazuri, aceasta putând să se
complice cu ciroză sau cancer de ficat.
Seroconversia este tardivă, prezenţa anticorpilor fiind caracteristică mai ales perioadei de
convalescenţă şi hepatitei cronice. Doar în 55% din cazuri anticorpii apar în prima lună;
15% din cazurile de hepatită C sunt seronegative. De asemenea, există reacţii fals
pozitive obţinute prin utilizarea truselor ELISA anti-HCV. Cea mai sigură metodă de
diagnostic este determinarea ARN viral din plasmă prin PCR (polymerase chain reaction)
la subiecţii pozitivi în urma unui test ELISA. În prezent, sângele donatorilor este testat
prin ELISA pentru HBV, HCV şi HIV.
Produs patologic:
- sânge;
- ţesut hepatic.
Examen direct: evidenţierea acidului nucleic din sânge (viremie) sau din ficat prin PCR.
Izolarea nu se practică.
Diagnostic serologic:
- detectarea anticorpilor anti VHC prin ELISA, metode radioimune, folosind antigene
recombinate;
- detectarea imunoglobulinelor prin metode Western-blot.
Diagnosticul hepatiei virale D
Hepatita D. Virusul hepatitei D (HDV) a fost descoperit în 1976 şi se mai numeşte şi
agentul delta. Este un virus hepatotropic defectiv, întrucât replicarea şi infectivitatea sa se
realizează doar în prezenţa HBV de care depinde sinteza anvelopei externe. Calea de
transmitere este cea parenterală. Infecţia cu HDV este acută sau cronică. Există două
forme de infecţie acută: coinfecţia cu HBV. Ea se poate asocia cu cazuri de hepatită
fulminantă. Este sugerată doar de serologie (apariţia anticorpilor anti-HDV);
suprainfecţia cu HDV a unor cazuri de hepatită B cronică; în 80-90% din cazuri se trece
la cronicizarea infecţiei, cu persistenţa HDV în ficat. Clasic, se descrie situaţia unui
purtător cronic de HBV, cu nivele normale ale transaminazelor. Apoi are loc creşterea
6
persistentă a acestor enzime cu apariţia anticorpilor anti-HDV care persistă la un titru
ridicat o perioadă lungă de timp. Infecţia cronică are un prognostic prost pentru bolnav.
70-80% din aceste forme evoluează spre ciroză (15% în mai puţin de doi ani). În practică,
serologia determină doar IgM anti-HDV. Evoluţia favorabilă este dată de scăderea rapidă
a titrului de anticorpi. De asemenea, se mai pot determina (mai greu şi nu curent)
antigenul HDV şi ARN viral, utile în cazurile de cronicizare.
Produs patologic:
- sânge;
- ţesut hepatic.
Examen direct:
- evidenţierea virusului în nucleul hepatocitelor prin ME, metode imunohistochimice;
- evidenţierea ARN-ului viral din sânge, după tratarea serului cu detergenţi pentru a
îndepărta AgHBs care înveleşte virusul.
Diagnostic serologic:
- evidenţierea anticorpilor anti HDV prin ELISA.
Diagnosticul hepatitei virală E
Hepatita E. Virusul hepatitei E(HEV) a fost descoperit în 1988 şi aparţine familiei
calicivirusurilor. Nu prezintă anvelopă externă, are dimensiuni de 32-34 nm şi conţine
ARN. A mai fost denumit virusul hepatitei non-A-B A-like, iar anglosaxonii îl notează
Hev. Infecţia are o cale de transmitere oro-fecală şi se întâlneste în regiuni ale lumii a
treia cu condiţii precare de igienă (Africa de Nord, Orientul Apropiat şi Mijlociu). Are o
perioadă de incubaţie de 21-42 de zile, iar boala survine, de obicei, acut şi nu se însoţeşte
de icter. Serologia nu este încă aplicabilă. Din punct de vedere evolutiv, infecţia nu este
urmată de portaj cronic. De menţionat este însă gravitatea bolii la gravide, mortalitatea
cazurilor infectate ajungând la 20%. În rândul populaţiei generale mortalitatea este de 1-
2%.
Virusul hepatitei E se transmite enteral, determinând forme uşoare de boală, cu excepţia
femeilor gravide la care boala poate avea o evoluţie letală.
Boala evoluează epidemic în Asia, în nord-vestul Africii şi în Mexic. Foarte rar apare în
SUA. Nu s-au descris cazuri la noi în ţară.
Hepatita F. Hepatita F (hepatita non-A-E) a fost raportată recent în cazuri izolate din
Europa de Vest, S.U.A. şi India. HFV a fost izolat din fecalele subiecţilor infectaţi, unde
apare sub formă de particule cu dimensiuni de 27-37 nm care conţin o moleculă de ADN
dublucatenar de aproximativ 20 kb. Acest virus diferă substanţial de HAV şi HEV,
ambele alcătuite din câte o moleculă de ARN monocatenar de 7,5 kb. Nu există teste
serologice pentru diagnosticul hepatitei F, dar el poate fi pus în evidenţă în urma
examinării prin microscopie electronică a scaunului pacienţilor. Sunt suspecte de a
prezenta infecţia acele cazuri de hepatită a căror etiologie nu poate fi determinată în urma
testării pentru celelalte virusuri.
epatita G. Virusul hepatitei G (HGV) a fost descoperit recent şi mai este frecvent
denumit virusul GB. HGV aparţine familiei Flaviviridae şi are un genom reprezentat de o
7
moleculă de ARN monocatenar de aproximativ 9,5 kb. Se transmite şi are evoluţie ca a
virusului hepatitic C.
Diagnosticul de laborator în afecţiuni respiratorii
Diagnosticul de laborator în gripă
Gripa este o boală infecţioasă acută foarte contagioasă, obişnuit autolimitată, febrilă,
cauzată de virusul gripal.
Virusul gripal (Myxovirus influenzae):
- aparţine familiei Orthomyxoviridae;
- are o forma sferică, cu diametrul de 80-120 nm;
- conţine un lanţ unic negativ ARN compus din 8 fragmente care codifică 10 proteine
virale;
- fragmentele de ARN au un înveliş proteic comun, constituit dintr-o membrană
lipidică, care le uneşte formând nucleoproteidul (antigen-S), care determină tipul
virusului (A, B sau C);
- la suprafaţa virusului se află structurile superficiale: hemaglutinina (hemaglutinina
asigura capacitatea virusului de a se uni cu celula receptor) şi neuraminidaza (răspunde
de capacitatea particulei virale de a pătrunde în celula gazdă şi de a ieşi din celulă după
multiplicare);
- structurile superficiale (hemaglutinina şi neuraminidaza) au specificitate de subtip şi
de tulpină; determină diferitele tulpini ale unui tip de virus. Există 16 subtipuri antigenice
ale hemaglutininei (H1-H16) şi 9 ale neuraminidazei (N1-N9).
Virusul gripal A:
- produce îmbolnăvirea de gravitate medie sau mare;
- infectează atât omul cât şi unele animale domestice (calul, porcul, păsările);
- este responsabil de apariţia pandemiilor şi a epidemiilor extinse;
- prezintă o multitudine de subtipuri ale gripei A, clasificate după antigenii
superficiali (16 tipuri de hemaglutinină şi 9 tipuri de neuraminidază).
Virusul gripal B:
- este capabil să îşi modifice structura antigenică;
- este prezent numai la om şi are manifestări epidemice moderate, cu o evoluţie lentă.
Virusul gripei C:
- este destul de puţin studiat;
- conţine doar 7 fragmente de acid ribonucleic şi un antigen superficial;
- infectează doar omul;
- simptomele bolii sunt foarte uşoare sau nu se manifestă deloc;
- nu produce epidemii şi nu duce la urmări serioase;
- este cauza unor îmbolnăviri sporadice, în special, la copii;
- structura antigenului nu este supusă unor transformări ca la virusul gripei A.
Variaţia antigenică este particularitatea fundamentală a virusurilor gripale A si B. Aceasta
are loc la nivelul antigenilor superficiali ai virusului (hemaglutinina şi neuraminidaza).
Există două mecanisme ale variaţiei antigenice: minoră (antigenic drift) şi majoră
(antigenic shift). La virusul gripal A se întâlnesc ambele variaţii antigenice, în timp ce la
virusul B se manifestă numai variaţia antigenică minoră.
8
Evoluţia gripei este endemică, cu manifestări epidemice la interval de 2-3 ani pentru
virusul de tip A şi 4-6 ani pentru virusul de tip B. Pandemiile care apar datorită unor
tulpini complet noi a virusului, provenite, de obicei, din Extremul Orient, intervin la 10-
20 ani. Gripa prezintă periodicitate sezonieră, cazurile apărând în sezonul rece, de obicei,
iarna-primăvara:
incubaţia: 18-36-72 de ore;
debutul este brusc, uneori brutal cu frisoane, febră 39-40°C, mialgii, cefalee,
astenie;
perioada de stare este dominată de semne toxice generale; sunt prezente:
- febra înaltă 3-5 zile, faciesul uşor congestionat, cefalee, dureri în globii oculari,
mialgii, astenie marcată, tulburări de somn, apatie, iritabilitate;
- manifestări respiratorii: catar nazal, enantem difuz, durere sau arsură
retrosternală (traheite), tuse uscată;
- manifestări viscerale diverse: cardiovasculare, digestive;
perioada de convalescenţă în care persistă manifestări ca astenie, subfebrilitate,
tuse, irascibilitate.
Diagnosticul virusologic este necesar în cazul unei epidemii într-o colectivitate (institut)
sau când rezultatul poate influenţa decizia terapeutică.
Produs patologic:
- secreţie faringiană, nazală sau nazofaringiană;
- lichid de spălătură nazofaringiană;
- aspirat bronşic;
- ţesut pulmonar - diagnostic postmortem;
- sânge:
Examen direct:
- evidenţierea antigenelor virale: prin RIF, ELISA (RHA-HAI);
- se pot diferenţia tipurile A si B prin metode rapide (15-30 minute) -
imunocromatografice;
- rezultatele negative se verifică prin metoda de cultivare;
- evidenţierea acizilor nucleici virali RT - PCR.
Izolare şi identificare:
Izolarea virusului este singura metodă care permite caracterizarea specifică a subtipurilor
circulante.
cultivare pe OGE - inoculare intra-amniotică: se determină prezenţa
hemaglutininelor (hemadsorbţie);
cultivare pe culturi de celule:
- efect citopatogen discret;
- replicarea virală se evidenţiază prin hemadsorbţie;
- RIF - diferenţiază tipurile A şi B.
Diagnostic serologic:
- evidenţierea seroconversiei: RFC;
- reacţia de hemaglutinoinhibare.
Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de rhinovirusuri
Rhinovirusuri sunt agenţi etiologici ai răcelii comune.
9
Produs patologic:
- lichidul de spălătură nazală - recoltat în perioada de început a bolii, cînd excreţia
virală este maximă.
Examen direct:
- detectarea antigenelor virale în lichidul de spălătură nazală - reacţia ELISA.
Izolarea şi identificarea:
- linii celulare HeLa sau culturi de fibroblaşti umani;
- efectul citopatic - rotunjirea celulelor.
Diagnostic serologic:
- detectarea anticorpilor prin:
- reacţia de virus-neutralizare;
- reacţia ELISA.
Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de virusul sinciţial respirator (VSR)
virusul sinciţial respirator face parte din familia Paramyxoviridae;
afectează persoane de toate vârstele, în special copii până la 2-3 an;
produce epidemii iarna;
cel mai frecvent determină:
- simptome asemănătoare răcelii;
- pneumonie;
- bronşiolită (gravă la pacienţi imunodeprimaţi).
Produs patologic:
- lichid de spălătură nazofaringiană;
- sânge.
Examen direct:
- evidenţierea antigenelor virale prin RIF, ELISA;
- evidenţierea ARN prin RT-PCR.
Izolare şi identificare:
- cultivare pe linie HeLa sau HEp-2 - evidenţierea efectului citopatogen.
Diagnostic serologic:
- evidenţierea seroconversiei: RFC, ELISA.
Diagnosticul de laborator în infecţiile cauzate de adenovirusuri
determină apariţia unor infecţii cu localizări multiple:
- infecţii respiratorii inferioare şi superioare;
- conjunctivită;
- cistită hemoragică;
- gastroenterite;
- infecţii la pacienţi cu transplant de organe.
Produs patologic:
- exsudat faringian, nazal, nazofaringian;
- spută;
- secreţie conjunctivală;
- urină;
10
- materii fecale;
- sânge.
Diagnostic direct:
detectarea antigenelor virale prin RIF
Izolare şi identificare:
- linii celulare: efect citopatogen (aglomerarea celulelor în ciorchine), incluzii
nucleare;
- unele adenovirusuri enterice nu sunt cultivabile:
Diagnostic serologic:
determinarea seroconversiei:
- RFC - detectează anticorpi specifici de grup;
- RHAI - anticorpi specifici de tip.
Diagnosticul de laborator în infecţia HIV
HIV reprezintă prescurtarea în limba engleză a Human Immunodeficiency Virus (Virusul
Imunodeficienţei Umane). Aceste virusuri fac parte din categoria retrovirusurilor.
Virusurile HIV se împart în două grupe:
- grupa HIV-1 care cuprinde trei subtipuri M, N şi O. Virusurile din subtipul M, cu
răspâdirea cea mai largă în lume, se împarte la rândul lui în subtipurile A şi B. Subtipul B
este cel mai răspândit în Europa de vest şi în America de Nord;
- grupa HIV-2 se împarte la rândul său în subtipuri. Cele mai frecvente sunt
subtipurile A şi B. Această subgrupă este prezentă preponderent în Africa de vest, dar
care se răspndeşte însă şi în Europa; 15% din persoanele nou infectate în Portugalia în
2005 au fost infectate cu virusul HIV-2.
HIV-1 şi HIV-2 se aseamănă din punct de vedere al evoluţiei şi simptomelor clinice a
infecţiei. Evoluţia HIV-2 se pare că este mai lentă decât HIV-1. Ambele virsuri au
aceeaşi prezentare sub microscopul electronic, dar se deosebesc prin greutatea moleculară
a proteinelor şi ordinea genelor.
Contaminarea
Virusul HIV (HIV) se transmite prin sânge, spermă, secreţii genitale, lichid cefalo-
rahidian (LCR) şi lapte matern. Porţile de intrare cele mai frecvente sunt rănile proaspete,
sângerânde din mucoasă (oculară, bucală, vaginală, anală) sau rănile nevindecate sau
insuficient protejate de pe oricare parte a pielii corpului.
Căile de transmitere:
- vaginale sau anale datorate nefolosirii prezervativelor şi practicii sexuale orale;
- intravenoase prin folosirea în comun de toxicomani a acelor de seringă;
- transfuzii de sânge şi produse preparate din sânge;
- intrauterine sau la naştere în timpul travaliului, cînd HIV se poate transmite de la
mamă la făt (în 10-30% din cazuri);
- prin înţepături, tăieturi sau contactul direct pe pielea lezată, neprotejată
corespunzător în cazul personalului sanitar care poate veni în contact cu secreţiile şi
sângele pacientului infectat.
Structură şi funcţionare - HIV este un retrovirus circular, cu diametrul este de 100-200 nm, din specia
lentivirusurilor;
11
- este înconjurat de un înveliş lipoproteic, care se formează din membrana celulei
gazdă, având şi o parte din proteinele membranare ale celulei gazdă (molecule HLA I şi
II şi proteine de adeziune, de legare);
- prezintă sub înveliş circa 72-100 de complexe glicoproteice, formate dintr-o parte
externă (gp 120 cu rol de legare de receptorii CD4 ai celulei ţintă) şi o parte
transmembranară de înveliş (gp41);
- genomul virusului HI este mai complex decât cel a altor retrovirusuri, fiind
constituit din 2 lanţuri scurte de ARN, compuse din 9200 nucleotide precum şi enzime
virale, clasificate astfel: proteine structurale/enzime virale (produşii genelor Gag, Pol,
Env): revers-transcriptaza, proteaza, ribonucleaza şi integraza, toate încapsulate într-o
anvelopă lipidică, care conţine antigenul Gp120 cu rol foarte important în legarea de CD4
a genomului HIV; proteine reglatoare: Tat şi Rev (HIV) şi Tax/Rex (HTLV) care
modulează transcripţia şi sunt esenţiale pentru propagarea virusului şi proteine auxiliare:
Vif, Vpr, Vpu, Vpx, Nef, unele cu rol încă neelucidat;
- ARN-ul viral se află în interiorul a două capside alături de enzime;
- nu este vizibil sub microscopul electronic din cauza diametrului foarte mic;
- infecţiile cu acest tip de virus decurg de regulă cronic, cu o perioadă lungă de
latenţă, afectând şi sistemul nervos.
Imaginea virusului HI
Stadii în evoluţia infecţiei cu HIV:
- stadiul I: infecţie lipsită de simptomatologie sau cu simptome ce pot fi întâlnite şi în
alte afecţiuni infecţioase sau neinfecţioase: dureri de cap, dureri musculare şi articulare,
febră, greţuri, scăderea poftei de mâncare, umflarea ganglionilor (simetrică);
- stadiul II: infecţie asimptomatică cu excepţia umflării ganglionilor;
- stadiul III: apar simptome ce reflectă prezenţa unor infecţii fără gravitate: dureri de
cap, febră, transpiraţii nocturne, oboseală cronică, diaree, afecţiuni ale pielii, leziuni ale
mucoasei bucale;
- stadiul IV: infecţie simptomatică: boli gastrointestinale, boli pulmonare, boli
neurologice;
12
- stadiul V: pierdere de greutate, debilitate pronunţată, afectarea sistemului nervos
central.
O infectare cu HIV-1 şi HIV-2 duce după o perioadă lungă de incubare, de ani, chiar zeci
de ani, la declanşarea bolii SIDA (sindromul imunodeficienţei dobândite) letală.
Diagnosticul de laborator în infecţia HIV
Produs patologic:
·sânge (pentru examen direct şi serologic):
- ser;
- plasmă pe EDTA;
- sânge integral;
secreţii genitale, salivă, urină, LCR, lapte de mamă, unde poate fi identificat HIV;
lapte de mamă şi salivă, unde pot fi găsiţi anticorpii specifici.
În cursul diagnosticului infecţiei cu HIV se evidenţiază:
- antigene virale;
- ARN viral, ADN proviral;
- anticorpi: Ac. anti core, Ac. antienvelope.
Dinamica producerii markerilor virali
Antigenul p24:
- se găseşte în serul persoanei infectate;
- detectabil în infecţiile recente, înainte de apariţia anticorpilor;
- dispar după apariţia anticorpilor anti p24;
- reapar în stadiile tardive de boală (SIDA), semnificând replicare virală intensă şi un
prognostic grav.
Anticorpii anti p24:
- apar la 3-12 săptămâni de la infecţie. Perioada de la infecţie până la apariţia lor se
numeşte “fereastră imunologică”.
Anticorpii anti gp120:
- nu au rol protector;
- sunt folosiţi ca marker de diagnostic.
Dinamica producerii markerilor virali
Diagnostic
13
Diagnosticarea infectării cu virusul HI se împarte în depistare şi confirmare. Scopul
depistării este descoperirea tuturor persoanelor seropozitive, cu riscul de a depista în
această primă fază şi falşi seropozitivi. Din cauza posibiltăţii unui test fals pozitiv, se
recurge la confirmarea seropozitivităţii, testare care se supune unei stricte
confidenţialităţi medicale pentru protejarea sferei de intimitate a celui posibil seropozitiv.
Acest proces de secretizare a identităţii celui testat este reglementat în România prin lege.
Confirmarea infectării cu HIV se face în laboratoare specializate.
Protocolul standard de diagnostic:
se evidenţiază anticorpii prin metoda ELISA, prima etapă de diagnostic a infecţiei
HIV (screening), având sensibilitate de aproape 100% şi specificitatea de 99,5%:
- generaţia I: se foloseşte lizatul total viral de pe culturi de limfocite („whole virus”);
- generaţia II: se folosesc antigene clonale;
- generaţia III: se folosesc antigene recombinate;
- generaţia IV: metode combinate care testează simultan prezenţa anticorpilor anti
HIV şi a antigenului P24; Metodele de generaţie III şi IV au sensibilitate şi specificitate
ridicate, dar este posibilă şi apariţia unor rezultate false:
- fals negative [„fereastra imunologică”, diferite tipuri virale (HIV-1, HIV-2) şi
subtipuri (HIV-1-N, HIV-1-O, HIV-1-M)];
- fals pozitive (probe de sânge alterate, incorect etichetate sau schimbate, greşeli de
laborator, contaminarea probelor).
Rezultatul pozitiv al testării ELISA se raportează ca „ser reactiv” şi nu confirmă
diagnosticul pozitiv de infecţie HIV.
În cazul pozitivării se face o retestare printr-o metodă cel puţin la fel de sensibilă din
aceeaşi probă de sânge (determinare ELISA la centre de referinţă). După retestare,
probele reactive trebuie confirmate prin metoda Western-blot:
se detectează proteinele specifice virale:
- glicoproteine de înveliş („env”): gp41, gp120, gp160;
- proteine nucleare („gag”): p18, p24/25, p55;
- endonucleaze-polimeraze („pol”): p34, p40, p52, p68;
se consideră pozitive probele care prezintă:
- 2 benzi pentru antigene din grupul „env” (după World Health Organization
WHO);
- 1 bandă (glicoproteină) + 1 bandă (altă proteină specifică HIV) (după Deutsches
Institut für Normung - DIN);
- benzi pentru P24, p34, gp41, gp120/160 (după Food and Drug Administration).
14
Testul Western-Blot are o senzitivitate de 99,9996% ceea ce înseamnă că doar 0,0004%
primesc un rezultat pozitiv fals, motiv pentru care este indicat pentru confirmarea
seropozitivităţii HIV.
Testul Western Bolt determină mai mulţi anticorpi din sânge care s-au format contra
anumitor componente proteice, fiind adresat anticorpilor este însă şi el aplicabil doar
după 12 săptămâni de la expunere; testul ELISA determină masa generală de anticorpi
HIV-1, HIV-2.
Teste rapide de diagnostic („point-of-care”, „bedside” tests): Se bazează pe 4 principii:
aglutinare, immunodot, imunofiltrare sau imunocromatografie. Se pot efectua din sânge
capilar/venos. Rezultatele se obţin în 15-30 min. Testele OraQuick™, Reveal™, Uni-
Gold Recombigen™ au specificitate şi sensibilitate înalte.
Diagnostic direct:
nu se face de rutină;
detectarea AN virali: ADN proviral din limfocite sau ARN viral;
reprezintă marker de infecţie;
se foloseşte în situaţii speciale:
- calitativ: suspiciune de infecţie primară, când Ac lipsesc (fereastra imunologică);
nou născut din mamă infectată cu serologie pozitivă (Ac materni);
- cantitativ (încărcătura virală): marker de prognostic; monitorizarea tratamentului.
Nu se foloseşte ca metodă de diagnostic
PCR (polymerase chain reaction), b-DNA (branched DNA), NASBA (nucleic
acid sequence-based amplification), LCR (ligase chain reaction).
Izolarea virusului:
- rezervată pentru cazuri speciale, se face în laboratoare specializate;
- pe culturi de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinină, în prezenţa
interleukinelor;
- efect citopatogen în 2-3 săptămâni.
15
Protocol de diagnostic şi management în cazul infecţiei HIV
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul: Neisseria,
Pseudomonas, Acinetobacter, Vibrio, Bacillus, Clostridium, Treponema
Diagnosticul de laborator în infecţii cauzate de germenii din genul Pseudomonas
Genul Pseudomonas include mai multe specii, specia tip fiind reprezentată de
Pseudomonas aeruginosa (bacilul piocianic/"bacilul puroiului albastru"). Sunt bacili
Gram - negativi, aerobi, oxidază pozitivi, nesporulaţi, mobili (cu unu sau mai mulţi cili
polari).
Pseudomonas aeruginos, poate produce diferite infecţii grave (tegumentare superficiale
sau profunde, sepsis cu evoluţie gravă etc.). Infectează persoanele care prezintă arsuri.
Poate fi implicat în diferite infecţii de spital. P. aeruginosa este izolat de la pacienţii cu
fibroză chistică. Pseudomonas aeruginosa face parte din categoria germenilor de spital,
determinând infecţii nozocomiale, ceea ce implică recoltarea de probe de pe instrumente,
instalaţii sanitare, soluţii medicamentoase şi dezinfectante.
Diagnosticul de laborator în infecţiile supurative ale tegumentelor este un diagnostic
bacteriologic, direct.
Produse patologice:
- exsudate purulente, puroi din plăgi, arsuri suprainfectate, leziuni necrotice cutanate;
- secreţii nasofaringiene, spută;
- urină;
- materii fecale, bilă;
- sânge;
- LCR;
- secreţii vaginale;
- secreţii conjunctivale.
Recoltarea şi transportul p.p. (puroi) respectă recomandările cunoscute.
Examen direct:
- macroscopic al p.p. poate evidenţia un aspect sugestiv (culoare albastră/galben-
verzui fluorescentă). Puroiul poate degajă un miros caracteristic aromat;
- microscopic se practică doar din produse biologice în mod normal sterile din care se
realizează cel puţin 2 frotiuri (colorate cu A.M. şi Gram). Se observă prezenţa celulelor
inflamatorii (PMN) şi a bacililor Gram negativi, subţiri, dispuşi în lanţuri scurte, perechi
sau izolaţi, cu un cil polar, necapsulaţi, nesporulaţi.
Cultura. Cultivarea se poate face pe medii de cultură obişnuite şi difernţiale (bulion,
geloză simplă, geloză sânge, medii selective şi diferenţiale pentru enterobacterii:
Leifson), timp de 18-24 ore. Bacilul piocianic se poate multiplica la temperaturi care
variază între 5-42°C, însă dezvoltarea optimă este la 30-37oC. Pentru p.p. contaminate se
recomandă utilizarea unor medii de cultură selective. Se formează colonii de tip „S” care
se pigmentează, însoţindu-se de pigmentarea mediului (albastru sau galben-verde
fluorescent). Cultura poate avea un miros asemănător florilor de tei.
Identificarea microorganismului se bazează pe caracterele:
- morfotinctoriale: sunt bacili Gram-negativi, dispuşi în lanţuri scurte, perechi, izolaţi,
relativ polimorfi. În culturi mai vechi pot apărea diferite forme (filamentoase, cocoide).
Mobilitatea se poate examina pe preparatul proaspăt, între lamă şi lamelă.
- de cultură: în mediu lichid - tulbură uniform mediul, formează o peliculă la
suprafaţă (strict aerob) sub care se acumulează pigment; pe mediu solid - colonii de tip
„S”, lactozo - negative, uneori cu luciu metalic. Pe măsură ce cultura îmbătrâneşte,
coloniile devin de tip „R”, se produce un pigment verzui difuzibil.·Pe geloză sânge - se
dezvoltă colonii cenuşii, unele produc hemoliză beta;
- biochimice: bacteriile din genul Pseudomonas sunt oxidază pozitive;
- pe geloză lactozată nu fermentează lactoza;
- lichefiază mediul Loffler (produce proteoliză);
- pe geloză sânge - hemoliză beta;
- produc colonii de tip „S” pigmentate (se remarcă şi pigmentarea mediului,
albastru sau galben-verde fluorescent). Pigmenţii sunt: piocianina, specific, verde -
albăstrui, solubil în cloroform; pioverdina (fluoresceină), galben - verzuie, solubilă în
apă.
Tipizare:
lizotipie este utilă în scop epidemiologic pentru stabilirea sursei unei infecţii
nozocomiale;
piocinotipie se foloseşte pentru identificare pe baza tipizării piocianinei, care este
specifică fiecărui tip.
Antibiograma este obligatorie, multe tulpini de Pseudomonas prezentând rezistenţă
multiplă la antibiotice. Antibiograma se realizează, de obicei, prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator al holerei: genul Vibrio
Genul Vibrio include mai multe specii. Cea mai bine cunoscută specie este Vibrio
cholerae. Bacteria Vibrio cholerae este considerată potenţial periculoasă şi letală de aceea
se impune respectarea riguroasă a măsurilor de protecţia a muncii. Vibrio cholerae
(vibrionul holeric) este un germen mobil, aerob sau facultativ anaerob, oxidază pozitiv,
rezistent la pH alcalin şi săruri biliare. Produce toxina holerică şi respectiv holera.
Diagnosticul este bacteriologic, direct şi trebuie realizat urgent.
Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile impuse. Se recoltează materii fecale
sau/şi lichid de vărsătură. Dacă nu se poate ajunge la laborator în 1-3 ore este necesar să
se folosească mediul de transport Cary-Blair. Apa peptonată alcalină (pH 9-9,5) poate fi
utilizată ca mediu de transport, dar şi ca mediu de îmbogăţire. Produsele patologice mai
pot fi reprezentate de probe de apă şi de alimente.
Examen direct:
- macroscopic: scaun apos, cu conţinut fecaloid minim, aspect riziform. Materiile
fecale au culoare verzuie, miros fetid, conţin mucus;
- microscopic. Pentru examenul microscopic al p.p. se face un preparat între lamă şi
lamelă (nu frotiuri). Se utilizăm obiectivul 40x. Nu se evidenţiază PMN. Există vibrioni
care prezintă mişcări active. Prin coloraţie Gram se observă bacili Gram negativi, subţiri,
încurbaţi, sub formă de virgulă, care prezintă un cil la un capăt, necapsulaţi, nesporulaţi.
Pentru examenul microscopic pe fond întunecat se efectuează un preparat nativ. Sunt
germeni foarte mobili. Testul de imobilizare se efectuează cu ser imun anti-O1, anti-
O:139. Imobilizarea germenilor din preparat ridică suspiciunea prezenţei vibrionului în
preparat.
Cultura. Se cultivă (direct sau după transport) în apă peptonată alcalină (APA). După 6-
8 ore la 35-37°C, se trece pe un mediu selectiv, cu săruri biliare [TCBS (tiosulfat, citrat,
bilă, zaharoză) şi/sau BSA (bile salt, agar)], prelevând de la suprafaţa mediului lichid
(unde ar putea să apară un „văl"). Dacă se examinează microscopic (între lamă şi lamelă)
conţinutul „vălului" se poate grăbi diagnosticul. Se poate cultiva şi pe mediu geloză-
sânge.
Identificarea se face pe baza caracterelor:
- morfotinctoriale: bacili gram-negativi;
- de cultură: în mediu lichid creşte foarte rapid şi formează un văl la suprafaţă, mediul
rămâne clar; pe mediul TCBS produc colonii de tip „S”, galbene, mari de 2-4 mm; pe
mediul BSA se formnează colonii de tip „S”, rotunde, strălucitoare, transparente ca
picăturile de rouă; pe geloză sânge cresc colonii de tip „S”, mici, mate, alb-cenuşii,
nehemolitice;
- biochimice: germeni oxidază pozitivi;
- alte teste biochimice se pot efectua în laboratorul de referinţă;
- antigenice: se utilizează ser anti-holeric O:1 (reacţii de aglutinare pe lamă). În
laboratorul de referinţă se confirmă reacţia pozitivă şi se identifică serotipul (Ogawa,
Inaba sau Hikojima); dacă rezultatele sunt negative se foloseşte şi serul anti-holeric
O:139;
Testarea sensibilităţii la bacteriofagi se poate utiliza în studii epidemiologice sau în scop
de cercetare (în laboratorul de referinţă).
Identificare antigenică se face pe baza antigenului O (O:1, O:139). Diagnosticul
definitiv se confirmă în laboratoare de referinţă.
Antibiograma se realizează prin metoda difuzimetrică standardizată, pentru
supravegherea apariţiei unor tulpini rezistente la medicamentele antimicrobiene.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de genul Neisseria
Familia Neisseriaceae include mai multe genuri.
Diagnosticul de laborator în infecţiile produse de meningococ (Neisseria meningitidis)
şi gonococ (Neisseria gonorrhoeae)
Bacteriile din genul Neisseria sunt coci gram-negativi, dispuşi în diplo, reniformi,
imobili, înconjuraţi de o structura capsulară comună. In funcţie de structura capsulei
există mai multe serogrupuri. Sunt oxidază pozitivi. Sunt germeni pretenţioşi. Au nevoie
de CO2.
Diagnosticul în meningită meningococică
Diagnosticul include elemente clinice, într-un context epidemiologie. Pentru stabilirea
etiologiei, diagnosticul este bacteriologic (direct) şi urgent. Este recomandat ca primele
etape să fie efectuate la patul bolnavului.
Recoltarea p.p. (LCR, puncţie după realizarea examenului „fundului de ochi") ar trebui
realizată la patul bolnavului, unde se repartiză o cantitate de LCR pentru examenul
citologic şi biochimic, restul pentru frotiuri şi culturi. Dacă transportul este inevitabil,
trebuie efectuat fără întârziere şi nu la temperaturi scăzute ci aproape de temperatura
corpului. Meningococul ar putea fi izolat şi prin hemocultură, cultivarea secreţiilor nazale
sau faringiene etc.
Examinarea microscopică a p.p. permite vizualizarea celulelor inflamatorii (PMN) şi a
cocilor gram-negativi, dispuşi în diplo, capsulaţi, situaţi intra sau extraleucocitar.
Cultura. Cultivarea se face pe medii complexe, în atmosferă de 3-5% CO2 la 37°C.
Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:
- morfotinctoriale: coci gram-negativi, în diplo, reniformi;
- de cultură: colonii de tip „S”, 1-2 mm; pot fi şi de tip „M”;
- biochimice: metabolizează diferite glucide (glucoză şi maltoză) şi produc citocrom-
oxidază (testul oxidazei este test cheie în identificare);
- antigenice: se poate identifica serogrupa (pot aparţine grupului A, B, C, Y sau W-
135).
Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
Diagnosticul de laborator în gonoree
La bărbaţi apare uretrita gonococică. La femei, gonoreea se localizează endocervical. La
nou-născutul care se naşte pe cale naturală din mamă cu gonoree, poate să apară oftalmia
gonococică. Gonococul poate disemina cu apariţia unor leziuni la distanţă. Diagnosticul
de laborator este numai bacteriologic (direct).
Recoltarea şi transportul p.p. respectă regulile cunoscute. La bărbat se recoltează
secreţia uretrală iar la femeie recoltarea trebuie efectuată pe masă ginecologică de la
nivelul colului uterin. Secreţiile au, de obicei, un aspect purulent. Este de preferat
cultivarea foarte rapidă, pe medii de cultură complexe (în atmosferă de CO2). Transportul
trebuie realizat foarte rapid în medii de transport (Amies plus cărbune activat).
Examen microscopic al p.p. pune diagnosticul. Se notează prezenţa celulelor, celulelor
inflamatorii (leucocite) şi a cocilor gram-negativi (în diplo, situaţi intra sau
extraleucocitar).
Cultura. Cultivarea se face pe medii selective (medii cu vancomicină, colistin,
trimetoprim şi nistatin) dacă p.p. este contaminat. Se recomandă cultivarea atât pe medii
selective, cât şi pe medii neselective, în atmosferă de 3-10% CO2, la 35-37°C. Coloniile
apar în 24-48 de ore. Sunt colonii de tip „S”, de 0,5-1 mm, sau colonii de tip „M”.
Identificarea rezultă în urma analizei caracterelor:
- morfotinctoriale: coci gram-negativi, în diplo, eventual înconjuraţi de o structură
capsulară comună;
- de cultură: coloniile sunt de tip „S” sau „M”;
- biochimice: metabolizează diferite glucide (glucoza) şi produc citocrom-oxidază
(testul oxidazei este testul cheie în identificare); testul catalazei este intens pozitiv;
- antigenice;
- altor caractere (studiate prin metode ale biologiei moleculare).
Antibiograma este recomandată şi se realizează de obicei prin metode difuzimetrice.
Este necesară testarea producerii de α 3-lactamază.
Diagnosticul de laborator al infecţiei cărbunoase: Bacillus anthracis
Produse patologice:
- în cărbunele cutanat - exsudat din pustula malignă;
- în cărbunele intestinal - materii fecale;
- în cărbunele pulmonar - spută;
- în formele septicemice - sânge;
- pentru diagnostic retrospectiv - fragmente de organe.
Examen direct:
- frotiu Gram;
- bacili Gram pozitivi, cu capetele retezate sau uşor concave, asezaţi în lanţuri, cu
aspect ce imită trestia de bambus;
- prezintă un spor central;
- în produsul patologic prezintă capsulă.
Izolare: germene nepretenţios, poate fi cultivat pe:
- bulion;
- geloză simplă;
- geloză sânge.
Identificarea se face pe baza caracterelor:
- morfotinctoriale: sunt bacili Gram pozitivi, mari (3-5 μm lungime/1-1,2 μm
grosime), cu capetele tăiate drept sau uşor concave, imobili. Pe frotiurile din ţesuturile
animalelor bolnave apar dispuşi în lanţuri scurte sau în perechi înconjuraţi de o capsulă
unică. Pe frotiurile din cultură bacilii sunt dispuşi în lanţuri paralele şi sunt sporulaţi.
Sporul, format numai în prezenţa oxigenului, are diametrul egal sau mai mic decât
grosimea bacilului, este oval şi este dispus central;
- de cultură: este o bacterie aerobă facultativ anaerobă, nepretenţioasă nutritiv, se
dezvoltă pe medii simple, la 35-37°C. Limitele de temperatură la care se poate dezvolta
sunt foarte largi: 12-40°C. Sporularea are loc la temperature camerei. În mediu lichid
formează un depozit floconos, mediul rămâne clar; pe medii solide se formează colonii de
tip „R” cu suprafaţa rugoasă, centrul ombilicat, margini dantelate cu prelungiri laterale
(cap de Medusă); în geloză dreaptă apar creste sub forma unui brad inversat. Pe geloza
sânge nu produce hemoliză;
- biochimice: este o bacterie catalază pozitivă. Are activitate proteolitică, lichefiază
gelatina, dar nu produce urează. Fermentează unele zaharuri (glucoza, maltoza,
zaharoza). Produce acetil-metil-carbinol (reacţia Vogues-Proskauer pozitivă) proprietate
utilă în clasificarea speciilor de Bacillus. Reduce nitraţii, hidrolizează cazeina, este indol
negativă.
Diagnostic diferenţial faţă de alţi germeni din genul Bacillus (B. cereus):
- sensibilitatea la penicilină: B. anthracis este sensibil, B. cereus este rezistent;
- hemoliza: B. anthracis nu produce hemoliză, B. cereus produce hemoliză;
- sensibilitatea faţă de bacteriofagi.
Diagnostic retrospectiv:
- reacţia Ascoli. Prin reacţia Ascoli sau prin tehnici imunoenzimatice se poate
identifica antigenul polizaharidic termostabil în extracte tisulare;
- reacţie de precipitare inelară;
- evidenţiază prezenţa antigenelor în fragmente de organe recoltate de la cadavre.
Diagnosticul serologic constă în demonstrarea anticorpilor prin metoda fluorescentă
directă, este posibil dar nu este util.
Diagnosticul de laborator al infecţiei cu bacterii din genul Clostridium
Genul Clostridium include mai multe specii care se găsesc în intestinul animalelor de
unde sunt eliminate în mediul extern prin materii fecale şi sporulează. Sporii rezistă pe
sol timp îndelungat şi sunt termorezistenţi. Sunt bacili gram pozitivi, anaerobi, sporulaţi,
de dimensiuni mari, aşezaţi în perechi sau lanţuri, mobili cu cili peritrichi (Clostridium
perfringens este capsulat).
Clostridium tetani sintetizează toxina tetanică şi produce tetanos descendent la om.
Toxina blochează eliberarea unor mediatori cu rol inhibitor, neuronii motori spinali
rămân în stare de excitaţie rezultând contracturi/spasme (paralizie spastică). Afectează
musculatura feţei - „risus sardonicus”, musculatura membrelor, musculatura coloanei
vertebrale - opistotonus. Orice stimul extern poate determina atacul de tetanos. Moartea
se poate poate produce prin asfixie, paralizia musculaturii respiratorii. Mortalitatea este
de circa 50%.
Produse patologice:
- fragmente bioptice din plăgi contaminate;
- probe de pământ, de metal;
- materii fecale;
- medicamente injectabile;
- cat-gut.
Clostridium botulinum sintetizează toxina botulinică (există 8 tipuri de toxină). Cel mai
frecvent determină toxiinfecţii alimentare de tip toxic (toxina se află, deja, în aliment).
După ingerare, toxina se resoarbe la nivel intestinal, prin circulaţie ajunge la nivelul
plăcilor neuromusculare şi împiedică eliberarea de acetilcolină (paralizie flască).
Botulismul debutează cu afectarea globilor oculari, ptoză palpebrală; evoluţie este
descendentă; decesul survine prin paralizia musculaturii respiratorii.
Produse patologice:
- ser;
- probe de alimente;
- urină;
- materii fecale;
- fragmente de organe.
Clostridium perfringens, C. novyi (C. oedematiens), C. septicum, C. histolyticum, C.
sporogenes etc. pot produce, în asociere, gangrena gazoasă. Sporii ajung în ţesuturi după
traumatisme deschise şi dacă se creează condiţii de anaerobioză germinează, formele
vegetative se multiplică, sintetizează toxine histotrope, fermentează zaharuri (cu
producere de gaz). Apar edeme, senzaţia prezenţei de gaz, necroză. În 20-80% din cazuri
evoluţia este gravă, spre deces. Clostridium perfringens este implicat în toxiinfecţii
alimentare, produce o toxină, alterează epiteliul intestinal şi produce diaree apoasă.
Produse patologice:
- ser;
- probe de alimente;
- materii fecale.
Examen microscopic are rol orientativ şi poate servi la alegerea terapiei antimicrobiene.
Germenii sunt bacili G+, sporulaţi.
Cultura. Pentru culitivarea clostridiilor este obligatorie asigurarea condiţiilor de
anaerobioză prin:
- metode fizice - anaerostat;
- metode chimice - hârtie de filtru îmbibată cu pirogalol (se lipeste în interiorul cutiei
Petri, absoarbe oxigenul);
- metode biologice - cultivare pe aceeaşi cutie Petri şi germeni aerobi şi anaerobi.
Cultivarea se face pe mediu Schaedler - geloză sânge glucozată,·pe geloză simplă sau pe
bulion VF plus neomicină. Incubarea se face în aerobioză şi anaerobioză şi se evaluează
în funcţie de apariţia coloniilor dacă sunt germeni aerobi sau anaerobi. Incubarea în
condiţii de anaerobioză durează 24-48 de ore, la 35-37°C.
Identificarea se face pe baza:
caracterelor morfotinctoriale:
Specia Coloraţie Cili Capsulă Spori Forma
celulei
C. tetani Bacili Gram + Peritrichi - Spor rotund
+ (terminal) C. botulinum Bacili Gram + Peritrichi - Spor oval
+ (subterminal) C. perfringens Bacili Gram + - + Spor oval
+ (subterminal)
caracterelor de cultură:
Specia Geloză dreaptă Schaedler
C. tetani Colonii pufoase Colonii tip „R”
C. botulinum Colonii cu centrul transparent Colonii tip „R”
C. perfringens Colonii lenticulare Colonii tip „R”
Speciile mobile (majoritatea) formează colonii de tip „S”, cu margini ondulate şi tendinţă
de invadare a mediului; dacă a avut loc inocularea şi în profunzimea mediului, coloniile au
aspect pufos; Clostridium perfringens (imobil) formează colonii de dimensiuni mari, de
tip „S”, rotunde, cu margini regulate, convexe (pot avea şi aspect „R”);
caracterelor biochimice:
- produc hemoliză β pe mediu Schaedler;
- unele tulpini sintetizează lecitinază. Pentru acestea se pot verifica mobilitatea,
fermentarea lactozei, producerea de lipază, urează, hidroliza gelatinei, digestia cărnii;
- mirosul este caracteristic:
- de corn ars - C. tetani;
- de rânced - C. botulinum;
- de acid butiric - C. perfringens.
Costridiile sunt sensibilie la vancomicină şi rezistente la colistin.
Caractere antigenice:
- se demonstrează prezenţa tetanospasminei prin seroneutralizare la şoareci;
- se testează prezenţa anti-toxinei tetanice (titrul protectiv >0,01UAI/ml);
- se demonstrează prezenţa toxinei botulinice în alimente, materii fecale, ser sau în
medii de cultură [se prelevează cultură din bulion VF, se centrifugează şi supernatantul se
împarte în 2 tuburi; un tub se încălzeşte la 100°C; se răceşte; se inoculează intraperitoneal
la două loturi de şoareci; dacă şoarecii injectaţi cu p.p. inactivat termic mor, nu este vorba
de toxina botulinică (pentru că toxina botulinică este termosensibilă)]; prezenţa toxinei
botulinice poate fi confirmată prin seroneutralizare (se protejează un şoarece cu anti-
toxină de tip A şi un alt şoarece cu anti-toxină de tip B, apoi se injectează cu p.p.; dacă
animalul seroprotejat cu anti-toxina de tip A supravieţuieşte, iar celălalt animal moare cu
semne caracteristice pentru botulism, în mediul de cultură a existat C. botulinum de tip
A).
Boala experimentală
C. tetani inoculat la cobai/şoareci pe cale subcutanată determină paralizie spastică;
C. botulinum inoculat la:
- şoareci conduce la paralizia flască a trenului posterior;
- cobai produce paralizia mm. abdominali;
- pisică determină diaree, tulburări de acomodare.
Antibiograma nu se recomandă, în infecţiile cu bacili Gram-pozitivi sporulaţi (lucrurile
diferă în cazul germenilor anaerobi Gram-negativi). Clostridiile sunt sensibile la
penicilină, cefalosporine, vancomicină, tetracicline, metronidazol etc., însă tratamentul
este mai complex.
Diagnosticul de laborator în infecţii cauzate de Acinetobacter
Genul Acinetobacter cuprinde 19 specii dintre care, mai frecvent implicate în patologia
umană sunt speciile:
- Acinetobacter baumannii;
- Acinetobacter lwoffi;
- Acinetobacter calcoaceticus;
- Acinetobacter haemolyticus;
- Acinetobacter junii.
Sunt cocobacililor Gram negativi nefermentativi, aerobi, catalază pozitivi, oxidază
negativi, nepigmentogeni. Bacteriile din genul Acinetobacter sunt larg răspândit în
mediu, colonizează mucoasele, fiind germeni cu potenţial nosocomial cu rezistenţă
naturală faţă de multe antibiotice. Tratamentele antibiotice prelungite favorizează apariţia
infecţiilor.
Patogenie la om:
Cele mai frecvente entităţi clinice având ca etiologie specii de Acinetobacter sunt:
- infecţii respiratorii,
- infecţii ale plăgilor şi arsurilor,
- bacteriemii;
- infecţii de cateter;
- meningite;
- infecţii ale tractului urinar;
- endocardite la cei cu proteze valvulare;
- peritonită la cei cu dializă peritoneală;
- infecţii oculare.
Produse patologice:
- spută;
- aspirat bronşic;
- puroi;
- urină;
- sânge;
- LCR;
- catetere:
Examen direct:
- microscopic: bacili pleomorfi, scurţi, groşi, până la cocoizi, Gram negativi, adesea
dispuşi în perechi. Pe acelaşi frotiu se pot întâlni forme cocoide şi forme filamentoase cu
o lungime de câteva zeci de micrometri. Sunt germeni imobili, frecvent capsulaţi.
Cultura. Creşte pe medii uzuale, geloză simplă, geloză sânge, MacConkey, fiind un
germen nepretenţios. În funcţie de specie cresc la temperaturi cuprinse între 10-35oC.
Identificarea se bsazează pe caracterele:
- morfotinctoriale: sunt bacili pleomorfi, scurţi, groşi, până la cocoizi, Gram
negativi, adesea dispuşi în perechi. Pe acelaşi frotiu se pot întâlni forme cocoide şi forme
filamentoase cu o lungime de câteva zeci de micrometri. Sunt imobili, frecvent capsulaţi.
Pe frotiul colorat Gram adesea pot fi confundaţi cu Haemophilus influenzae;
- de cultură: colonii de tip „S”, rotunde, netede, convexe, lucioase sau mate,
nepigmentate; unele specii produc hemoliză beta pe geloză sânge. Este un germen
nepretenţios, se cultivă pe medii uzuale şi creşte la temperaturi cuprinse între 10-35ºC, în
funcţie de specie;
- biochimice: nu fermentează glucoza (germen nefermentativ), catalază pozitive,
oxidază negative, lactoză negative, nu reduc nitraţii.
Identificarea de specie se face pe baza caracterelor de cultivare (temperatura de creştere)
şi biochimice (acidifierea glucozei, hidroliza gelatinei, hemoliza, auxonograma).
Antibiograma este obligatorie.
Diagnosticul de laborator al infecţiei cu bacterii din genul Treponema (Sifilis)
Microorganismele din acest gen sunt bacterii spiralate, subţiri, foarte mobile. Sunt strict
aerobe sau microaerofile şi sunt foarte pretenţioase nutritiv. Există specii patogene şi
specii care fac parte din flora normală a cavităţii bucale şi a mucoaselor genitale.
Speciile patogene pentru om sunt Treponema pallidum cu trei subspecii: pallidum,
agentul etiologic al sifilisului, subspecia endemicum, agentul etiologic al bejelului şi
subspecia pertenue, agentul etiologic al pianului.
Patogenie. Boala la om
Treponema pallidum este agentul etiologic al sifilisului venerian care se transmite prin
contact sexual, direct cu leziunile ulcerative ale persoanei infectate. La gravidele
infectate, în perioadele de bacteriemie, T. pallidum trece transplacentar determinând
sifilisul congenital. Sifilisul dobândit poate evolua în mai multe etape: sifilisul primar,
secundar, latent şi terţiar. În 2-10 săptămâni de la contactul infectant, la locul inoculării
se formează şancrul dur (cu lichid clar, foarte bogat în treponeme). După alte 2-10
săptămâni apar leziunile secundare (maculopapule roşii, localizate la orice nivel, dar şi
condiloame în diferite regiuni ale corpului.
Diagnosticul porneşte de la elemente clinice şi epidemiologice şi trebuie confirmat prin
metode de laborator; poate fi bacteriologic (direct) sau serologic.
Produse patologice:
- serozitate din şancrul sifilitic (stadiul I.)
- sânge (serologic).
Recoltarea şi transportul p.p. se face cu multă atenţie cu respectarea unor particularităţi.
Produsul patologic poate fi reprezentat de lichidul clar de la nivelul leziunilor primare, de
la nivelul leziunilor secundare sau din ganglionii limfatici regionali etc. Produsul
patologic se recoltează cu grijă după îndepărtarea crustelor care acoperă leziunea (nu
trebuie să producem sângerare).
Examen microscopic: se realizează preparate microscopice între lamă şi lamelă.
Examinarea trebuie făcută rapid, în maxim 20 de minute. Această etapă este deosebit de
importantă. Examen direct microscopic al preparatului nativ se face la microscop cu
fond întunecat. Pentru examenul microscopie pe fond întunecat (MFI), se pregătesc 2
lame pentru fiecare leziune din care au fost recoltate p.p. Preparatele „în aşteptare" sunt
menţinute într-o cutie Petri în care există puţină vată umezită, pentru a păstra atmosfera
umedă şi a preveni uscarea. Preparatul trebuie examinat insistent, cel puţin 10 minute în
cazul unui rezultat aparent negativ. Trebuie să existe antrenament şi experienţă pentru a
identifica aspectele caracteristice: microorganisme foarte subţiri şi lungi, spiralate,
luminoase pe fondul negru al câmpului; mobile - deplasarea nu este foarte rapidă,
seamănă cu o mişcare de înşurubare. Rezultatul pozitiv pune diagnosticul de sifilis
primar. O problemă ar putea fi reprezentată de existenţa treponemelor saprofite, care
microscopic arată foarte asemănător cu Treponema pallidum. EF directă permite
diferenţierea Treponema pallidum de alte treponeme cu ajutorul anticorpilor marcaţi
fluorescent. Pot fi realizare şi preparate colorate: coloraţie Giemsa; coloraţie negativă
(Burri); impregnare argentică (Fontana-Tribondeau).
Rezultatul negativ nu elimină diagnosticul de sifilis; în cazul unui pacient suspect, se
repetă testul după 1 săptămână, 1 lună şi la 3 luni.
Se ia în considerare un rezultat pozitiv în corelaţie cu rezultatul obţinut la testul
treponemic, diagnosticul bacteriologic, elementele clinice şi epidemiologice. Un rezultat
pozitiv în condiţiile în care toate celelalte date sunt negative este, de obicei, un rezultat
fals pozitiv. Pot apărea rezultate fals pozitive la persoane cu hepatită virală acută,
pneumonii virale, rujeolă, malarie, mononucleoză infecţioasă, alte infecţii virale, la
persoane care au fost recent vaccinate, precum şi la persoane cu boli ale ţesutului colagen,
persoane care se droghează, la persoanele în vârstă etc. Reacţiile fals pozitive pot apărea
şi pe parcursul sarcinii. Rezultatul este intens pozitiv atunci când sunt vizualizate
flocoane de dimensiuni mari iar lichidul este clar.
Caractere morfotinctoriale: Treponema pallidum este o bacterie spiralată, cu spire
regulate şi cu capetele drepte. Este foarte subţire şi relativ scurtă având lungimea de 2-20
μm şi grosimea de 0,1-0,3 μm. Este foarte mobilă, mobilitatea fiindu-i asigurată prin mai
multe fibre axiale periplasmice înfăşurate în jurul protoplastului şi inserate la
extremităţile cilindrului protoplasmic prin corpii bazali. Mişcarea caracteristică se
observă prin examinarea treponemelor la microscopul cu fond întunecat unde apar ca
spirochete fine, cu 6 - 14 spire regulate (1,1 μm lungimea de undă şi 0,3 μm amplitudine)
capetele efilate, animate de mişcări graţioase de înşurubare, flexie şi translaţie.
Caractere de cultură: Treponema pallidum nu se poate cultiva pe medii de cultură
artificiale. Poate fi menţinută în viaţă prin inoculări intratesticulare la iepure care
dezvoltă o orhită sifilitică. În acest mod s-a păstrat în laboratoarele de referinţă tulpina
Nichols de Troponema pallidum obţinută în 1912 de la un pacient care a decedat de
neurosifilis. Din această tulpină se prepară antigenele necesare diagnosticului serologic.
Caractere biochimice: Este un germen microaerofil şi pentru că nu poate fi cultivat in
vitro caracterele biochimice nu sunt cunoscute.
Izolare prin metode biologice:
- treponemele patogene nu pot fi cultivate pe medii arificiale;
- inoculare intratesticulară la iepure - orhită sifilitică.
Diagnostic indirect - serologic:
reacţii serologice clasice:
- evidenţierea anticorpilor antilipoidici;
- antigen folosit: cardiolipina;
- reacţia de floculare (VDRL);
- latexaglutinare (RPR). Testul RPR (Rapid Plasma Reagin) se realizează pe cârduri
din material plastic (există mai multe cercuri cu diametrul de 18 mm). Ag este preparat
asemănător VDRL (dar nu mai este necesară inactivarea prin căldură); conţine şi particule
de cărbune. Antigenul RPR este amestecat cu serul de cercetat în cercul de pe cârd. Dacă
există Ac anti-Treponema pallidum, are loc combinarea cu particulele lipidice din Ag şi
rezultă aglutinarea. Apar granule negre pe fondul alb al cârdului;
- reacţia de fixare a complementului (RFC):
- pot apare reacţii fals positive;
- pentru confirmare, diagnosticul se completează cu reacţii moderne
(specifice).
reacţii serologice moderne:
- evidenţiază anticorpii antiproteici;
- antigene folosite - antigene treponemice specifice de gen şi de specie;
reacţii cu specificitate de gen:
- RFC, care utilizează Ag treponemice extrase din T. reiter (specificitate de
grup). Mai importante sunt reacţiile care utilizează Ag treponemice extrase din tulpina
Nichols de Treponema. pallidum (au specificitate mare, de tip);
- CIEF;
Reacţii cu specificitate de specie:
- FTA - Abs (Fluorescent Treponemal Antibody Absorbtion Test). Testele de
imunofluorescenţă indirectă au folosit iniţial serul de cercetat diluat 1/5, ulterior diluţia a
fost de 1/200 (FTA-200). În ultimii 45 de ani s-a utilizat tehnica FTA-Abs, care implica:
obţinerea din tulpina T. reiter a unui extract Ag, util pentru îndepărtarea Ac care nu sunt
specifici pentru T. Pallidum; diluarea serului de la pacient la 1/5; punerea serului în
contact cu extractul care conţine Ag treponemice de grup/Reiter pentru înlăturarea Ac
nespecifici; apoi se practică DF). În cazul în care serul de cercetat este pozitiv, treponemele
apar fluorescente (galben verzui);
- TPHA (reacţie de hemaglutinare pasivă);
- TIT (testul de imobilizare a treponemelor). Serul de cercetat este diluat şi
amestecat cu complement şi treponeme vii, mobile (obţinute din testicul de iepure). Dacă
în ser există Ac specifici, treponemele sunt imobilizate (examinarea se face cu MFÎ);
- ELISA. Tehnica ELISA (detectarea Ac de tip IgM anti-T. pallidum) este
utilă pentru diagnosticul sifilisului congenital. Interpretarea rezultatelor se face în context
clinic, epidemiologie şi de laborator. Dacă atât VDRL, cât şi FTA dau un rezultat negativ,
infecţia este, de obicei, exclusă. Însă, în cazul în care pacientul se află la debutul bolii iar
Ac nu sunt nedectabili (suspiciunea clinică sau epidemiologică persistă), se repetă testele
după 3 săptămâni.
Rezistenţa faţă de agenţii fizici, chimici şi biologici: Treponema pallidum este distrusă
de uscăciune, de temperaturi de 42°C, de săruri de mercur şi bismut, de antiseptice,
dezinfectante. Este sensibilă faţă de antibioticele beta-lactamice, în special, faţă de
penicilină. Treponema pallidum rămâne viabilă mai mulţi ani în suspensia păstrată la -
70°C.
Structura antigenică
Se diferenţiază trei structuri antigenice importante:
- antigenul cardiolipinic. Este prezent la toate treponemele dar şi la alte bacterii, la
unele plante şi în ţesuturile animale, cum ar fi cordul de bou. Acest antigen determină
formarea de anticorpi antilipoidici, denumiţi în trecut şi reagine;
- antigenul proteic Reiter. Are specificitate de gen şi este prezent la toate
treponemele, indiferent dacă sunt patogene sau nu. Împotriva lui se formează anticorpi
antiproteici;
- antigenul specific numai pentru Treponema pallidum. Faţă de acest antigen se
formează anticorpi antiproteici, antipolizaharidici şi imobilizine.
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul Mycobacterium, Corynebacterium,
Diagnosticul de laborator în infecţii produse de Mycobacterium tuberculosis varianta
hominis
Genul Mycobacterium include peste 100 de specii şi subspecii diferite, dintre care
Mycobacterium tuberculosis prezintă importanţă medicală. Germenii din genul
Mycobacterium sunt bacili care nu cedează colorantul nici sub acţiunea combinată a
acidului diluat şi a alcoolului. Din acest motiv se numesc bacilli „acido-alcoolo-
rezistenţi”. Această proprietate se datorează cantităţii mari de lipide şi ceruri din peretele
bacterian. Mycobacterium tuberculosis produce tuberculoză (TB), care poate avea diferite
localizări. Tuberculoza se manifestă sub formă de:
- tuberculoză pulmonară:
• primoinfecţie latentă;
• primoinfecţie manifestă;
• forma cavitară comună;
• pleurezie;
• forme mediastinale;
• forme miliare;
- tuberculoză extrapulmonară, care este rară şi are localizări meningiene, renale,
genitale, osoase, articulare, ganglionare sau digestive. Cea mai frecvent întâlnită este TB
pulmonară.
Epidemiologie: pacienţii cu TB pulmonară (elimină prin spută bacili acid/alcool
rezistenţi/BAAR) şi reprezintă sursa de infecţie. Diagnosticul şi tratamentul corect şi
complet al acestor pacienţi sunt esenţiale.
Diagnosticul poate fi sugerat clinic, paraclinic (radiologie) şi de alte elemente de
laborator, dar trebuie confirmat prin izolarea şi identificarea bacteriei Mycobacterium
tuberculosis.
Diagnosticul de laborator este esenţialmente bacteriologic, direct. Datele obţinute în cadrul
diagnosticului imunobiologic şi serologic pot fi utile şi completa informaţiile.
Produse patologice:
- lichid de spălătură bronşică;
- LCR;
- urină;
- lichide recoltate prin puncţie articulară,
- probe obţinute prin biopsie;
- puroi;
- secreţii vaginale;
- spută.
Recoltarea şi transportul p.p. se realizează cu respectarea anumitor reguli şi a normelor
privind protecţia personalului medical. În tuberculoza pulmonară se recoltează spută
eliminată după un puseu de tuse sau la copii recoltată prin spălătură gastrică.
Sputa trebuie decontaminată (prin tratare cu NaOH 4%) şi neutralizată (cu acid) în vederea
realizării etapelor următoare.
Examen microscopic. Examinarea microscopică a p.p. implică prepararea a minimum 3
frotiuri (colorate A.M., Gram şi Ziehl Neelsen). Se observă la microscop prezenţa
macrofage alveolare de la nivelul tractului respirator inferior, prezenţa celulelor
inflamatorii (PMN) şi prezenţa BAAR. BAAR apar ca bacili subţiri, drepţi, de 0,4/3 μm,
roşii pe fond albastru (celelalte structuri au culoare albastră).
Rezultatele examenului microscopic (TQF/Z-N) trebuie să fie cuantificate prin numărul de
BAAR în raport cu numărul de câmpuri examinate (10-30 câmpuri în cazul 1F, 100-300
în cazul Z-N). De ex. 1-9 BAAR/10 câmpuri (în IF) sau 1-9 BAAR/100 de câmpuri (Z-N)
permite să se noteze în buletinul de analiză 1+ (maxim sunt 4+, la peste 9 BAAR/1
câmp/Z-N). Acest mod de notare permite compararea rezultatelor între laboratoare diferite
sau compararea rezultatelor unui bolnav în cursul tratamentului. Examenul microscopic
negativ nu exclude diagnosticul de TB.
Cultura. Cultivarea se poate face pe 3 grupe de medii de cultură [(lichide, semisolide şi
solide, pe bază de ou (mediul Lowenstein-Jensen)]. La compoziţia mediului L-J se adaugă
verde malachit pentru inhibarea multiplicării unor microorganisme. Pentru izolare este
necesară o atmosferă care conţine 8-10% CO2. Incubarea se face la 35-37°C. Este foarte
important să se examineze mediile în fiecare zi (în prima săptămână după inoculare),
ulterior săptămânal până la împlinirea a 6-12 săptămâni (Mycobacterium tubercidosis are
o rată de diviziune de 12-27 ore). Există şi metode de cultură „rapide:
sisteme bifazice de izolare şi identificare care detectează Mycobacterium
tuberculosis în 20 de zile;
sisteme respirometrice care constau în detectarea radiometrică sau fotometrică a
CO2 eliminat în metabolismul bacterian evidenţiind creşterea bacteriană în 15 zile;
-metode chimice, cromatografice de analiză a acizilor micolici din peretele
bacterian permit identificarea de specie;
reacţii de tip PCR aplicabile direct produsului patologic permit un diagnostic în
câteva ore şi au o mare sensibilitate;
metode de hibridare a ADN-ului şi ARN-ului bacterian cu sonde marcate sau
detectarea acidului tuberculo-stearic prin cromatografie gazoasă şi spectrometrie de masă
sunt metode rapide de identificare a tulpinii de Mycobacterium tuberculosis.
Identificarea microorganismului se realizează pe baza caracterelor:
• morfotinctoriale: BAAR;
• de cultură: Mycobacterium tuberculosis formează colonii de tip „R”, rugoase,
grunjoase, nepigmentate sau pigmentate crem-bej, cu suprafaţa zbârcită, uscate,
conopidiforme asemănate cu firimiturile de pâine. Pe mediul lichid Mycobacterium
tuberculosis creşte sub forma unei membrane groase, cu multe pliuri, care se ridică pe
peretele flaconului de cultură. Astfel de creştere pe medii de cultură o numim creştere
eugonică (abundentă, optimă). Tulpinile de Mycobacterium tuberculosis rezistente la
HTN pot forma colonii „S”;
• biochimice: bacterie strict aerobă, produce:
- acid nicotinic sau niacină;
- nitrat-reductază, catalază, urează;
- este sensibil faţă de pirazinamidă;
- este rezistent faţă de hidrazida acidului tiophen-2-carboxilic;
antigenice (se examinează în centre de referinţă). Mycobacterium tuberculosis
prezintă la nivelul peretelui celular următoarele structuri antigenice:
- tuberculolipidele reprezentate de acizii micolici, ceruri şi alcooli superiori. În
peretele tulpinilor patogene se găseşte un sulfo-lipid care induce dezvoltarea pe cultură
sub formă de cordoane: „cord-factor”;
- tuberculoproteinele induc sensibilizare de tip anafilactic iar în asociere cu
tuberculolipide induc răspuns imun predominant celular;
- polizaharidele induc formarea de anticorpicirculanţ;
• de patogenitate: Mycobacterium tuberculosis este patogen pentru cobai.
Antibiograma este necesară, se realizează conform recomandărilor Programului Naţional
de Control al TB şi se efectuează paralel cu identificarea. Se pot utiliza metodele: metoda
proporţiilor, metoda rapoartelor de rezistenţă etc.
Diagnosticul imunobiologic presupune detectarea stării de sensibilizare faţă de
proteinele bacilului tuberculos prin intradermoreaţii şi are la bază un mecanism de RIC.
Se utilizează BDR cu PPD.
Diagnosticul serologic se bazează pe răspunsul imun de tip umoral (Ac anti-
micobacterieni pot fi evidenţiaţi prin tehnica ELISA). În diagnosticul TB nici un element
nu poate fi considerat ca fiind lipsit de importanţă într-un context clinic, paraclinic şi
epidemiologic.
Diagnosticul de laborator al infecţiilor cauzate de genul Corynebacterium
Genul Corynebacterium reuneşte microorganisme care se caracterizează prin prezenţa în
compoziţia peretelui celular a:
- acidului mezo-diaminopimelic;
- acizilor micolici cu catenă scurtă (22-38 atomi de C).
Conţinutul de GC este cuprins între 46-74%.
Prezintă asemănări cu microoganismele din genurile Mycobacterium şi Nocardia.
Genul Corynebacterium cuprinde:
corinebacterii fitopatogene;
corinebacterii patogene pentru animale, care afectează accidental omul:
Corynebacterium pseudotuberculosis, Corynebacterium ulcerans;
corinebacterii cu tropism uman:
- specie patogenă: Corynebacterium diphtheriae (biovaruri: gravis, mitis,
intermedius). Colonizează frecvent rinofaringele, mai rar tegumentul. Există şi purtători
sănătoşi;
- specii comensale (specii pseudodifterice, difteroizi): Corynebacterium xerosis,
Corynebacterium jeikeium, Corynebacterium pseudodiphthericum, etc
Diagnosticul de laborator în difterie
Bacterie patogenă: Corynebacterium diphtheriae.
Produsul patologic:
- falsă membrană, secreţie faringiană;
- secreţie nazală la purtători;
- secreţie conjunctivală, vulvară, din plăgi.
Recoltarea se face cu 3 tampoane. Ca medii de transport şi îmbogăţire se pot folosi:
geloză-ser semilichidă cu telurit de K; mediul OCST (ou-cistină-ser-telurit).
Examen microscopic:
Cu primul tampon se efectuează 3 frotiuri:
frotiu colorat Gram pentru observarea morfologiei şi dispoziţiei spaţiale a
bacteriei Corynebacterium diphtheriae - bacil Gram pozitiv, uşor încurbat, cu capetele
măciucate, dispus caracteristic (litere chinezeşti, chibrituri aruncate pe masă);
frotiu colorat Neisser pentru evidenţierea corpusculilor metacomatici Babes-
Ernst. Corynebacterium diphtheriae prezintă corpusculi metacromatici la capete;
frotiu colorat Giemsa pentru diagnosticul diferenţial cu angina fuso-spiralară pe
frotiu când se evidenţiază fusobacterii şi forme spiralate (Treponema vincenti).
Cultura. Tamponul al doilea se însămânţează pe mediul de îmbogăţire OCST şi se
incubează 12-18 ore, după care se izolează pe medii caracteristice.
Tamponul al treilea se descarcă pe medii de cultură folosite pentru izolare şi identificare.
Caractere morfotinctoriale ale Corynebacterium diphtheriae:
Bacterii (bastonaşe) de 1-8 μm x 0,3-0,8 μm, drepte sau puţin încurbate, cu extremităţile
rotunjite sau îngroşate (aspect de halteră sau de măciucă), datorită granulaţiilor de
volutină (corpii Babeş-Ernst). În frotiuri se aranjează ungiular, în palisade sau sub forma
caracterelor chinezeşti, cifre romane sau litere majuscule: Y, M, N, V, imobile,
asporogene, necapsulate. Se colorează G+, pentru evidenţierea granulaţiilor de volutină -
Loeffler, Neisser
Caractere de cultură:
Corynebacterium diphtheriae este o specie facultativ anaerobă, exigentă la cultivare,
temperatura optimă de cultivare fiind de 37°C, pH 7,4.
Medii de cultură elective:
mediul Löffler (ser bovin coagulat): colonii “S”, caracteristice‚ circulare‚ uşor
crenelate‚ mici, netede, opace, albe-gălbui sau albe-cenuşii, apar peste 16-24 ore de
cultivare;
geloză-sânge - colonii albe-gri‚ perlate‚ friabile.
Medii de cultură selective diferenţiale:
mediul Clauberg (geloză-sânge cu telurit de potasiu). Corynebacterium
diphtheriae gravis: colonii “R”‚ mari, negre (reducerea teluritului în teluriu), crenelate,
aspect de “floare de margaretă”, nehemolitice; mitis: colonii “S”, mijlocii, negre,
bombate, cu zonă de hemoliză ;
mediul Tinsdale (geloză-ser-cistină-telurit de potasiu-tiosulfat) - colonii negre cu
halou brun;
mediul Bucin (geloză-sânge cu hinozol) - colonii albastre;
mediul Gundel Tietz - se diferenţiază cele trei tipuri de bacil difteric:
- tipul gravis - colonii negre‚ de tip “R”‚ plate‚ cu margini crenelate‚ centrul
mamelonat‚ cu striaţiuni radiare‚ ca o “floare de margaretă”;
- tipul mitis - colonii negre‚ de tip “S”;
- tipul intermedius - colonii de tip “S-R”;
bulion:
- tipul gravis - formează peliculă la suprafaţă‚ restul mediului rămâne clar;
- tipul mitis - tulbură uniform mediul;
- tipul intermedius - formează inel la suprafaţă‚ depozit si tulbură uniform
mediul.
Caractere biochimice:
- producerea de H2S - se studiază pe mediul PISU (cu cisteină);
- ureaza- (testul Zaks), cistinaza+ (testul Pizu), indol-;
- fermentarea zaharurilor (metabolism zaharolitic): în funcţie de fermentarea
monozaharidelor (glucoză‚ maltoză si zaharoză)‚ bacilii difterici se pot încadra în specie
(Corynebacerium diphtheriae‚ hoffmanii‚ xerosis); în funcţie de fermentarea
polizaharidelor (dextrină‚ amidon si glicogen)‚ se face încadrarea Corynebacterium
diphtheriae în tip:
- gravis: glucoza+, amidon+, zaharoza-
- mitis: glucoza+, amidon-, zaharoza-
- intermedius.
Posedă catalază, citocromi a, b, c şi este oxidază- .
Caractere de patogenitate - cercetarea producerii de exotoxină difterică:
teste in vivo;
teste in vitro;
testul Elek - reacţie de precipitare în gel:
- se toarnă geloză peste o hârtie de filtru impregnată în ser antidifteric;
- se însămânţează în striuri tulpinile de cercetat;
- dacă o tulpină produce exotoxină difterică (Ag)‚ aceasta este eliberată în mediu
şi apare o bandă de precipitare;
testul Ramon - reacţie de floculare prin care se dozează putere toxică a toxinei.
Diagnosticul indirect
IDR Shick - IDR de neutralizare. Se injectează strict intradermic 1 unitate de
toxină. Dacă organismul nu are anticorpi‚ toxina îşi exercită efectul şi la locul inoculării
apare un eritem - organism receptiv.
Dacă organismul are anticorpi‚ acestia vor neutraliza toxina‚ deci nu apar modificări la
locul inoculării - organism imun;
Reacţii de hemaglutinare pasivă - determinarea cantitativă a antitoxinelor.