Examenul bacteriologic al sputei

Examenul bacteriologic al sputeiDiagnosticul bacteriologic al infectiilor bronho-pulmonareExamen de sput - prelevarenainte de administrare de antibioticedimineaa la prima or (ideal)pe nemncatedup periaj dentar (fr past de dini)dup cltirea energic a gurii cu apdup gargar cu apvolum ideal: 1-3 ml prob mucopurulenttransport n recipient steril n maxim 1h3Examenul de sputColoraia Field - proba valid:> 50% neutrofile si < 10% celule epiteliale> 25 neutrofile si < 5 celule epiteliale / cmp microscopic mareColoratie Gram:germeni intracelulari = criteriu de patogenitateflora dominant: coci/bacili, G(+)/G(-)Cultur pe diferite medii - analizat n contextul clinic si al microscopiei !!!Examenul de sputIzolarea bacteriei responsabile de pneumonie:prob clinic valid (criteriu citologic)frotiu cu dominana acelui germen (de exemplu coci G(+) izolai sau n diplo)izolarea n cultur a germenului respectivIn alte situatii incriminarea germenului dominant pe frotiu sau izolat din cultur este incertExamenul de sput - erorisaliv si nu sputbolnavul este sub antibioterapie eficient de mai multe zilepneumonia survine pe fondul unei alte afeciuni cu prezen bacterian: BPOC, broniectaziisuprainterpetarea prezenei de micelii sau de alte bacterii saprofite

Examenul de sputNONINFORMATIV desi ESTE pneumonieetiologie viralMycoplasma sau ChlamidiaLegionellaTuberculoz: coloraie Ziehl-NeelsenIMPORTAN MAI DEGRAB LIMITATSURS DE ERORIDiagnosticul bacteriologic al TB pulmonare RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE PENTRU DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (I)Pentru diagnosticul TB pulmonare: Sputa spontan expectorata sau indus (cu aerosoli de soluie salin) este produsul patologic de elecie Recoltarea sputei se efectueaz:n spaii special destinate, care respecta msurile de control al infeciilor, denumite camere de recoltare a sputei,dup instruirea prealabil a bolnavului privind tehnica recoltrii sputei, sub supravegherea unui cadru medical, si cu existentacondiiilor optime de pstrare a produselor biologice.

9 RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE PENTRU DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC (I)Recoltarea se face n recipiente corespunztoare, din material plastic, incasabil, transparent, nu obligatoriu sterilecu deschidere larg, de cel putin 4 5 cm, prevzute cucapac ce permite nchiderea etan, si cuposibilitatea de inscripionare a datelor de identificare ale pacientului in partea lateral a recipientului si NU pe capac. Pentru diagnosticul TB extrapulmonare, se preleveaz lichid din seroase, lichid cefalorahidian, urin, punctat ganglionar sau articular, fragmente bioptice. Recoltarea se face n condiii sterile stricte pentru a evita contaminarea produselor i a permite efectuarea culturilor fr decontaminare prealabil.

10 RECOLTAREA PRODUSELOR PATOLOGICE (II)SPUTA: Trebuie prelevate cel putin 3 mostre de sputa de cate 3 5 ml fiecare, in scop diagnostic

CALIATEA PRELEVATELOR este deosebit de importanta pentru diagnostic. Sputa de bun calitate:-Este frecvent vascoas si mucoid-Poate fi fluid, dar cu fragmente de tesut necrozat-Poate fi stratificat in culori de la alb la verde

Cel putin unul din cele 3 esantioane trebuie recoltat dimineata devreme, imediat dup trezire, iar celelalte 2 in unitatea medicala, sub supraveghere, dup cum urmeaz:Primul esantion se va recolta la prima consultatie la care se suspicioneaz TB, sub supraveghere medical.Al doilea esantion autorecoltare a sputei matinale; pacientul aduce acest esantion in unitatea medical in aceeasi zi sau cel tarziu a doua zi (in acest caz sputa trebuie pstrat la rece, la cel mult 4 grade Celsius). Interval minim de recoltare = 48 ore Nu se accept prelevrile tuturor celor 3 esantioane pe parcursul a 24 ore, datorit sensibilittii sczute (concentratia bacililor in sput se dilueaz in urma recoltrilor frecvente, ceea ce duce la scderea sensibilittii examenului microscopic).

11 DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL MICROSCOPIC (I)Examenul microscopic se practic pe frotiu din proba clinic respectiv i Identific micobacteriile punnd n eviden proprietatea de acid-alcoolo-rezisten. Aceast proprietate tinctorial const n fixarea solid a anumitor colorani n corpii bacilari, fixare care rezist selectiv aciunii decolorante a acizilor i alcoolului. Acest caracter persist att la germenii mori ct i la cei cu viabilitate redus.

12 DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL MICROSCOPIC (II)TEHNICA EXAMINARII MICROSCOPICE Frotiul Ziehl-Neelsen1. Coloraia Ziehl-Neelsen este standardul de referin i const din urmtoarele etape principale: Sputa se aplic pe lam cu ansa bacteriologic, se usuc la aer i se fixeaz prin nclzire, pan la emisia de vapori. Se coloreaz cu fuxin la cald pentru a permite ptrunderea colorantului prin peretele micobacterian; astfel micobacteriile se coloreaz n rou;Se decoloreaz cu acid-alcool (alcool 70 i acid sulfuric) pn la dispariia macroscopic a coloraiei roii; astfel, se decoloreaz toate structurile cu excepia micobacteriilor care rmn colorate n rou;Se recoloreaz cu albastru de metilen (pentru evidenierea celularitii - epitelii, celule sanguine,etc.).Examenul se face la microscopul optic cu obiectiv cu imersie, micobacteriile aprnd ca nite bastonae subiri, roii, uor incurbate, pe fond albastru. Micobacteriile apar mai mult sau mai puin granulare, izolate sau grupate n perechi sau grupuri sub form de sfori, genarand aspectul numit cord factor, care reprezint marker de patogenitate.

13ASPECTUL BAAR LA COLORATIA ZIEHL - NEELSEN

Bacili tuberculosi

frotiu de sputa ce arata pe langa celule si alte resturi colorate in albastru si numerosi bacili colorati in rosu adica BAAR (Ziehl-Nielsen, 1000x) DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL MICROSCOPIC (III)Se numr BAAR de pe 100 de cmpuri microscopice. Rezultatele se exprim semicantitativ n funcie de densitatea bacililor de pe lam.1 9 Bacili Acid Alcoolo Rezistenti (BAAR)/ 100 c (campuri)1+ = 10-99 BAAR/100 c2+ = 1-9 BAAR/camp3+ 10 BAAR/camp Microscopia este o metod simpl, rapid, ieftin, uor repetabil i de importan epidemiologic major: permite descoperirea marilor eliminatori de bacili, care pot fi izolai i tratai cu promptitudine maxim, reducnd pericolul de infecie i mbolnvire la contaci. Are ns o sensibilitate relativ redus, nepermind identificarea agentului patogen dect n sputa intens bacilifer care contine 100.000 bacili/ ml sput; nu ofer informaii asupra viabilitii germenilor i Are specificitate scazut: nu permite deosebirea bacililor tuberculoi de bacilli saprofii sau atipici.

16 DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC EXAMENUL MICROSCOPIC (IV)2. Coloratia cu auramin-rodamin este o tehnica alternativa de identificarea a MTB la examenul microscopic. Aceasta tehnica are o sensibilitate crescut, putand decela 5000 10.000 bacili/ml, ins aceasta metoda necesit abilitti tehnice deosebite si trebuie efectuata doar in laboratoare in care controlul de calitate dovedeste ca aceste abilitati tehnice pot fi realizate.

17

ASPECTUL BAAR LA COLORATIA AURAMINA -RODAMINAcoloratie cu auramina O vizualizata in microscopul cu fluorescenta, 1000x DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC CULTURA MTB (I)Este metoda de referin pentru diagnosticul tuberculozei, avnd sensibilitatea i specificitatea cea mai mare.

Cultura MTB pe mediul Lwenstein Jensen este considerata standardul de aur in diagnosticul TB

Sensibilitate: rezultate pozitive chiar pentru sputele paucibacilare (10-100 germeni inoculai/ml de produs)

Specificitate: permite stabilirea identitii micobacteriilor (bacili umani, bovini sau atipici)

Demonstreaz viabilitatea germenilor izolai i,

Permite testarea sensibilitii bacililor la medicamentele anti-tuberculoase: antibiograma (ABG).

19 DIAGNOSTICUL BACTERIOLOGIC CULTURA MTB (II)TEHNICA CULTIVARII MTB PE MEDIUL LWENSTEIN JENSENProbele clinice contaminate (n special sputa) trebuie decontaminate cu NaOH i omogenizate. Ulterior se centrifugheaz i Apoi se neutralizeaz cu un acid (acid fosforic sau HCl).Produsul astfel preparat, sau direct n cazul probelor clinice sterile, se inoculeaz pe mediile de cultur (cel putin 3 tuburi cu mediu Lwenstein Jensen).Perioada necesar pentru identificarea creterii micobacteriilor pe mediul Lwenstein Jensen este de 4-6 sptmniExprimarea rezultatului la cultura de pe mediul Lwenstein Jensen se face tot prin exprimare semicantitativa, pentru fiecare dintre cele 3 tuburi:1 30 col1+ = 20-100 colonii/tub2+ 100 colonii izolate3+ - colonii confluente

20

ASPECTUL MACROSCOPIC TIPIC AL CULTURILOR MTB PE MEDIUL LOVENSTEIN JENSENCulturi de Mycobacterium tuberculosis pe mediul Lowenstein-JensenASPECTUL MACROSCOPIC TIPIC AL CULTURILOR MTB PE MEDIUL LOVENSTEIN JENSEN: COLONII ALB-GALBUI, RUGOASE, CONOPIDIFORME DE TIP ROUGH R)