Izolarea şi confirmarea

speciei Listeria monocytogenes

IZOLAREA ŞI CONFIRMAREA LISTERIA DIN PRODUSE ALIMENTARE

• Genul Listeria spp., cuprinde ca principal reprezentant specia L. monocytogenes şi speciile înrudite subdivizate în 16 serovariante.

• Pentru microbiologia alimentară interesează în mod deosebit L. monocytogenes, deoarece aceasta este patogenă pentru om şi animale.

• Pop şi Nicolau, (1994), consideră că cel puţin 40% din cazurile de îmbolnăvire au origine alimentară.

• Ene Livia şi colab., (1994), consideră că din 81 de tulpini de Listeria izolate, 74 tulpini, deci 91,36 sunt L. monocytogenes şi 7 tulpini, respectiv 8,64% au fost L. Ivanovii .• Carnea crudă şi organele (creierul) în special de oaie, carnea de porc, ş.a. preparatele din carne, produsele culinare, peştele şi mai ales proodusele din peşte etc., pot fi contaminate cu listerii. • Păstrarea la frigider, favorizează multiplicarea Listeria, deoarece este recunoscut ca fiind un germene psihrotrof, iar temperaturi de 2-50C îmbogăţesc alimentele în listerii.

Genul Listeria cuprinde următoarele specii:

•Listeria mponocytogenes cu rol cert în

producerea îmbolnăvirilor la om,•Listeria ivanovii, •Listeria murayi,•Listeria grayi, •L. welshimeri .

• Listeria spp., se dezvoltă pe medii obişnuite, pe bulion nutritiv şi pe geloză simplă, preferând mediile cu sânge sau ser şi mediile care conţin zaharuri.

• Temperatura optimă de incubare este de 20-240C, la care produce culturi bogat ciliate în medii lichide.

• Mobilitatea listeriilor este caracteristică şi se manifestă prin mişcări de înaintare însoţite de rostogolire, datorită învârtirii în sensul acelor de ceasornic, datorate discului M de la baza flagelului.

• L. monocytogenes este aerobă şi microaerofilă;• Se dezvoltă bine la pH de 5-9,0, cu un optim de

7,2-7,6 şi în limite largi de temperatură; de la 300C la 370C.

• Pe suprafaţa agarului cu sânge , la 370C, în 48 de ore formează colonii mari de 0,4-1,5 mm, translucide, gri-albicioase, care devin opace pe măsura trecerii timpului.

• Listeria monocytogenes este o bacterie Gram pozitivă, care se prezintă sub formă de bastonaşe fine, cu o lungime de 1-8 microni şi o lăţime de 0,3-0,8 microni, cu capetele rotunjite. Prezintă dispoziţie caracterisică sub forma literelor V, Y sau în palisadă. Sunt izolate sau grupate câte două, paralel sau în lanţuri.

• Este asemănătoare morfologic cu bacilul rujetului. Prezintă însă deosebiri de mobilitate, respectiv listeria are o mobilitate accentuată mai ales la temperaturi de 18-200C, dar care lipseşte sau este prezentă la rare elemente bacteriene la 370C. Mobilitatea listeriei se datorează celor 1-4 cili prezenţi, dispuşi peritrich. Listeria nu capsulează şi nu formează spori.

• Mobilitatea şi producerea cililor este determinată de temperatura de dezvoltare.

• Pe bulionul simplu, după 24 de ore se observă creştere microbiană, mediul devine tulbure, iar la agitare se produc valuri, ceea ce constituie o caracteristiă culturală distinctă.

• Uneori la suprafaţa mediului formează o peliculă. Prin învechire cultura sedimentează şi formează un depozit vâscos aderent, care prin agitare determină formarea unei spirale ce se ridică din profunzimea mediului până la suprafaţă.

• Pe geloza nutritivă formează colonii mici, uniforme, fine, semitransparente, nepigmentate, cu reflexe albăstrui, aspect evidenţiate mai bine atunci când coloniile sunt examinate în lumina naturală şi la un unghi de 450.

• Pe agar sânge – în jurul coloniilor se constată o zonă foarte mică de hemoliză, fiind uneori nevoie de îndepărtarea coloniilor pentru a constata zona de hemoliză.

• Deşi se consideră că listeriile sunt hemolitice, unii autori nu au putut stabili nici o corelaţie între capacitatea hemolitică şi gradul de patogenitate.

• Dezvoltarea este favorizată de prezenţa unor vitamine şi aminoacizi prezenţi în sânge şi ser, de prezenţa argininei, histidinei, metioninei şi triptofanului

• METODA ORIZONTALĂ SR ISO 11 290/2005, prevede mai multe etape de lucru:

• 1. ETAPA PREÎMBOGĂŢIRE - presupune introducerea probei (25 g) în 225 ml de bulionul semiFraser, incubată la 300C, timp de 18-24 ore.

• 2. ETAPA ÎMBOGĂŢIRE - utilizează ca medii de îmbogăţire selectivă bulionul Fraser.

• Izolarea selectivă - a fost efectuată prin însămânţarea prin striere, în mod obligatoriu a primului mediu – un mediu cromogen - Compass L. mono de ex., iar al doilea mediu utilizat la alegere Oxford sau Palcam.

• Selectarea coloniilor cu aspect morfologic caracteristic. Metoda utilizează mediului Compass L. mono, mediu cromogen foarte practic. Confirmarea s-a efectuat prin subcultivarea coloniilor şi confirmarea tulpinilor obţinute prin teste morfologice, biochimice etc.

• Interpretare

• Însămânţarea mediului Palcam şi prezenţa Listeria este vizualizată astfel:

• colonii de dimensiuni mici, de 0,5-1mm, culoare gri, cu un halou negru în jurul acestora după incubare 18-24 de ore şi

• colonii de 1-2mm, gri-verzui, cu halou extins în jurul coloniilor.

• Selectivitatea mediului ete asigurată de acriflavină, ceftazimidă şi polimixină. Mediul încorporează:

• un sistem indicator pe bază de esculină şi fier, care în prezenţa Listeria se percepe o coloraţie neagră a coloniilor şi un halou negricios, datorată hidrolizei esculinei în prezenţa fierului şi

• un indicator cu manitol şi roşu fenol care recunoaşte contaminarea cu suşe Staphylococcus şi Enterococcus care fermentează manitolul.

Listeria spp. in Palcam medium

Interpretare:

Pe mediul OXFORD Listeria •prezintă colonii de dimensiuni mici, de 0,5-1mm,

culoare gri, gri-oliv, cu un halou negru în jurul acestora după incubare 18-24 de ore şi •colonii de 1-2mm, gri-închis sau negru, cu halou

extins în jurul coloniilor sau în toată masa mediului dacă s-a dezvoltat un număr mai mare de colonii.

Listeria spp., pe mediul Oxford

Principiul – utilizării mediului COMPASS L. mono• condiţii excelente pentru creşterea L.

monocytogenes,• clorura de sodiu menţine echilibrul osmotic în

mediu,• Listeria hidrolizează X-glucozida, rezultă un produs

din precipitat de culoare albastră, atât în centrul coloniei, cât şi în masa coloniei,

• microflora bacteriană de asociaţie este inhibată de clorura de litiu şi a unele ceftazimide.

Pe mediul mediul COMPASS L. Mono cololoniile sunt albastru-verzui, înconjurate cu un halou opac, după incubare 24-48 de ore, în culturile tipice, sunt considerate L. monocytogenes,

•colonii albastru-verzui, fără halou în jurul coloniilor, sunt considerate alte specii de Listeria spp.

Listeria monocytogenes in Compass L. mono medium

4. CONFIRMAREA s-a efectuat prin subcultivarea coloniilor şi confirmarea tulpinilor obţinute prin teste morfologice, biochimice etc. Testele biochimice obligatorii pt. Listeria spp.:• testul mobilităţii - pozitiv,• testul hemolizei - variabil,• testul Camp - variabil,• fermentarea zaharuri,• reacţia indolului - negativ,• reacţia esculinei - pozitiv .

• Pentru identificarea speciei L. monocytogenes, se verifica următoarele caractere biochimice:

• Fermentarea xilozei - NEGATIV şi ramnozei - POZITIV;

• hidroliza esculinei - POZITIV,

• testul oxidazei - NEGATIV ,

• Testul hemolizei – POZITIV,

• Testul CAMP - POZITIV la STAPHYLOCOCCUS AUREUS,

• - NEGATIV la RODCOCCUS EQUI.

• .

Izolarea şi confirmarea

Clostridiilor sulfito-reducătoare

în produsele alimentare de origine animală

- Bacteriile anaerobe aparţin unei mari varietăţi de familii şi genuri, care în ultimii ani au suferit profunde remanieri taxonomice, datorită rezultatelor obţinute prin intermediul biologiei moleculare.

- Procesul, care este încă în derulare, vizează unii taxoni ai bacteriilor anaerobe nesporulate, în special genurile Bacteroides, Peptococcus, Peptostreptococcus .

• Clostridiile sunt larg răspândite în sol, la nivelul colonului omului şi animalelor.

• Unele clostridii produc îmbolnăviri cu sindroame specifice: tetanosul, botulismul, gangrene gazoase sau emfizematoase, ş.a.

• Aspectul microscopic al clostridiilor este important, deoarece aceste bacterii au morfologie distinctivă, relativ carcteristică, sunt Gram pozitive, sub formă de bacil, sunt anaerobe nesporulate, prezintă morfologie caracteristică.

• Clostridiile care produc lecitinază pot fi cultivate pe medii cu gălbenuş de ou, cum este mediul Nagler.

• Clostridiile lecitinazo-pozitive sunt următoarele: Cls. perfringens, Cls. novyi, Cls. bifermentans, Cls. sordelii şi Cls. baratii.

• Clostridiile lecitinazo-negative sunt: Cls. botulinum, Cls. butyricum, Cls. cadaveris, Cls. clostridiiforme, Cls. dificile, Cls. histolyticum, ş.a.

• Cls. perfringens este Gram pozitiv, de formă bacilară, bacilii sunt scurţi, aşezat izolat sau grupaţi câte doi, având capetele tăiate drept asemănător cu B. anthracis sau uşor rotunjite.

• Cls. perfringens este anaerob, fiind în acelaşi timp anaerobul cel mai tolerant faţă de oxigenul liber.

• Lungimea bacilului variază între 0,8-6 micrometri, iar lăţimea este de 0,8-1,2 micrometri, fiind astfel cea mai groasă clostridie.

• În frotiurile directe efectuate din carne proaspătă contaminată, dar mai ales din organe, colorate prin metoda Gram sau cu albastru de metilen se observă un spatiu liber, necolorat în jurul bacterie care corespunde capsulei sale.

• Bacilul este aciliat, imobil. El poate forma capsulă în organismul animal, dar şi în mediile cu ser. În culturile proaspete este Gram pozitiv, dar în culturile vechi (au reacţie acidă), devin Gram negativi.

• Creşte la temperaturi de 45-47°C, aceasta fiind considerată selectivă şi diferenţială în acelaşi timp, în mod deosebit faţă de Cls. botulinum, dar şi faţă de celelalte clostridii. ETAPA DE ÍMBOGATIRE

• pe bulion cu ficat sau bulion cu tioglicolat, bulion-glucoză-amidon-cistină,

• ETAPA DE IZOLARE SELECTIVA

• se pasează pe medii solide de tipul agar cu sulfit şi polimixină B-neomicină, agar cu sulfit polimixină-sulfadiazină (SPS), agar cu lactoză gălbenuş de ou şi neomicină (Willis-Hobbs), agar Zeissler cu neomicină.

• pe mediile lichide bacilul are creştere abundentă cu producere de gaze şi tulbură intens mediul, creşterea devenind observabilă în 4-6-8ore,

• în cazul însămânţărilor abundente sau în cazul unui număr mare de bacterii care se găsesc în substrat (alimente). La 12 ore de la însămânţare cultura începe să sedimenteze iar mediul lichid începe să se clarifice.

• Se dezvoltă bine pe mediu cu lapte eventual turnesolat, în care produce un coagul buretos, care se retractă reprezentând cam 1/5 din volumul iniţial.

• Aceste caractere stau la baza testului cu lapte turnesolat care se efectuează în microbiologia alimentară.

• În bulionul cu sânge produce hemoliză, mediul căpătând o coloratie brună şi un miros de acid butiric, deşi în prezent testul producerii hemolizei se practică mai frecvent pe medii solide.

• Aspectul coloniilor pe agar Zeissler este de: colonii mari, netede, lucioase, uşor bombate, uneori pigmentate în verde şi inconjurate de hemoliză beta, dar şi de o zonă mai largă de hemoliză incompletă.

• Pe agarul Willis-Hobbs, Cls. perfringens produce colonii roşii datorită acidului produs din fermentarea lactozei, înconjurate de un halou opac rezultat din activitatea lecitinazică.

• Cls. perfringens se dezvoltă pe ser coagulat fară să producă lichefierea acestuia. Pe mediul cu creier, se dezvoltă abundent, fără să-l înnegrească, dar producând o coloraţie roşie, mai mult în profunzime.