Informatii-culturi in Vitro

8/11/2019 Informatii-culturi in Vitro

1/18

http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/metode-utilizate-in-microbiologie-78

Metode utilizate in microbiologie

Pentru probarea diagnosticului, se recomanda urmatoarele analize si investigatii:Frotiul

Depistarea rapida a microorganismelor si studiul morfologiei necesare unui diagnosticmicrobiologic corect se realizeaza prin examen microscopic.Examenul microscopic poate fi proaspat, intre lama si lamela sau fixat si colorat. Prin frotiu seintelege material microbian (produs patologic sau cultura microbiana) etalat in strat subtire pesuprafata unei lame de microscop. Pentru efectuarea unui frotiu se folosesc lame de microscopcurate si degresate care se marcheaza la una din extremitati cu numele pacientului si materialulmicrobian ce urmeaza a fi etalat.Pentru fiecare produs patologic obisnuit se efectueaza 2 frotiuri (exceptie fac lichidele de punctiedin care se fac 4 frotiuri), unul se coloreaza Gram (pentru evidentierea bacteriilor), iar al doileaGiemsa (pentru celularitate).Frotiul din produs patologic poarta denumirea de examen microscopic colorat si are un rol

deosebit in bacteriologia medicala. El ajuta in:- orientarea catre un diagnostic rapid in caz de urgenta medicala (ex.meningita bacteriana);- orientarea microbiologului in respingerea unor produse patologice necorespunzatoare(ex.saliva, in loc de sputa);- corelarea dintre acesta si cultura, ce permite trecerea de la diagnosticul prezumtiv ladiagnosticul de certitudine.Aproape toate bacteriile cu importanta clinica pot fi detectate la examenul microscopic colorat,exceptie facand: acele bacterii care traiesc aproape exclusiv intracelular e.g. Chlamydia, celecare se gasesc in peretele celular (ex.Mycoplasma si Ureaplasma) si cele care au dimensiuniinsuficiente pentru a fi vizualizate la microscop (ex.spirochetele).

Coloratiile folosite in bacteriologie sunt:1. Coloratiile simple - utilizeaza un singur colorant si evidentiaza doar morfologia microbilor:dimensiune, forma, gruparea celulelor, prezenta capsulei. Dintre coloratiile simple, uzuala sirapida este coloratia cu albastru de metilen care coloreaza in albastru toate elementele celulare:

bacterii, leucocite, celule epiteliale.2. Coloratiile diferentiale - evidentiaza in afara caracterelor morfologice si reactiile de culoareale microbilor.Coloratia Gram si coloratia Ziehl-Neelsen (Z.N.) sunt cele mai utilizate in

bacteriologie.Comportarea diferita a bacteriilor in coloratia Gram tine de diferentele structuraleale peretelui bacterian. Bacteriile Gram-pozitive apar colorate in violet, iar cele Gram-negativein rosu. Leucocitele si celulele epiteliale apar cu citoplasma colorata in roz si nucleul in rosu.

Coloratia Ziehl-Neelsen este folosita pentru identificarea urmatoarelor grupe de bacterii:Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella si oochistii de Cryptosporidium,Isopora, Sarcocystis si Cyclospora.Uzual in bacteriologie coloratia Z.N. este folosita pentrudecelarea Mycobacteriilor. Acestea, spre deosebire de alte bacterii, datorita prezentei in peretele

bacterian a unor substante ceroase, se coloreaza la cald cu fucsina bazica si rezista la decolorareacu acizi minerali diluati si cu alcool. Bacilii acido-alcoolo-rezistenti apar colorati in rosu, iar

bacteriile neacido-rezistente apar colorate in albastru la fel ca leucocitele si celulele tisulare, acaror citoplasma se coloreaza in albastru deschis cu nucleul albastru inchis.In timp s-au dezvoltat numeroase modificari de la metoda originala descrisa de Ziehl in 1882 si

Neelsen in 1883, cea mai utilizata fiind cea descrisa de Kinyoun.3. Coloratii speciale pentru structuri particulare ale unor bacterii (capsula - tus India; granulatiimetacromatice - Del Vecchio, spori-verde malachit).Controlul intern de calitate al frotiurilor este obligatoriu si se face cu martor pozitiv si negativ.Incazul coloratiei Gram folosim urmatorii martori:
http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/metode-utilizate-in-microbiologie-78http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/metode-utilizate-in-microbiologie-78http://www.sfatulmedicului.ro/profile-analize/metode-utilizate-in-microbiologie-78


2/18

- martor pozitiv: Staphylococcus aureus ATCC 25923;- martor negativ: Escherichia coli ATCC 25922.

CulturaBacteriile apartinand unor specii diferite pot avea caractere microscopice asemanatoare, de aceeaidentificarea lor presupune si studiul caracterelor fiziologice care sunt cercetate "in vitro" pe

medii de cultura.Cultura bacteriana reprezinta rezultatul cresterii si multiplicarii bacteriilor intr-un mediu nutritivsi are ca scop:- izolarea microorganismelor patogene din prelevatele patologice;- identificarea agentilor patogeni;- testarea sensibilitatii la antibiotice in vederea initierii si monitorizarii terapiei antimicrobiene.

Clasificarea mediilor de cultura poate fi in functie de:1. Tolerabilitate:- medii uzuale, care permit cresterea unui numar mare de specii bacteriene;- medii speciale, care permit cresterea unei game restranse de specii, uneori chiar tintit pentru osingura specie.

2. Scopul utilizarii:- medii de imbogatire (intotdeauna lichide) pentru anumite grupe de bacterii;- medii de izolare: uzuale, nediferentiale, diferentiale, care diferentiaza printr-un singur caractergrupe taxonomice sau tulpini;- medii selective, care inhiba unele grupe bacteriene favorizand multiplicarea altora.3.Identificare:- medii test - conventionale sau microtest;- medii multitest - asociate sau combinate.Pentru fiecare categorie de prelevate patologice se utilizeaza uzual un mediu sau un set de mediicare permit izolarea bacteriilor cel mai frecvent implicate in infectiile zonei respective. Acest setde medii uzuale poate fi suplimentat cu alte medii in raport cu datele clinico-epidemiologice.Pentru izolarea germenilor patogeni din produse pluricontaminate, este obligatorie insamantarea

pe medii diferentiale.In cazul in care se apreciaza ca prelevatul contine un numar redus de germeni, se vor folosimedii lichide de imbogatire (bulion BHI pentru germeni aerobi, bulion thioglycolat cu resazurina

pentru anaerobi, bulion selenit pentru coprocultura etc).

Incubareamediilor insamantate se face tinand cont de exigentele bacteriilor suspectate:- bacteriile aerobe se cultiva in atmosfera obisnuita;- bacteriile carboxifile necesita incubarea in atmosfera de CO2, aceasta realizandu-se in exicatorcu ajutorul unei lumanari;- bacteriile strict anaerobe sunt cultivate cu ajutorul sistemelor Gaspak.Majoritatea bacteriilor de interes medical cresc adecvat la 37C, spre deosebire de fungi a carorcrestere este optima la 30C. Urmarirea placilor incubate se face 24 - 48 de ore pentru bacteriileobisnuite; 2-5 zile pentru fungi.

Examinarea culturilorAspectul culturii este dependent de specie si de compozitia mediului.In mediu lichid cresterea poate fi: uniforma, cu depozit, granule, pelicula, inel, degajare gaz,formare de pigment. Pe mediile solide bacteriile formeaza colonii, caracterul acestora (forma,marime, suprafata, opacitate, consistenta, miros) si cantitatea in care s-au dezvoltat(+,++,+++,++++) orientand microbiologul catre diagnostic.Un aspect important il reprezinta absenta cresterii bacteriene in cazul produselor de obicei

pluricontaminate (ex. exsudat nazofaringian, coprocultura, secretie vaginala). Acest lucrusugereaza faptul ca pacientul se afla sub tratament cu antibiotic sistemic sau local (ovule,antiseptice orofaringiene).


3/18

Semnificatia clinica a unor izolate poate fi stabilita inca din primocultura, in cazul izolatelor dinprelevate necontaminate (lichide de punctie) sau bacilii Gram-negativi izolati dincolo de unanumit prag in urocultura cantitativa.In cazul culturilor monobacteriene izolate din prelevate normal sterile (hemocultura, lichide de

punctie) se trece direct la identificare si antibiograma. Din culturile pluribacteriene sunt repicatecolonii, apoi sunt identificate pana la nivel de specie si este testata sensibilitatea la antibiotice.

Selectionarea acestora se face in functie de aspectul coloniei, natura prelevatului, diagnosticulclinic si rezultatele examenului microscopic colorat.

I denti fi carea serologicaReactiile antigen-anticorp (aglutinare pe lama si latexaglutinare) isi gasesc aplicatia inlaboratoarele Synevo in identificarea antigenica a unor izolate cu semnificatie clinica-princonfirmarea genului si speciei.Tulpinile de E.coli care produc diaree sunt clasificate pe baza mecanismelor patogene in: E.colienteropatogen (EPEC), E.coli enteroinvaziv (EIEC), E.coli enterotoxigen (ETEC), E.colienterohemoragic (EHEC), E.coli enteroagregativ (EAEC).Identificarea biochimica nu diferentiza tulpinile de E.coli patogene de cele nepatogene, de aceea

se recomanda testul de serotipare.Medicul clinician, pe baza semnelor clinice trebuie sa precizeze in biletul de trimitere serotipul

pentru care trebuie testata proba pacientului.EHEC- medicul curant recomanda coprocultura in primele cinci zile de boala. E.coli O157:H7este cel mai frecvent serotip asociat colitei hemoragice. Izolarea EHEC O157H7 se comunicaimediat medicului.

Examinarea culturilor:se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive si se identifica prin testebiochimice.Aglutinare:se testeaza cu ser anti O157 si anti H7.Gastroenteritele sau toxiinfectiile alimentare produse de bacteriile din genul Salmonellasedatoreaza ingerarii de alimente contaminate cu aceste bacterii.Cele mai frecvente salmonele izolate in Romania, in gastroenterite, sunt S.typhimurium,S.choleresuis, S.enteritidis, S.panama. Sansele de a izola agentul patogen in coprocultura sunt in

prima saptamana de boala.Examinare microscopica- la examenul intre lama si lamela cu albastru de metilen se observanumeroase PMN sau monocite care sunt asociate cu infectia produsa de S.typhi.Insamantarea pe medii de imbogatire (e.g. bulion selenit de sodiu) si pe medii selectivefavorizeaza cresterea salmonelelor si permite diferentierea de alte specii de enterobacterii.EPEC si EI EC

Examinarea culturilor: se repica 8 - 10 colonii lactozo-pozitive (nu se pot diferentia coloniile deE.coli patogene de cele nepatogene) si se identifica prin teste biochimice.

Aglutinare:cu seruri polivalente EPEC, EIEC.Identificarease realizeaza prin probe biochimice caracteristice urmata de aglutinare cu serurispecifice de grup si de tip.Se cunosc pana in prezent patru grupe de Shigella:S.dysenteriae, S.flexneri, S.boydii, S.sonnei.La noi in tara cele mai frecvente cazuri de dizenterie bacilara sunt produse de S.flexneri, intr-un

procent mai redus se izoleaza S.sonnei si numai incidental S.boydii; S.dysenterie nu s-a maiizolat din 1950.

Examinarea microscopica evidentiaza leucocite si hematii.

Identificarea:prin teste biochimice si aglutinare cu seruri specifice anti-Shigella.Streptococii beta-hemoliticicu importanta medicala sunt:- Str.pyogenes (grup A) care produce faringinte, infectii cutanate, genitale, sechele

poststreptococice;- Streptococcus agalactiae (grup B) care face parte din flora normala a tractului genital la femeie,tractului respirator superior, tractului digestiv inferior; la nou nascutul infectat de la mama


4/18

produce meningita, septicemie, la adult infectii cu diferite localizari, iar la femeia gravida avortsi septicemie post-partum;- Grupul C si G produc infectii asemanatoare cu Streptococul de grup A, dar mai putin frecvente.Apartenenta la un anume serogrup se poate face prin reactii de latexaglutinare.

Antibiograma

Laboratorul de microbiologie are un rol esential in tratamentul infectiilor prin identificareabacteriilor si testarea sensibilitatii la antibiotice.Scopul esential este de a ajuta decizia terapeutica.Antibiograma este utila in:- instituirea unui tratament tintit de catre medicul clinician;- evidentierea acelor tulpini ce poseda enzime capabile sa inactiveze actiunea antibioticului invivo;- supravegherea epidemiologica a rezistentei bacteriene;- compararea fenotipurilor de rezistenta a tulpinilor responsabile de infectii nosocomiale.

In laboratoarele Synevo, testarea sensibilitatii la antibiotice a tulpinilor cu implicatie clinica se

realizeaza prin metoda difuzimetrica KirbyBauer.Etapele efectuarii antibiogramei sunt standardizate: compozitia mediului, pH-ul mediului,densitatea inoculului, durata si temperatura de incubare, stabilitatea si concentratia substanteimicrobiene.Interpretarea rezultatului antibiogramei respecta standardul CLSI 2006 (NCCLS)Clinical andLaboratory Standards Institute.Laboratorul detine un cititor automat de antibiograme (efectuate prin metoda difuzimetrica), careare incorporat in soft un program expert ce respecta acest standard, cu capacitatea de a detectatulpinile secretoare de penicilinaza si beta lactamaza cu spectru extins, precum si alte fenotipuride rezistenta.Pe langa metoda clasica utilizata de toate laboratoarele, in laboratorul Synevo Bucuresti seefectueaza si antibiograma automata. Analizorul automat aflat in dotare are posibilitatea de aidentifica microorganismul si de a testa sensibilitatea lui la antibiotice in cateva ore (2 - 12 ore).Durata de timp este variabila in functie de familia din care face parte germenele studiat. Tipurilede microorganisme identificate sunt multiple si cuprind atat bacterii Gram pozitive, cat si bacteriiGram negative.Izolarea unui germene patogen in cultura pura (conditie esentiala pentru obtinerea unui rezultatcorect) permite identificarea si testarea simultana a sensibilitatii la antibiotice pe acest analizorautomat. Se efectueaza in prealabil un frotiu colorat Gram pentru verificarea puritatii tulpiniiizolate si pentru alegerea cardurilor (bacterii Gram pozitive sau Gram negative).Seturile de antibiotice continute de aceste carduri sunt special alese, ele cuprinzandatat antibiotice uzuale, cat si antibiotice de ultima generatie pentru a putea institui un tratamentoptim pentru fiecare caz.Interpretarea se efectueaza conform standardului CLSI 2006. Astfel, exista posibilitateadetectarii de enzime care inhiba actiunea antibioticului in vivo (ESBL, penicilinaza etc) siinterpretarea automata a rezultatului antibiogramei in functie de prezenta/absenta acestor enzime.Prin urmare, laboratorul Synevo poate efectua in urgenta identificari de germeni din diverse

produse patologice si testarea sensibilitatii acestora la antibiotice (dupa obtinerea culturii pure).Avantajele celor doua analizoare sunt acelea de comunicare corecta a sensibilitatiimicroorganismelor (in functie de CMIconcentratia minima inhibitoriesi fenotipuri derezistenta), precum si de transmitere automata a datelor catre sistemul informatic, eliminandastfel posibilitatea de aparitie a erorilor datorate introducerii manuale a rezultatelor in sistem.

Controlul calitatii antibiogramelor se realizeaza cu tulpini de referinta recomandate de CLSI2006:- Escherichia coli ATCC 25922;


5/18

- Staphylococcus aureus ATCC 25923;- Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853;- Enterococcus faecalis ATCC 29212;- Streptococcus pneumoniae ATCC 49619;- Haemophilus influenzae ATCC 49247.

http://www.creeaza.com/referate/biologie/LOCUL-IMPORTANTA-SI-PERSPECTIV861.php

LOCUL, IMPORTANTA SI PERSPECTIVELEDOMENIULUI CULTURII DE CELULE ANIMALE INCADRUL BIOTEHNOLOGIILOR MODERNE

LOCUL, IMPORTANTA SI PERSPECTIVELE DOMENIULUI CULTURI I

DE CELULE ANIMALE I N CADRUL BI OTEHNOLOGI I LOR MODERNE

Ross Granville Harrison (1907) este primul cercetator care a propus o tematica de studiuin acest domeniu, fiind considerat parintele si fondatorul unei noi stiinte, cea a cultur ii de celu leanimale. El este cel care a propus tehnica de cultura in picatura in suspensie (fig.1).

Fig. 1. Schema culturii de tesut animal in suspensie (Harrison, 1907)

Majoritatea cercetarilor au fost realizate pe explante din tesutul embrionar de broasca(animal cu sange rece, deci care nu necesita conditii de incubare). Scopul acestor demersuri l-areprezentat studiul celulelor in absenta variatiilor sistemice determinate de unitatea tisulara atatin conditii normale cat si in conditii de stres. Tehnica presupunea de fapt cultura unor tesuturinedisociate si avea ca rezultat migrarea unui numar redus de celule din cadrul fragmentului

tisular pe de o parte si aparitia unor noi mitoze ocazionale, pe de alta parte.

Timp de peste 50 de ani s-a vorbit despre culturi de tesuturisi nu despre culturi de celule,cu toate ca dezvoltarea domeniului a fost expansiva, iar utilizarea celulelor dispersate deveniseuzuala inca din deceniul al VI-lea. In timp, s-a ajuns la definirea unor termeni si implicit ladelimitarea unor subdomenii:

cultura de celu leeste notiunea care defineste mentinerea si/sau multiplicarea in vitroacelulelor dispersate care intra in contact direct cu mediul de cultura;

cultura de tesutur i se refera la mentinerea in vitroa structurilor tridimensionale a unuitesut nedezagregat; implica insa in contextul cursului si notiunea de culturi deorgane (organe integre sau fragmente reprezentative mentinute in cultura, pastrandu-se
http://www.creeaza.com/referate/biologie/LOCUL-IMPORTANTA-SI-PERSPECTIV861.phphttp://www.creeaza.com/referate/biologie/LOCUL-IMPORTANTA-SI-PERSPECTIV861.phphttp://www.creeaza.com/referate/biologie/LOCUL-IMPORTANTA-SI-PERSPECTIV861.php


6/18

astfel distributia numerica si spatiala a celulelor componente), culturahistotipica(reasocierea spontana a celulelor cultivate in structuri tridimensionale), culturaorganotipica(recombinarea in vitroa liniilor celulare specifice unui organ in vederearecrearii acestuia numeric si spatial sau a functiilor lui).

Burrows a adus imbunatatiri acestei tehnici prin introducerea culturilor in plasma

sangvina, mai eficienta pentru cultura in vitroa celulelor provenite de la animale cu sange cald.Dificultatea majora a constat insa in evitarea contaminarii (sau chiar a cros-contaminarii).

Scurt i storic al cultur il or de celu le animale

- un secol de fundamentari -

in 1885, Roux reuseste mentinerea in cultura (in mediu salin) a celulelor deviate dinembrion de pasare.

in 1897, Loeb demonstreaza capacitatea celulelor sangvine de a supravietui in ser sauplasma in vitro.

in 1907, se naste ca stiinta cultura de celule animale prin experientele lui Harrison, iarBurrows ii perfectioneaza tehnica.

in 1913, Carrel defineste si utilizeaza tehnici strict aseptice, reusind astfel saprelungeasca viata celulelor in culturi, iar in 1923apar si primele flacoane destinatespecial culturilor celulare care ii poarta numele.

in anii `40, descoperirea si apoi utilizarea penicilinei si streptomicinei conduce la

cresterea eficientei culturilor de celule animale prin reducerea contaminarii.

in 1948, Earle izoleaza fibroblaste L de soarece care in cultura au format clone clarepornind de la o singura celula.

in 1949, Enders cultiva si studiaza in vitro virusul polio-uman pe culturi de celuleembrionare umane.

in 1952, Gey izoleaza prima linie celulara continua dintr-o tumora (carcinom) cervicalacunoscuta azi sub numele de HeLa (de la pacienta Henrietta Lach).

in 1955, Eagle promoveaza primul mediu definit chimic in functie de necesarul denutrienti pentru culturile de celule.

in 1965, Ham introduce pentru prima data un mediu de cultura fara ser, capabil sasustina cresterea unor tipuri de celule in vitro.

in 1970, Sato stabileste bazele obtinerii unor medii lipsite de ser din cocktailuri dehormoni si factori de crestere.

in 1975, Kohler si Milstein produc pentru prima data hibridoma (celule hibride dinculturi celulare B), capabila de a secreta anticorpi monoclonali(produs al clonelorcelulare B).


7/18

in 1982, se produce pe cale biotehnologica insulina umana.

in 1985, hormonul uman al cresterii (STH) produs de bacterii recombinate este acceptatin scop terapeutic.

Studi il e fundamentale reali zabile prin uti l izarea cul tur il or celulare la difer ite nivele de

organizare

1. Activitatea intracelulara

Sinteza proteinelor

Transcriptia si replicarea ADN-ului

Metabolismul energetic

Maturarea gametilor

Diviziunea celulara

2. Fluxul intracelular

Migrarea ARNm in citoplasma

Translocatia si functionarea complexelor de receptori hormonali

Fluctuatia continutului in metaboliti

3. Ecologie

Nutritia si excretia celulara

Mecanismul infectiilor

Transformari induse viral sau chimic

Actiunea substantelor medicamentoase

Raspunsul la stimuli externi

Secretia de produsi specializati

4. Interactiunea intercelulara

Inducerea embriogenezei

Cinetica populatiei celulare

Aderenta intercelulara

Domenii si discipl ine ce beneficiaza de dezvoltarea sti in tei cultu r il or de celu le animale


8/18

1. Oncologiaprin studiul dezvoltarii tumorilor maligne in linii celulare maligne stabile (ex. HeLa); prin studiulefectelor agentilor fizici, chimici, etc., asupra tumorilor.

2. Microbiologiaprin posibilitatea obtinerii anticorpilor monoclonali; cultivarea virusurilor.3. Genetica moleculara si inginer ia geneticaprin posibilitatea analizei genetice a celulelor somatice animale

si umane; prin aplicarea manipularilor genetice in vederea obtinerii unor produse (insulina, hormoni decrestere, etc.).

4. Imunologia prin studiul in linii celulare a componentelor tesutului hematopoetic; prin studiul mecanismuluide actiune al anticorpilor.

5. Medicina prin studiul arterosclerozei prin culturi de celule endoteliale din capilare; prin analiza celulelorobtinute prin amniocenteza in vederea evidentierii problemelor genetice sau virale la fetusi; terapia celulara.

http://www.scrigroup.com/educatie/botanica/FENOMENE-LEGATE-DE-CRESTEREA-P71598.php

FENOMENE LEGATE DE CRESTEREA PLANTELOR

Regenerarea

Regenerarea este procesul fiziologic prin care organismul se reface din parti izolate (tulpini cu muguri,radacini, frunze, calus, celule individualizate). Se formeaza tesuturi si organe noi, cu functii bine definite.

Regenerarea sta la baza inmultirii vegetative prin frunze, stoloni, marcote, butasi de tulpini, butasi de frunze. Altoirileau la baza tot un proces de regenerare a calusului dintre altoi si portaltoi.

Cultura de tesuturi sau cu suspensii de celule este o forma noua de inmultire vegetativa pe baza regenerarii, pornindde la meristeme, maduva tulpinii, floem, calus sau chiar dintr-o singura celula somatica.

Microinmultirea plantelor prin tehnica culturii de tesuturi'in vitro'

Principiul metodei. Tehnica culturii de tesuturi 'in vitro' face parte din biotehnologiile moderne ce prezinta largi

aplicatii in agricultura, industria alimentara, farmaceutica, chimica si energetica, medicina si combaterea poluariimediului. Principalele directii aplicative in agricultura sunt: inmultirea plantelor prin tehnici 'in vitro', obtinereamaterialului de plantat liber de agenti patogeni, obtinerea de indivizi haploizi prin antogeneza si ginogeneza, creareade noi genotipuri de plante, selectarea si cultivarea unor linii cu randament sporit de produsi secundari, conservareafondului genetic in banci de gene etc.

Prin culturi de tesuturi vegetale 'in vitro' se intelege cultivarea pe medii nutritive artificiale, aseptice, a oricarei particomponente a unei plante, numite explant, sub forma de celule, tesuturi sau organe. Aceasta tehnologie se bazeazape faptul ca celula vegetala se supune principiului totipotentei si anume ca nucleul sau contine totalitatea informatieigenetice necesare dezvoltarii unui organism complet. Inmultirea plantelor 'in vitro' este o forma de inmultirevegetativa care asigura obtinerea unui randament sporit in comparatie cu alte procedee folosite, in special, inhorticultura.

Materiale necesare:etuva, autoclav pentru sterilizarea mediilor si a instrumentarului, pH-metru, agitator mecanic,microscop stereoscopic, frigider, distilator de apa, sticlarie si instrumentar de laborator, boxe cu flux laminar steril saunisa sterila cu instalatie de radiatii ultraviolete, tuburi fluorescente, termostat, umidometru, instalatii de aerconditionat.

Modul de lucru.

a). Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi.

Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi necesita folosirea urmatoarelor incaperi:

- incaperile pentru mediile de cultura;

- incapere pentru spalarea si sterilizarea sticlariei, instrumentarului si a materialului vegetal;

- incapere aseptica, in care se izoleaza explantele si se fac inoculari;
http://www.scrigroup.com/educatie/botanica/FENOMENE-LEGATE-DE-CRESTEREA-P71598.phphttp://www.scrigroup.com/educatie/botanica/FENOMENE-LEGATE-DE-CRESTEREA-P71598.phphttp://www.scrigroup.com/educatie/botanica/FENOMENE-LEGATE-DE-CRESTEREA-P71598.php


9/18

- camera de crestere, in care au loc incubarea, cresterea si intretinerea culturilor;

- sera, in care se face aclimatizarea plantelor obtinute 'in vitro' in mediul septic.

b). Prepararea mediilor de cultura.

Mediile de cultura trebuie sa contina saruri minerale (macro si microelemente) compusi organici cu azot si carbon si

substante de crestere (hormoni si vitamine). Unul dintre cele mai utilizate medii de cultura este mediul Murashige-Skoog (1962).

Prepararea mediului Muraschige-Skoog se face dupa urmatoarea schema:

A Solutii de MACROELEMENTE si MICROELEMENTEMicroelemente Macroelemente

IngredienteSolutia STOC

de 10 x conc.

(g/l)Ingrediente

Solutia STOC

de 10 x conc.

(g/l)NH4NO3 16,5 H3BO3 6,200KNO3 19,0 MnSO4x 4H2O 22,300CaCl2x 2H2O 150,0 ZnSO4x 7H2O 8,600MgSO4x 7H2O 3,7 Na2MoO4x

2H2O0,250

KH2PO4 1,7 CuSO4x 5H2O 0,025CoCl2x 6H2O 0,025KI 0,750

B. Solutii de FeEDTA si AMINOACIZIFeEDTA Aminoacizi

IngredienteSolutie STOC

(g/l)

IngredienteSolutie STOC

(mg/l)FeSO4 x 7H2O 5,57 Glicina 2

Na2EDTA 7,45C. Solutii de VITAMINE si FITOHORMONI

Vitamine Fitohormoni

IngredienteSolutia STOC

de 10 x conc.

(g/l)Ingrediente

Solutie STOC

(g/l)

Acid nicotinic 0,5 AIA 0,500Piridoxina HCl 0,5 Chinetina 0,215

Tiamina HCl 0,5Mezo-inozitol 100,0D. Zaharoza 30 g/lE. Difco Bacto-agar 10 g/l

Prepararea solutiei finale Muraschige-Skoog (ingredientele necesare prepararii unui litru de mediu) este urmatoarea:

NH4NO3 1,650 mg

KNO3 1,900 mg

MgSO4x 7 H2O 370 mg

KH2PO4 170 mg


10/18


11/18


12/18

Polaritatea este insusirea plantelor de a forma la capetele opuse, organe diferite ca structura anatomo-morfologica.La polul inferior se vor forma radacini (pol rizogen), iar la polul superior apar muguri cu frunze (pol caulinar). Aceastapolaritate in repartitia organelor este o expresie a diferentierii functiilor si a specializarii organelor cu anumite functii.

Polaritatea ramurilor de Salix.

Materiale necesare:ramuri de salcie, camera umeda.

Modul de lucru. Doua ramuri de salcie, lungi de 20-30 cm si cudiametrul de 10-12 mm, care poarta muguri sanatosi pe toatalungimea, se suspenda in atmosfera saturata cu vapori de apadintr-o camera umeda. Unul din butasi se aseaza in pozitia normala(cu polul bazal in jos), iar celalalt butas se aseaza in pozitie inversa(cu polul bazal in sus).

Dupa pastrare timp de 3-4 saptamani, la intuneric in camera umedasi la regim termic optim, se constata ca mugurii adormiti de la polulbazal (rizogen) formeaza radacini, iar mugurii adventivi de la polulapical (caulinar) formeaza lastari cu frunze (fig. 1289.

Interpretare. Indiferent de pozitia butasilor (normala sau inversa),

nu se schimba functiile fiziologice ale celor doi poli ai butasilor, dincare se vor forma noile organe ale plantei, in functie despecializarea acestora, imprimata genetic in insusirea de polaritate.

Corelatia si dominanta apicala.

Intre organele si tesuturile plantelor exista interactiuni fiziologicecare conduc la cresterea armonioasa a tuturor partilor plantei,mentinand o rezerva de muguri pentru ciclurile urmatoare devegetatie. Pornirea in crestere a acestor muguri dorminzi estedeclansata prin taierea mugurelui terminal, a varfului tulpinii sau alastarului principal care exercita rolul de dominanta apicala.

Eliminarea dominantei apicale la plante.

Materiale necesare:ghivece cu plante de fasole, lama de ras.

Modul de lucru.O parte din plantulele de fasole dintr-un ghiveci se lasaintacte (control), iar la o alta parte din plante se indeparteaza varful decrestere (mugurele terminal). Dupa 1-2 saptamani se constata la plantelede control, o continuare a cresterii in lungime a tulpinii, iar cotiledoanelese zbarcesc pana se usuca. La plantele cu mugurele terminal taiatcresterea in lungime inceteaza ,iar din mugurii dorminzi de la bazacotiledoanelor iau nastere doi lastari noi, care tind sa ia pozitieverticala (fig. 130).

Interpretare.La planta control, mugurele terminal exercita o actiune deinhibare a mugurilor axilari, numita dominanta apicala. In cazulindepartarii varfului de crestere, dispare dominanta apicala iar muguriiaxilari pot porni in vegetatie, preluand rolul de crestere in lungime alastarului sau a plantei.

Rolul inhibitor exercitat de mugurele terminal se datoreste cantitatii foartemari de auxina naturala care provine din varf si circula descendent,mentinand in stare de repaus mugurii axilari. Pe acest fenomen sebazeaza tehnica taierii arborilor si arbustilor.

Durata experientei:observarea timp de 10 minute la interval de 1-2saptamani.


13/18

http://www.tgw1916.net/notedecurs/microbiologie/medii.html

Medii de cultivare a bacteriilorMediul de cultura reprezinta orice amestec de substante lichide sau solide . de la cele maisimple pana lacele mai complexe care permit dezvoltarea si studierea unui microb in afara nisei ecologicenaturale.Un mediu trebuie sa indeplineasca anumite conditii :

Sa contina substante nutritive necesare metabolismului bacreian, sa aiba pH cuprins intreanumite limite incare sa se poata dezvolta bacteria, sa corespunda particularitatilor fiziologice ale bacteriei si safie sterilMediile uzuale constituie suportul, la care se adauga diferite componente ca sange, ser, lichidde ascita etc.

Clasificarea mediilor de cultura1.Consistentalichide, solide, semisolide2.Din punct de vedere al tipului respirator al bacteriilor cultivate: medii pentru aerobi si anaerobi.(mediile

pentru anaerobi pot fi la fel ca cele pentru aerobi la care se adauga substante reducatoare

tioglicolat desodiu, fragmente de organ, acid ascorbic)3.Din punct de vedere al provenientei- medii naturale ce se obtin prin extractie apoasa sau prin hidroliza din elementeanimale sauvegetale.- medii sintetice ce contin numai compusi cu structura chimica cunoscuta si pot fi simple(solidegeloza), lichide (bulion, apa peptonata) sau complexe geloza sange, geloza ser, sau lichidebulion ser,bulion sange).

4.Dupa scopul utilizariiMedii uzuale simple folosite in mod curent in laboratorul de bacteriologie pentru cultivare

unui numarmare de bacterii bulion apa peptonata, geloza, gelatina.

Medii speciale folosite in scopuri bine precizatemedii complexe care permit crestereapreferentiala aanumitor bacterii din amestec heterogen. Ele se impart in medii de izolare si medii deidentificare.Medii de izolare sunt elective, selective, de imbogatire si de conservare.Medii elective favorizeaza dezvoltarea unei specii bacteriene cautate, dar nu contin inhibitoride crestereprin compozitia lor satisfac necesitatile minime ale unei specii bacteriene date.

Medii selective

inhiba dezvoltarea bacteriilor asociate cu microorg ce se urmareste a fi izolat.Include unulsau mi multi inhibitori (antibiotice, saruri biliare) ce restrang multiplicarea anumitor specii. Expmediu cucristal volet 1;500000 inhiba bacteriile Gram pozitive.Medii de imbogatire asigura dezvoltarea unei specii bacteriene din materialele patologige incare numarulgermenilor este foarte mic. Mediul cu ou Lowenstein dezvoltarea Mycobacteriilor.Medii de conservare medii sarace in subst nutritive si sunt pentru pastrarea in viata a culturilorbacteriene.Medii de identificare contin subst ce permit punerea in evidenta a unor caractere bichimice.

Conditii pe care trebuie sa-l indeplineasca un mediu de cultura:1.Sa ofere grad de umiditate necesar dezvoltarii bacteriilor.2.Sa ofere subst nutritive calit si cantit
http://www.tgw1916.net/notedecurs/microbiologie/medii.htmlhttp://www.tgw1916.net/notedecurs/microbiologie/medii.htmlhttp://www.tgw1916.net/notedecurs/microbiologie/medii.html


14/18

3.Sa asigure sursa de azot necesara biosintezei proteinelor si acizilor nucleici4. Sa contina apa si saruri minerale necesare mentinerii echilibrului ionic5.Sa aiba vitamine pentru sinteza metabolitilor esentiali6.Sa asigure posib de aerare pt aerobe si invers.7.Sa fie steril si protejat de lumina8.Sa fie limpede si clar pentru studiul caracterelor culturale.

EtapeTopirea sau prepararea mediuluiCorectarea pH-uluiRepartizarea in recipiente sterileControlul sterilitatii lor. (vezi video: Blood agar preparation)


15/18

INTRODUCERE N CULTURILE DE CELULE I ESUTURI VEGETALE

1. Introducerea

Sfritul mileniului doi se caracterizeaz printr-o puternic implicare a biotehnologiei n viaaomului, n toate domeniile de activitate. Cu ajutorul metodelor biotehnologice s-au fcut

progrese uriae n crearea de noi genotipuri de plantei rase de animale cu nsuiri favorabile icu randamente sporite fa de materialul de la care s-a plecat. Ajungerea la cultura in vitro nu afost aa de simplcum s-a presupus fiind necesar mult timp i multe cercetri, la nceput frsucces, dar apoi totul s-a clarificat.

2. Scurt istroric

1882 - Sachs a fost cel care a elaborat teoria conform creia plantele i sintetizeazsubstanelece determin formarea organelor, substane ce au o dispunere polar;

1922 - ncep s apar primele rezultate privind cultura de celule i esuturi, cnd Knudsonreuete germinarea seminelor de orhidee in vitro iar Robbins obineprima cultur de esut derdcin n condiii artificial;

1952 - Pe baza conceptului de totipoten celular, conform cruia fiecare celul conineinformaia genetic necesar obinerii prin regenerare a unui organism vegetal complet, Morel iMartin au stabilit i au perfecionat o metodologie de cultivare pe medii aseptice a explantelormeristematice caulinare, obinnd prin creterea in vitro a acestora plante sntoase, libere deviroze, pornind de la plante mam contaminate cu diferite viroze;

1962- dup muli ani de studii i ncercri, Murashige i Skoog, au reuit s elaboreze un mediu

de cultur considerat ca fiind de baz , care cu mici modificri poate fi utilizat pentru aproapetoate tipurile de culturi de esuturi;

1966 - este considerat drept nceputul etapei moderne a cercetrilor privind cultura de explantevegetale in vitro. Aceast etap s-a caracterizat, n primul rnd prin elaborarea de tehnicieficiente n generarea, cultivarea i fuzionarea protoplatilor vegetali. Cu ajutorul protoplatilor,odatcu descoperirea noilor tehnici s-au obinut plante rezistente la aciunea unor ageni stresanicum ar fi: pesticide, linii celulare rezistente la stres hidric, termic etc.

Att pe continentul american ct i pe cel european sau asiatic, culturile in vitro sunt folosite n

special pentru multiplicarea speciilor floricole ornamentale, urmat de multiplicarea speciilorarboricole ornamentale i fructifere, dar i pentru realizarea de noi genotipuri sau mai ales pentruregenerarea celor create prin inginerie genetic.

3. Definiie

n sens general, prin cultura in vitro se nelege creterea pe medii artificiale, n condiii deasepsie deplin i de factori ambientali bine controlai, a unor organe, pri de organe, esuturisau celule vegetale. Reuita culturii depinde de o multitudine de factori i este vizibil nmomentul n care explantul crete.

Explantul, numit i inocul, este poriunea de plant (organ, esut, celul) care se desprinde de peplanta donor (planta mam), i se inoculeaz n condiii sterile pe un mediu artificial de cultur.


16/18

Evoluia explantului este dirijat de operator n funcie de scopul urmrit. Acesta poate evoluaformnd o nou plant (sau mai multe plante - neoplantule), prin stimularea dezvoltrii organeloraeriene (tulpina i frunzele) i a rdcinii, sau poate forma calus, prin stimularea nmuliriinedifereniate a celulelor.

Explantul constituie unitatea vie ce conine n celulentreaga informaie genetic a plantei mam

i pe baza totipotenei este capabil de a regenera una sau mai multe plante identice cu plantadonor.

Totipotena, este nsuirea celulelor vegetale de a se divide, de a se reproduce i de a forma oplant identic cu planta mam.

4. Mediile de cultur i prepararea lor

Mediul de cultur reprezint suportul fizic i chimic necesar pentru creterea i dezvoltareaexplantelor in vitro. Graie unor cercetri minuioase efectuate de-a lungul timpului un mare

numr de cercettori au formulat diferite reete de medii folosite pentru diferite tipuri de culturiin vitro la marea majoritate a speciilor vegetale.

Condiiile pe care trebuie s le ndeplineasc un mediu de cultur sunt:

- s corespund cerinelor nutritive i hormonale ale speciei cultivate pentru faza n care segsete (stabilizare, proliferare, calogenez, nrdcinare, etc.);

- s asigure condiii optime de cretere i dezvoltare n ceea ce privete presiuneaosmotic, pH-ul, umiditatea, etc.

- s fie echilibrat din punct de vedere ionic;

- s nu conin ioni sau substane toxice;- s fie uor de preparat i reproductibil;- s fie stabil dup autoclavare (s-i menin neschimbat compoziia i caracteristicile

fizico-chimice;- s fie ieftin i s conin ct mai puini constitueni naturali costisitori i neomogeni;- eventual, s poat fi reciclat.

Mediile folosite la cultura in vitro a explantelor vegetale au n general o structur complex,fiind alctuite dintr-un mare numr de constitueni de natur divers i cu rol diferit. Aceticonstitueni pot s fie grupai n:

constitueni cu rol nutritiv: elemente minerale: macro i microelemente i elementeorganice: zaharuri (ca surs de carbon), aminoacizi (ca surs de azot organic) i vitamine;

constituenicu rol hormonal fitoregulator al creterii i dezvoltrii explantelor in vitro:auxine, citochinine, gibereline i alte substane cu rol stimulator sau inhibitor: acidabscisic, etilen, colchicin, paclobutrazol, etc.

constitueni cu rol n stabilizarea mediului de cultur: apa, ageni de solidificare,stabilizatori osmotici i de pH, antioxidani i substane absorbante.

5. Caracteristicile culturilor in vitro

Spre deosebire de multiplicarea tradiional, unde se opereaz cu semine sau poriuni mari deplant (marcote, butai, altoi), la multiplicarea in vitro se folosesc explante mici, de ordinulmilimetrilor sau chiar microscopice (celule, protoplati), explante care n condiii normale de


17/18


18/18

Cu toate aceste avantaje, exist specii care nu rspund bine la cultura in vitro i care,deocamdat rmn s fie nmulite tradiional.

Exist ns i cteva impedimente n utilizarea acestei metode pentru nmulirea n

mas a plantelor, cum ar fi(Dezavantaje):

o necesitatea unui laborator cu dotrile minime: instalaii i aparate indispensabileactivitilor de micropropagare, care sunt costisitoare;

o necesitatea unui personal specializat n multiplicarea clonal i manipularea in vitro;o utilizarea fitohormonilor, care sunt scumpi i puin accesibili tuturor unitilor de

producie;o nu se poate controla caracterul recalcitrant al unor specii sau soiuri, care nu rspund la

metodele cunoscute de multiplicare;o exist riscul apariiei i multiplicrii mutaiilor recesive, cu afectarea autenticitii

soiurilor;o riscul apariiei germenilor genetici prin multiplicarea solitar numai a unor tipuri carese

comport bine la acest tip de cultur, cu riscul srcirii bazei de germoplasm pentruunele specii.

Informatii-culturi in Vitro

Documents

Transcript of Informatii-culturi in Vitro