Teme culturi de celule

23
Tema I. ASPECTE PRACTICE GENERALE PRIVIND REALIZAREA CULTURILOR DE CELULE ŞI ŢESUTURI ANIMALE Cultura de celule este o metoda de biologie celulara pe larg utilizată pentru cercetarile biomedicale fundamentale (biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetică) şi aplicative (biotehnologie, inginerie tisulară, inginerie genetică etc). LABORATORUL DE CULTURI CELULARE Laboratorul de culturi celulare se compune din mai multe spatii de lucru si anexe, legate intre ele intr-un circuit functional, care sa asigure pe de o parte protectia personalului, iar pe de alta parte conditiile sterile de lucru, de care depinde reusita procedurilor de lucru. Camera pentru preparare a mediilor si sterilizare, vestiarul, camera-filtru si boxele sterile sunt principalele incaperi, care alcatuiesc circuitul unui laborator de culturi celulare. In afara de acestea, un spatiu separat este prevazut pentru stocarea probelor biologice la rece, sau camera de criostocare. In camera de preparare a mediilor si sterilizare sunt amplasate aparatle necesare pentru obtinerea unui mediu de cultura (aparatul pentru obtinerea de apa distilata sau ultrapura, balanta analitica, plita magnetica, pH-metru, etuva, autoclav, frigider etc) Vestiarul este dotat cu dulapuri si spatii de depozitare a hainelor de exterior si materiale pentru igiena personala (chiuveta cu apa curenta, sapun, prosoape de hartie). In camera-filtru se gasesc echipamentele vestimentare pentru operatorii culturilor de celule (halate, manusi, capeline, masti, papuci de laborator), dezinfectante pentru 1

description

Culturi de celule

Transcript of Teme culturi de celule

Page 1: Teme culturi de celule

Tema I. ASPECTE PRACTICE GENERALE PRIVIND REALIZAREA CULTURILOR DE CELULE ŞI ŢESUTURI ANIMALE

Cultura de celule este o metoda de biologie celulara pe larg utilizată pentru cercetarile biomedicale fundamentale (biochimie, biologie celulară şi moleculară, genetică) şi aplicative (biotehnologie, inginerie tisulară, inginerie genetică etc).

LABORATORUL DE CULTURI CELULARE

Laboratorul de culturi celulare se compune din mai multe spatii de lucru si anexe, legate intre ele intr-un circuit functional, care sa asigure pe de o parte protectia personalului, iar pe de alta parte conditiile sterile de lucru, de care depinde reusita procedurilor de lucru. Camera pentru preparare a mediilor si sterilizare, vestiarul, camera-filtru si boxele sterile sunt principalele incaperi, care alcatuiesc circuitul unui laborator de culturi celulare. In afara de acestea, un spatiu separat este prevazut pentru stocarea probelor biologice la rece, sau camera de criostocare.

In camera de preparare a mediilor si sterilizare sunt amplasate aparatle necesare pentru obtinerea unui mediu de cultura (aparatul pentru obtinerea de apa distilata sau ultrapura, balanta analitica, plita magnetica, pH-metru, etuva, autoclav, frigider etc)

Vestiarul este dotat cu dulapuri si spatii de depozitare a hainelor de exterior si materiale pentru igiena personala (chiuveta cu apa curenta, sapun, prosoape de hartie).

In camera-filtru se gasesc echipamentele vestimentare pentru operatorii culturilor de celule (halate, manusi, capeline, masti, papuci de laborator), dezinfectante pentru maini si alte materiale de lucru, care necesita depozitarea intr-un spatiu curat, cu decontaminare periodica.

Camera sterilă este dotată cu sisteme eficiente de sterilizare (aparat pentru filtraea sterila a aerului, lampa cu radiaţie UV, echipamente sterile pentru personal). In camera sterila se lucreaza cu materialul biologic (celule si tesuturi), utilizand aparatura specifica pentru obtinerea suspensiilor celulare, pentru incubarea celulelor si monitorizarea acestora. Astfel, in camera sterila (boxa sterila de lucru) sunt amplasate urmatoarele aparate:

Hota cu flux de aer laminar vertical - o incinta de lucru cu deschidere frontală. Are montate in plafon filtre HEPA cu o dimensiune a porilor de 0,22 µm, care nu permit trecerea microorganismelor. Astfel, filtrele HEPA au rolul de a steriliza aerul care intra in contact cu celulele, lichidele si celelalte materialele sterile in lucru.

1

Page 2: Teme culturi de celule

Incubatorul in care celuele sunt menţinute la o temperatură de 37 OC, o concentratie a bioxidului de carbon (CO2) din aer de 5-6 % si 96-97% umiditate. Atmosfera hipoxica (imbogatita cu CO2) este un factor stimulator al cresterii celulare pe de o parte si un factor de mentinere a echilibrului acido-bazic in mediile de cultura formulate pe baza de NaHCO3, pe de alta parte. Umiditatea este importanta pentru evitarea cresterii osmolaritatii mediilor de cultura prin evaporarea apei din acestea.

Microscopul optic inversat in contrast de faza, cu ajutorul caruia sunt analizate celulele din cultura.

Centrifugă de laborator cu sistem de racire, necesara pentru procesul de izolare si spalarea a celulelor.

In camera de criostocare sunt pastrate, la diferite intervale valorice ale temperaturilor <0oC, celule, fragmente de tesuturi si o serie de suplimente pentru prepararea mediilor de cultura: serului fetal de viţel, L-glutamatul, factori de crestere si altele.

- Inghetarea la –200C - conservarea serului fetal si a factorilor de crestere, a reactivilor si solutiilor care au indicata de producator, pastrarea prin inghetarea la aceasta temperatura

- Inghetarea la –80 oC - criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada scurta de timp (1-2 luni)

- Inghetarea la -1960C – in azot lichid (NH2) – criostocarea celulelor si fragmentelor de tesut pentru o perioada indelungata de timp – ani

Containere de stocare a celulelor in azot lichid

2

Page 3: Teme culturi de celule

MATERIALE DE LUCRU

Materialel specifice tehnicii culturilor de celulare sunt:- recipientele pentru creşterea celulelor (cutii Petri, flacoane tip Corrner cu suprafata

de crestere diferita, plăci multicelulare simple şi supraetajate) - tuburi pentru criostocare, - tuburi pentru centrifugare, - pipete gradate si pipete automate cu varfuri detasabile,- sisteme de filtrare a solutiilor cu pori de 0,22 µm,- camere de numarat celule,- alte materiale, comune laboratoarelor cu specific de biochimie si biologie moleculara Este bine sa fie folosite recipiente de cultura de unica folosinta, presterilizate (din

policarbonat, polistiren sau polipropilen) in locul sticlăriei clasice, care necesita spalare si sterilizare.

Plasi de cultura simple Tuburi de centrifuga

Placi de cultura multi-well (multicelulare), sau cu godeuri

Pipete serologice si dispozitiv de umplere a acestora

3

Page 4: Teme culturi de celule

Flacoane de cultura Camera de numarat celule (hemocitometru)

Filtre cu pori de 0,2 µm, atasabile la seringa

Pipete automate si varfuri pentru pipete automate

MEDII DE CULTURĂ

Mediile de cultură folosite intr-un laborator de culturi celulare sunt de mai multe tipuri si sunt alese in functie de protocolul. In functie de tipul celulelor multiplicate si a obiectivelor urmarite se pot utiliza:

- medii de spalare a celulelor (solutii saline tamponate)- medii de cultura pe baza de ser fetal bovin (SFB)- medii de cultura sintetice, cu suplimente nutritive formulate in functie de tipul

celulelor din cultura (medii fara SFB) Mediile de cultura sunt solutii saline fiziologice tamponate, imbogatite cu suplimente organice cu rol nutritiv, energetic, de reglare a metabolismului celular si a diviziunii celulare. (aminoacizi, vitamine, glucoza si altele). Mediile de cultura pot fi suplimentate cu amestec de antibiotic in raport de 1% (penicilina, streptomicina si neomicina) si cu indicatorul de pH de tipul rosu-fenol.

PROCEDEE DE STERILIZARE

4

Page 5: Teme culturi de celule

Toate materialele si lichidele care intra in contact cu celulele in cultura trebuie sa fie sterile. Alegerea metodei de sterilizare a acestora este dictata de stabilitatea lor la temperaturi inalte. Sterilizarea cu aer uscat si fierbinte, sterilizarea in abur fierbinte, iradierea, sterilizarea chimica si filtrarea sunt cele 5 posibilitati aplicate in functie de materiialul sterilizat, conform tabelului de mai jos.

METODA CONDITII MATERIALE LIMITARIAer fierbinte

160oC, 1 ora Metal, sticla, PTFE (teflon) Pot avea loc schimbari de culoare a materialelor sterilizate

Abur fierbinte

121oC, 15-20 min

Lichide stabile: apa, solutiile saline, mediile autoclavabile, materiale plastice cu o stabilitate relativa la temperaturi inalte: siliconii, policarbonatul (PC), nylonul, polipropilena (PP)

Ambalaje permiabile la abur;Un timp mai mare de incalzire din cauza unui volum mare de apa necesar pentru sursa de abur

Iradiere:Radiatii γ 25KGy Materiale plastice de tipul

polistirenului (PS), suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire

Alterari chimice si degradari macromoleculare

Plasma (fascicol de electroni)

25KGy Materiale plastice de tipul PS, suporturi organice, reactivi si substante sensibile la incalzire

Necesita o sursa de generare a electronilor, fiind mai putin accesibila pentru laboratoarele mici

Microunde 5 min, intensitate superioara

Apa, gelurile de tipul agarului Este posibil pentru volume mici

Radiatiile UV din spectrul lungimilor scurte

254 nm, 50-100 W, 30 min

Solutii contaminate, material plastic, aerul din incinta, suprafete de lucru cu suprafata extinsa.

Nu este accesibil pentru zonele umbrite;Rezistenta pentru spori

Sterilizare chimicaEtilen oxid 1h Materiale plastice

terminstabileDin cauza compusilor toxici reziduali, necesita o ventilare de cateva zile

70% solutie apoasa de alcool etilic

1 ora de imersie

Instrumentar metalic Nu distruge sporii;

5

Page 6: Teme culturi de celule

Exista un risc crescut de imflamare daca se asociaza cu flambarea la flacara

FiltrareFiltre atasabile la seringa sau unitati de filtrare pentru volum mare de lichid

Pori de 0,1-0,2 µm

Toate solutiile apoase, in special cele termosensibile, ce contin proteine

Nu poate fi folosit pentru solutiile vascoase sau DMSO (di-metilsulfoxid)

NORME DE SECURITATE SI PROTECTIA MUNCII IN LABORATORUL DE CULTURI CELULARE:

1) In laborator nu se intra in hainele si incaltamintea de strada.2) Nu se consuma alimente sau lichide 3) Inainte de a intra si la parasirea spatiilor laboratorului de culturi celulare mainile se spala cu

sapun lichid cu proprietati dezinfectante 4) Se evita expunerea la radiatiile UV. Lampile UV sunt pornite dupa terminarea lucrarilor si

sunt oprite cu cel putin 20-30 min inainte de a intra in laborator5) Pentru colectarea materialelor cu potential risc biologic se utilizeaza sacii si galetile din

material plastic de culoare galbena, cu in scriptia BIOHAZARD – risc biologic

Tema 2. SUBCULTIVAREA ELEMENTARĂ A UNOR CULTURI CELULARE SERIALE ŞI CONTROLUL DE CREŞTERE A CULTURILOR

6

Page 7: Teme culturi de celule

Material, soluţii şi medii de cultură:

1.Pipete serologice de 5ml si 10 ml; pipete automate si varfuri pentru pipete automate; flacone de centrifuga, de 15 ml; flacoane de cultura (toate sterile)

2. Solutie tripsina/EDTA 0,25%/0,02% 3.PBS steril4.Mediu de cultură MEM complet5.Soluţie albastru de tripan 0,3%

Tehnica de lucru:

După obţinerea unei mase celulare confluente pe fundul flaconului de cultura de 75 cm2, vasul de cultură este scos din incubator si pus in hota cu flux laminar.

1.Se decantează mediul de cultură supernatant cu ajutorul unei pipete Pasteur, ataşată liniei de aspiraţie prin vacuum sau cu o pipeta serologica.

2.Se spală de două ori suprafaţa care conţine cultura cu PBS adusă la +370C. Se clăteşte uşor vasul pentru a antrena lichidul de spălare in coltul inferior al flaconului, de unde lichidul este inlaturat prin aspirare.

3.Peste cultura se adaugă 3 ml de amestec tripsină 0,25% şi EDTA 0,02% adusa la temperatura de +370C. Se fac câteva mişcări de antrenare a soluţiei pe suprafaţa care conţine cultura, apoi se decantează 2 ml, lasand 1 ml din solutia tripsina/EDTA, peste monostratul celular.

4.Se lasă vasul în repaus între 30 sec şi 2 min, la incubator, până când la o mişcare uşoară a vasului se observă “pânza” de celule desprinse de pe suprafaţa de cultură.

5.Cu o pipetă gradată se ia o cantitate de 5 ml mediu de creştere complet şi se adauga peste suspensia celulară desprinsă (pentru neutralizarea actiunii tripsinei). Se fac câteva aspiraţii cu o pipetă serologica, pentru omogenizarea suspensiei.

6.Se face o numaratoare a celulelor din suspensie si se determina viabilitatea acestora, conform protocolului cu albastru tripan descris mai jos (controlul de crestere a culturii celulare).

7.Se repartizează conţinutul vasului de cultură în mai multe vase de cultură, în care s-a adăugat în prealabil mediu de creştere. Numărul de vase pentru subcultură este calculat în funcţie de densitatea celulelor din vasul iniţial de cultură, astfel încât în fiecare vas să se realizeze o densitate optimă, de 20-504 celule / cm2 suprafata de cultura.

7

Page 8: Teme culturi de celule

8.Vasele de cultură sunt acoperite şi puse la incubat în condiţii de umiditate, CO2 5% şi +370C.

CONTROLUL DE CREŞTERE A CULTURII CELULARE

Controlul de creştere a culturilor celulare consta in determinarea numărului de celule şi a viabilităţii celulare.

Determinarea numărului de celule:

Într-un tub 12/12 se pun 0,05 ml de suspensie celulară cu 0,05 ml albastru de tripan 0,3%. Albastru de tripan este un colorant vital, care nu poate trece prin membrana intacta a celulelor vii, colorand doar celulele cu membrana celulara degradata (celulele moarte). Se folosesc pipete cu varfuri sterile. Se omogenizeaza bine amestecul. Se pun 1-2 picături din amestecul obţinut pe o cameră de numărat celule (tip Neubauer). Camera de numarat se monteaza pe masa microscopului. Cu obiectivul 10x se numara celulele din patratele externe ale camerei, fiecare compus din cate 16 patrate mai mici (vezi imaginea atasata). Se noteaza separat celulele colorate (moarte) si cele necolorate (vii)

Pentru determinarea concentratia celulelor/ml, se aplica urmatoarea formula Numar celule/ml = nr celule in cele 4 patrate externe/4 x 10 000

8

Page 9: Teme culturi de celule

Pentru determinarea numarului total de celule in cultura numarul de celule/ml se inmulteste cu volumul suspensiei obtinute dupa tripsinizare (6 ml in cazul protocolului de mai sus).

Pentru determinarea viabilitatii celulare aplicam formula:

Pe baza datelor obtinute la subcultivarea celulelor se poate construi o curba de crestere a celulelor, dupa modelul prezentat in figura de mai jos.

Daca noile culturi celulare obtinute prin subcultivare se vor initia de fiecare data cu

acelasi numar de celule, atunci, fara a face curba de crestere zilnica, se va putea estimare cu o mare precizie intervalului de timp necesar efectuarii pasajului celular. In figura de mai jos

9

Page 10: Teme culturi de celule

celei, in care este reprezentata curba de crestere celulara, este dat un exemplu de grafic pentru subcultura seriala si semnificatia valorilor inscrise pe acesta.

Tema. 3 OBŢINEREA CULTURILOR DE CELULE PRIMARE PRIN METODA TRIPSINIZARII LA CALD

10

Page 11: Teme culturi de celule

Cultura de celule primare este o cultura obtinuta cu ajutorul celulelor izolate din fragmente de tesut proaspat.

Celulele pot fi izolate din tesuturi prin metode rapide (cateva ore), procesare mecanica, digestie enzimatica sau ambele, in functie de tipul sau duritatea tesutului. Culturile primare pot fi obtinute, de asemeenea, prin metoda de migrare a celulelor dintr-un fragment tisular, timp de 2-3 saptamani.

APARATELE NECESARE:Hota cu flux de aer laminar verticalCentrifuga cu racireAgitator orbital termostatatCamera de numarat celule (Hemocitometru Burger-Turc sau altele)Incubator cu CO2 si umiditateMicroscop invesrsat in contrast de faza

MATERIALE DE LUCRU:-2-3 placi Petri de sticla sterilizate in prealabil -2 pipete serologice sau pipete Pasteur cu bulb-Foarfeci cu varf subtire si pense anatomice sterilizate in prealabil-pipete automate de diferite volume cu varfuri de unica folosinta-flacoane Erlenmayer de sticla (100-250 ml, in functie de volumul tesutului) sterilizate-sita de nylon sterila cu dimensiunea porilor > de 40µm-Flacoane de cultura cu suprafata de 25cmm2 SOLUŢII ŞI MEDIU DE CULTURĂ:1. Soluţia fosfat – salină (PBS), fara ioni de Ca2+ si Mg2+ alcătuită din:KCl – 200 mgKH2PO4 - 200 mgNaHPO4 x 7 H2O – 2,16 g sau Na2HPO4 – 1,14 gNaCl – 8 gAdusa la 1000 ml cu apa bidistilata sau ultrapurapH-ul solutiei se aduce la 7,3-7,4, ajustandu-se cu HCl 1N şi NaOH 1N sterile

2. Soluţia de Tripsină (0,25%) in PBS cu pH 7,4.Triopsină 1:250 – 2,5 gPBS – 1000 ml

3. Mediu de cultură MEM (Mediu Eagle Minimal) de baza cu 10% SFB si 1% P/S/N - Intr-un recipient de sticla de 1000 ml cu agitator magnetic, se dizolvă continutul

unui flacon precantarit de pulbere MEM (17,4g) in 800 ml apa bidistilata sau apa ultrapura

- Se agita pe platforma agitatorului magnetic pana la solubilizarea completa a pulberii

11

Page 12: Teme culturi de celule

- Se adauga in mediu reconstituit 3,7g de NaHCO3- Se agita in continuare pana la solubilizarea comoleta a solutiei de bicarbonat- Se aduce volumul final al solutiei la 1000ml cu apă dublu-distilată sau ultrapura- Se verifica valoarea pH, pentru a avea 7,3-7,4. Ajustarea pH se face cu HCl 1N şi

NaOH 1N - Se filtreaza steril cu ajutorul filtrului atasat la o pompa de vacuum si se stocheaza

la +2-4oC. - Pe recipientul in care se stocheaza mediul se noteaza data reconstituirii, continutul

(cu sau fara SFB sau P/S/N), numele utilizatorului

4. Mediu de cultură MEM complet (cu 10% SFB si 1% P/S/N)Pentru 500 ml mediu este nevoie de:

- 449,5 ml MEM de baza- 50 ml SFB dezghetat si filtrat steril- 0,5 ml amestec solutie stoc P/S/N , care este preparata din 1 ml Penicilină de 1 000

000 UI + 1g Streptomicină si 1 ml neomicina în 100 ml PBS si se pastreaza la -20oC

TEHNICA DE LUCRU efectuata pe parcursul a 2 lucrari practice dupa cum urmeaza:

Lucrare de laborator Nr.1(2-3 ore)Se pregatesc pentru lucrarea de laborator Nr.2 (cu o saptamana inainte de izolare celulelor propriu-zisa) urmatoarele materiale si solutii, conform indicatiilor de mai sus:

1. Se sterilizeaza cu ajutorul aerului fierbinte si ambalaj din folie de aluminiu urmatoarele materiale: - Placi Petri de sticla - 2 foarfeci cu varf subtire si curbat- 2-3 pense anatomice- 2 flacoane Erlenmayer

2. Se sterilizeaza in abur fierbinte si ambalate in cutii din PP:- Varfuri pentru pipete automate

3. Se prepara solutiile HCl 1N si NaOH 1N pentru ajustarea pH 4. Se prepara solutia PBS sterila fara Ca si Mg5. Se prepara mediu MEM simplu, steril6. Se prepara mediu MEM complex, steril7. Se prepara solutia de tripsina, care se filtreaza si se pastreaza in volume de cate 5

ml la -20oC)8. Se pun la congelator 3-4 litri de apa pentru a forma cuburi de gheata pana la

momentul celei de-a 2-a lucrari practice

12

Page 13: Teme culturi de celule

Lucrarea de laborator Nr.2 (4 ore) - Izolarea celulelor din tesutul dermo-epidermic de sobolan.

1. In hota cu flux de aer laminar se pregatesc 3 tuburi conice de centrifuga, cu volum de 50 ml, notate, cu cate 30 ml solutii de spalare pentru tesut, dupa cum urmeaza:

I-ul flacon (4% P/S/N in MEM de baza, fara SFB)II-lea flacon (2% P/S/N in MEM de baza, fara SFB)III-lea flacon (MEM simplu, fara SFB)Pana la recoltarea tesutului, flacoanele se tin la rece (frigider sau pe gheata)

2. Se sacrifica animalul prin inectie letala a unui anestezic de uz general.

3.Se depileaza o parte din sprafata dorsala a tegumentului

4. Se dezinfecteaza zona depilata cu solutie de alcool iodat

5. Se decupeaza cu un foarfec steril zona pregatita pentru recoltareTesutul va fi pus în lucru cât mai repede posibil (în intervalul dintre recoltare şi

prelucrare ţesutul se va menţine la o tempratură de +40C pentru oprirea proceselor metabolice).

6. Se imerseaza fragmentul de tesut in flaconul cu solutia I de spalare si se agita energic timp de 10 min

7. Se transfera in solutia II si se agita energic timp de 10 min

8. Se transfera in solutia de spalare III si se agita energic timp de 10 min9. Se transfera tesutul intr-o placa petri sterila, de sticla, peste care se adauga 4-5 ml de

mediu MEM complet

10. Se curata partea dermo-epidermica de hipoder cu ajutorul unui foarfec ascutit cu varf curbat

11. Se spala fragmentul de tesut de cateva ori cu mediu proaspat

12. Ţesutul este fragmentat (timp de 5-10 min) in fragmente fine, cu ajutorul unui foarfec mic, până la obţinerea unor fragmente mici, de aproximativ 1-3 mm diametru.

13. În vasul unde s-a efectuat fragmentara se adaugă circa 3-4 volume (raportat la masa ţesutului fragmentat) de tripsină de lucru. Soluţia de tripsină va fi încălzită în prealabil la +370C.

13

Page 14: Teme culturi de celule

14. Se decantează steril suspensia tisulară în tripsină într-un vas de tripsinizare (flacon Erlenmayer de 100 ml sau alt volum, in functie de cantitatea materialului de prelucrat)

15. Vasul de tripsinizare se aşează pe platforma incubatorului cu agitare orbitala, la 130-150 tur/min si temperatura de 37oC. Se face omogenizarea suspensiei timp de 5-10 min.

16. Se lasă câteva secunde suspensia în repaus, pentru sedimentarea fragmentelor mari, încă nedegradate, apoi se decanteaza uşor supernatantul, fie cu o pipetă cu o cameră de aer şi cu vârful efilat, fie prin aplecarea prudentă a vasului deasupra flaconului de colectare (flacon de cultura de 50 ml, răcit în prealabil la gheata)

17. Flaconul cu suspensia celulara este pastrat la gheaţă până la decantarea următorului eşantione

18. Peste fragmentele rămase în balonul de tripsinizare se adaugă din nou tripsină (+370C) şi se reia agitarea timp de 5-10 min.

19. Se poate trece prin câteva etape de tripsinizare, până la epuizarea fragmentelor mai mari de ţesut.

20. În final, suspensia celulară în tripsină este decantată în cupe de centrifugare (răcite la +40C).

21. Cupele se echilibrează şi se pun la centrifugat 10 min la 500G sau 800-1000 rot/min (se foloseşte o centrifugă cu răcire).

22. Se decantează supernatantul (soluţia de tripsină), iar sedimentul se reia in mediu de cultură, astfel încât să se obţină o concentraţie celulară optimă, de 105 celule / ml (numărătoare celulară de control).

23. Suspensia celulară în mediu este repartizată steril în vase pentru culturi celulare:-flacoane de 25 cm2, câte 5 ml/flacon

24. Flacoanele de cultură se aşează pe suprafaţă plană, în incubatorul cu CO2 şi umiditate, la temperatura de +370C si concentratia de CO2 de 5%, notând pe partea superioară a recipientului denumirea celulelor cultivate, data initierii culturii, numarul de celule insamantate/flacon si numele operatorului.

25. Mediul de cultura initial si celulele moarte, neaderate de fundul flaconului sunt inlaturate a doua zi. Peste cultura aderata de suport se adauga 5 ml mediu MEM complet proaspat.

14

Page 15: Teme culturi de celule

ATENTIE!

1. Se lucreaza cu mare atentie, pentru a nu atinge varfurile de lucru (instrumentar, pipete) de suprafete contaminate sau pielea operatorului

2. La deschiderea recipientelor cu mediu se are grija ca marginea gatului, marginea si interiorul capacului sau a dopului sa nu fie atinsa de materiale contaminate sau mana examinatorului.

3. Dupa deschiderea flaconului cu mediu de cultura, capacul sau dopul este pus fie cu partea interioara in sus, intr-o zona a hotei sigura, ferita de pericole de atingere/stropire sau este pozitionat cu partea interioara in jos, pe o suprafata sterila (o placa sau un capac de placa Petri)

15

Page 16: Teme culturi de celule

4. Flaconul cu mediu este inchis si pus la frigider imediat dupa extragerea din el a cantitatii de mediu necesar pentru lucru.

CULTURI DE CELULELUCRARI PRACTICE

16

Page 17: Teme culturi de celule

CICLUL II STUDII MASTERLE

S.L. DR. BIOL. BUTNARU MARIA

17