Acizi Nucleici Medicina I COLOR

76
Acizii nucleici Acizii nucleici sunt policondensati de nucleotide Nucleotid: baza azotata – pentoza - fosfat

Transcript of Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Page 1: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Acizii nucleici

Acizii nucleici sunt policondensati de nucleotide

Nucleotid: baza azotata – pentoza - fosfat

Page 2: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 3: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 4: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Nucleaze: hidrolaze care scindeaza (prin contributia unei molecule de apa) o legatura fosfodiesterica. DNAze (specifice pentru legaturile fosfodiesterice ale dezoxiribonucleotidelor); RNAze specifice legaturilor fosfodiesterice dintre ribonucleotide

Exonucleaze: scindeaza numai un nucleotid terminal (specifice 3’ sau 5’)Endonucleaze: scindeaza o legatura fosfodiesterica distantata cu cel putin 2 nucleotide de terminus.

Page 5: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

http://www.hhmi.orghttp://www.dnai.org

Page 6: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 7: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 8: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Izolarea DNA din celule si analiza proprietatilor sale

Extractia consta din:1. Liza celulelor si a nucleelor (mecanica sau detergenti)2. Precipitarea proteinelor (fenol sau alt precipitant)3. Centrifugare4. Precipitarea din supernatant cu alcool5. Purificare prin centrifugare in gradient de clorura de cesiu (clasic) sau adsorbtia

pe si elutia din rasini care retin numai acizii nucleici6. Tratamentul cu RNAza (daca vrem sa izolam ADN) sau DNAza (daca vrem sa

izolam ARN)Analiza :Fragmentare (enzime de restrictie) si electroforeza in gel de agaroza

http://www.dnai.org

Page 9: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 10: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 11: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 12: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 13: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

animatiiF://animatiihttp://www.dnai.org/d/index.html

Manipulations, Techniques, PCR, secventare

Sinteza in vitro a DNA prin reactia PCR

Page 14: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 15: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Secventarea ADN prin tehnica terminarii lantului prin folosirea 2,4 di-dezoxi NTP (animatie)http://www.dnai.org/d/index.html

Page 16: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 17: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

http://en.wikipedia.org

http://en.wikipedia.org-DNA-Wkipedia

http://en.wikipedia.org-DNA – Fuorescent in situ hybridization – Wkipedia

DNA polimeraze

DNA polimeraze DNA dependente:

Procariote:

DNA polimeraza I (E. coli), procesivitate mica, 5’ exonucleaza asociata, 3’exonucleaza asociataDNA polimeraza II (E.coli) procesivitate micaDNA polimeraza III (E. coli) inalt procesiva, 3’exonucleaza asociataDNA polimeraza IV (E.coli) procesivitate mica, poate face sinteza translezionala a dimerilor de timinaDNA polimeraza V (E coli) procesivitate mica, fidelitate mica, face sinteza translezionala cu greseliTaq polimeraza (Termus aquaticus) procesivitate mica, 5’polimeraza asociata

Eucariote:

Page 18: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

DNA polimeraza (cu centru catalytic suplimentar de ARN polimeraza (primaza); neprocesivaDNA polimeraza neprocesivaDNA polimeraza (mitocondrialla)DNA polimeraza inalt procesiva, centru catalytic 3’exonucleazicDNA polimeraza inalt procesiva, centru catalytic 3’ exonucleazicDNA polimeraza procesiva, poate face sinteza translezionala T-T fara eroareDNA polimeraza procesiva, face sinteza translezionala cu erori

DNA polimeraze RNA dependente (revers-transcriptaze)

Caractere comune:Toate adauga nucleotide (din nucleozid trifosfati) la extremitatea 3’ a unui primer, conform unui model monocatenar)Toate au nevoie de un model (DNA in cele mai multe, ARN la revers-transcriptaze)Toate au nevoie de un primer (ADN sau ARN) complementar cu modelul

Diferente:

Functii enzimatice suplimentare (datorate unor centri catalitici diferiti de cel polimerazic)5’ exonucleazic3’ exonucleazic

Fidelitate

Procesivitate (datorata unei subunitati speciale numite factori de procesivitate), uneori folosita alternativ de una sau alta din polimeraze (de exemplu polimeraza eucariota delta si polimeraza eta folosesc acelasi factor de procesivitate PCNA, dar nu simultan.

Capacitatea de a sesiza sau nu leziunile

Capacitatea de a adauga (sau nu) un nucleotide suplimentar la catena sintetizata dupa terminarea modelului

Molecule DNA in vivo

Molecule circulare (in special la procariote) : cromozomi bacterieni (sute de mii de perechi de nucleotide), plasmide (mii de perechi de nucleotide)

Page 19: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Cromosomi la eucariote : DNA linear cu extremitatile celor doua catene sudate. DNA cromosomal este impachetat cu proteine, sub forma de cromatina

Page 20: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 21: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 22: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 23: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 24: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 25: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 26: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Topoizomeraze:

Enzime care catalizeaza trecerea unui topoizomer: de exemplu DNA superhelicat, adica avind un n –linking number-diferit de cel de echilibru in DNA relaxat, cu n – linking number- apropiat de cel de echilibru

Topoizomeraze I (fac rupturi monocatenare temporare si sudare dupa relaxare)Topoizomeraze II (fac rupturi bicatenare si resudare dupa relaxare sau superhelicare dependenta de ATP)

Page 27: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 28: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 29: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 30: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 31: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 32: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Fidelitatea replicarii DNA

Probabilitatea de a introduce un nucleotid gresit este in jur de 10-9. Ea este atit de mare in ciuda faptului ca: - erorile datorate numai formelor tautomere ale bazelor ar avea frecventa de ordinul 10-5

-agitatia termica ar duce la ruperea legaturilor N- glicozidice la un numar de aprox. 10-4 – 10-5 situri abazice. In timpul replicarii, acele situri ar putea fi complementate cu orice nucleotid, corect sau gresit.

-factori fizici (radiatia UV, radiatiile ionizante, chimicale ca acidul nitros si derivatii sai, agentii alkilanti, hirocarburile policiclice (din fum, gudroane, etc) pot modifica un numar variabil de baze azotate. In acest caz, in cursul replicarii, aceste baze modificate ar putea duce la complementarea gresita pe catenele noi sintetizate.

Aceste efecte sunt contracarate de:

- Functia editoare (3’-exonucleazica) a DNA polimerazelor (mai ales in cazul erorilor produse de formele tautomerice minore a bazelor azotate (care dureaza foarte putin in timp

- Procese de reparare a leziunilor

Leziunile DNA si repararea lor

1. Oxidari (raze UV, derivati ai acidului nitros)

Dezaminare

Page 33: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

2.Alkilari (metil metan sulfonat, gaz mustar si alti agenti alkilanti)

Page 34: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 35: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

3. Legaturi covalente nenaturale intre baze azotate (raze UV)

Page 36: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

4. Rupturi monocatenare (UV, procese ale metabolismului DNA)

5. Rupturi bicatenare (radiatii ionizante, rupturi in timpul replicarii, etc)

Page 37: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Raspuns la leziunile DNA

Raspuns Ce se intimpla in lipsa raspunsului (boli genetice care predispun la cancer)

Oprirea ciclului celular (prin mecanismele de ‘check-point’ al integritatii genomului

Ataxia-telangiectazia

Repararea ADN1. Repararea neinperecherii de baze (MMR)

Cancer de colon non-polipozic familial

Repararea ADN2. Repararea prin excizie de baze (BER)Repararea ADN3. Repararea prin excizie de nucleotide (NER)

Xeroderma pigmentosum, diferite variante

Repararea DNA4. Repararea rupturilor bicatenare

Sindromul Bloom, sindromul Werner, sindromul Nijmegen

Apoptoza Sindromul Li Fraumeni, cancere variateMutatii, eventual transmisibile la descendenti

Boli genetice diverse

Page 38: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 39: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 40: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Repararea prin folosirea altui duplex ca model (repararea prin recombinare)

Page 41: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Acizii ribonucleici (ARN, RNA): lanturi de ribonucleotide

Page 42: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Existenta functiei alcoolice la 2’ face ca ARN sa fie diferit de AND in urmatoarele privinte:

1. Legaturile fosfodiesterice la AND sunt mult mai stabile decit cele de la ARN (labilizate de vecinatatea functiei hidroxil la 2’)

2. ARN are proprietati catalitice, datorita aceleiasi functii hidroxil de la pozitia 2’ a ribozei. ARN poate cataliza reactii de transesterificare si transpeptidare

Page 43: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Majoritatea moleculelor de ARN sunt monocatenare; exista si ARN bicatenar

Page 44: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 45: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Specii de ARN in vivoARN monocatenar

Nuclear Citoplasmatic

hnRNA (heterogen)==

mRNA (mesager)

RNA nucleolar rRNA (ribosomal)

snRNA

tRNA (transfer)

ARN regulatori

Pre miRNA (monocatenar, nuclear), siRNA sau miRNA/miRNA (bicatenar, citoplasmatic)

Page 46: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Sinteza ARN

Se face prin transferul unuia din cele 4 nucleotide componente: Adenilic, Guanilic, Citidilic, Uridilic de la ATP, GTP, CTP sau UTP la hidroxilul 3- a unui nucleotid (sau polinucleotid) anterior. Extremitatea 5’ a unui ARN nou sintetizat este intotdeauna un nucleozid trifosfat.

N1TP + N2TP -- N1TP – N2P + PPi

Reatia este catalizata de RNA polimeraze

RNA polimeraze :

ADN dependente

ARN dependente sau ARN replicaze (caz particular, in special la celulele vegetale) rezultind intr-un ARN bicatenar care poate fi fragmentat in RNAi (scurte molecule de ARN bicatenar de catre complexul Dicer existent in toate celulele eucariote)

Page 47: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 48: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 49: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 50: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Dolan : http://www.dnai.org/d/index.html

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

Page 51: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 52: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 53: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

http://en.wikipedia.org`Reglarea expresiei genice

Prin ritmul transcriptiei

Page 54: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 55: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Author

Permission(Reusing this image) See

below.

Text explicativ la aceasta imagine se poate gasi pe wikipedia/RNA

http://www.nature.com/focus/rnai/animations/animation/animation.htm

Codul genetic

Alfabetul de 4 litere al DNA trebuie sa codifice 20 de aminoacizi. Aceasta se poate face doar prin grupare

Page 56: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Daca fiecare nucleotide ar codifica un aminoacid cele 4 nucleotide ar putea codifica 4 nucleotideDaca un grup de doua nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 2 nucleotide ar putea codifica 42 = 16 aminoaciziDaca un grup de trei nucleotide (din 4) ar codifica un aminoacid atunci toate combinatiile de 3 nucleotide ar putea codifica 43 = 64 aminoacizi

Mai mult decit sufficient pentru cei 20 aminoacizi + citeva semne de punctuatie

Un triplet de nucleotide este unitatea de cod = codon

Codonii sunt juxtapusi sau suprapusi?

Exista semne de punctuatie care sa separe codonii?

Care sunt codonii pentru fiecare aminoacid?

http://www.dnai.org/d/index.html

Page 57: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Moleculele si structurile supermoleculare care iau parte la biosinteza lanturilor polipeptidice (procesul de translatie a mesajului genetic)

1. ARN mesager (mesajul)

2. Conjugatul aa-tRNA (decodorul)

Page 58: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Reactia aminoacil – tRNA sintetazei

Page 59: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 60: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 61: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 62: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

3. Ribosomul (masina decodoare)

Page 63: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 64: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Sinteza lanturilor polipeptidice (translatia informatiei genetice)

Etape:

1. InitiereSubunitatea mica se asociaza cu mRNA si cu tRNAmet initiator plasat in situl P impreuna cu codonul initiator de pe mRNA. Apoi asociaza si subunitatea mare

2. Alungire Se intimpla in cicluri; fiecare ciclu rezultind in adaugarea unui nou aminoacid la aminoacidul initiator (ciclu 1) sau a unui lant polipeptidic cu n aminoacizi (ciclul n)

3. TerminareSe intimpla cind in situl A al ribosomului apare un codon ‘stop’ nerecunoscut de nici un anticodon ci de un factor proteic de terminare.

Page 65: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Lantul polipeptidic se desface de ultimul tRNA si subunitatile ribosomului disociaza

1. Initiere

Page 66: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 67: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 68: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 69: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Efectele mutatiilor punctuale din DNA asupra proteinelor codificate

Page 70: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Mutatii punctuale:

1. Substitutii (un nucleotid inlocuit prin alt nucleotid)

Efecte posibile:a. Nici un effectb. Inlocuirea unui aminoacid cu alt aminoacid (mutatie missense – sens gresit)c. Scurtarea prematura a lantului (mutatie nonsens, datorita transformarii unui

codon sens (codifica aminoacid) in codon ‘stop’)

2. Insertii/deletii (mutatii cu alterarea cadrului de lectura)

Efecte: a. Alterarea completa a secventei de aminoacizi inspre extremitatea C, pornind

de la locul mutant; b. Lant polipeptidic mai scurt sau mai lung, ca effect al schimbarii cadrului de

citire

Page 71: Acizi Nucleici Medicina I COLOR

Soarta lanturilor peptidice dupa sinteza lor

Page 72: Acizi Nucleici Medicina I COLOR
Page 73: Acizi Nucleici Medicina I COLOR