DIAGOSTIC IN VIROZE RESPIRATORII

VIROZE RESPIRATORIISindrom Virusuri frecvent

asociate Etiologii infrecvente

IACRS Rhinovirusuri, Coronavirusuri

V. paragripale, enterovirusuri, adenovirusuri

Gripa Orthomixovirusuri

Crup V. paragripale Orthomixov, VRS, adenovirusuri

Bronsiolita VRS Orthomixo-; paragripale; adenovirusuri

Bronho-pneumonie

Orthomixovirusuri VRS, Adenovirusuri

Virusuri paragripale v. rujeolos, VZV, CMV

Diagnostic in infectia cu virusuri gripale

Orientare clinica

febra (3-5 zile), mialgie, cefalee, astenie (>2 saptamani), tuse neproductiva, faringita, rinoree.

Gripa nu se diagnosticheaza clinic. Simptomatologie asemanatoare cu infectii determinate de: Mycoplasma pneumoniae, adenovirusuri, virusul respirator sincitial, rhinovirusuri, virusuri paragripale, si Legionella spp.

ORTHOMIXOVIRUSURI-V. GRIPALE A, B, Cmyxa-mucus

tip A, B, C : NP, M subtipuri: HA si NA –15 tipuri de HA si 9 de NA

Matrice

Nucleocapsida helicoidalaARNss

HA - hemaglutinina

transcriptaza

anvelopa

NA - neuraminidaza

Produse patologice :

a) spalatura nazo faringiana se obtine cu ajutorul unor tampoane cu coada (sterile) introduse in cornetul nazal inferior.

b) aspiratul nazofaringian se obtine folosind un speculum nazal prin administrarea a 3 ml ser fiziologic in nari cu o seringa atasata la un tub de plastic. c) lavaj traheobronsic se obtine prin bronhoscopie in conditii speciale de catre personal calificat

Pentru a mari sansa de izolare probele se recolteaza in primele 72 ore de la debutul infectiei.

Produse patologice

Exsudat naso-faringian/SNF Recoltare. tampon steril - recoltare secretii de pe peretele

posterior si lateral al orofaringelui si din orice arie adiacenta cu inflamatie, exudat sau ulceratie. Se evita atingerea tamponului de limba, obraji sau buze pentru evitarea contaminarii;

recoltarea nazala se obtine cu ajutorul unui tampon cu coada introdus in cornetul nazal inferior.

Stocare si transport. Optim se inoculeaza imediat dupa recoltare. Daca aceasta nu este posibil se ingheata la -70 C si se transporta pe zapada carbonica

Prelucrare. Tamponul este dispus intr-un tub steril cu circa 15 ml mediu de transport pentru virusuri si 2% SFV minim o ora, timp necesar elutiei virusului. Tubul se centrifugheaza la 2500 g, 15 minute, la 4 C. Supernatantul este indepartat si sedimentul este resuspendat in 3-4 ml TFS sau mediu de cultura. Spalarea celulelor se poate repeta pentru indepartarea urmelor de mucus din secretii. In final depozitul de celule reluat in TFS serveste pentru izolare virala sau pentru efectuarea de frotiuri ce vor fi testate in imunofluorescenta cu intreaga baterie de seruri antivirale disponibile.

Diagnosticul de laborator al gripei Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa antigene virale- RIF acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

1. -culturi primare de rinichi de maimuta rhesus.-linia continua epiteliala de rinichi de caine (MDCK - Madin-Darby Canine Kidney).

2. pe ou de gaina embrionat,de 9-11 zile, inoculat

intraamniotic sau intraalantoidian.

Izolare virala – diagnostic de electie

Hemadsorbtiademonstreaza izolarea v.gripale pe culturi de celule

Virusurile gripale nu sunt citopatogene.

La 48 ore dupa inocularea v. gripal se incearca detectia virusului prin hemadsorbtie, obisnuit cu eritrocite de cobai la 4 C.

Hemadsorbtia rezulta din incorporarea in membrana plasmatica celulara a HA virale. Hematiile adsorbite specific rozeteaza la periferia celulelor infectate.

1. -culturi primare de rinichi de maimuta rhesus.-linia continua epiteliala de rinichi de caine (MDCK - Madin-Darby Canine Kidney).

2. pe ou de gaina embrionat, de 9-11 zile, inoculat intraamniotic sau intraalantoidian.

Izolare virala – diagnostic de electie

Izolarea pe OGE

Izolarea se dem. prin proprieratea v. gripale de a aglutina hematii

REACTIA DE HEMAGLUTINARE

Capacitatea unor virusuri de a aglutina hematiile unor specii de animale

Virusurile care poseda capacitatea de a aglutina hematii se numesc virusuri hemaglutinante (rubeola, rujeola, urlian, unele adenovirusuri, enterovirusuri, gripale si paragripale)

Punerea in contact a unor dilutii succesive, binare de antigen hemaglutinant cu hematiile corespunzatoare virusului incriminat

Etape:

•Ag. viral - dilutii binare

•suspensie de hematii

•Se incubeaza la temperatura camerei - 60 minute

Rol RHA:Demonstrarea prezentei virusului hemaglutinantTitrarea antigenului hemaglutinant inaintea reactiei de hemagutino-inhibare

UHA

DEMONSTRAREA PREZENTEI VIRUSULUI IN OGEREACTIA DE HEMAGLUTINARE

CLASIFICAREA V. HEMAGLUTINANTE

I. HA structurala care distruge R V gripale, paragripale

II. HA structurala care nu distruge R Arbovirusuri, v rubeolos

III. HA non-structurala poxvirusuri

IDENTIFICAREA V. GRIPALER. HEMAGLUTINO-INHIBARE

Tehnica reactiei:

dilutii binare din ser imun de referintaag. viral hemaglutinant - 60 min la 37°C.sistem indicator - suspensia de hematii.Se incubeaza 60 min la temperatura camerei

Reactia de identificare a virusurilor gripale

UHAI

Diagnosticul de laborator al gripei Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa antigene virale- RIF acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

Imunofluorescenta directa – test rapid, reproductibil, ieftin

Diagnostic rapid in

gripa, infectie herpetica, rabie.

Reactia de Imunofluorescenta directa

Amprenta se va usca bine:

pp. amprentat direct pe lama

Imersie in acetona la 2-8°C timp de 10 minute si uscare.

ID

PP

Reactivii trebuie sa fie la temp.camerei

Incubare cu anticorp fluorescent (30 min la 37° C) Spalare Citire la MO in lumina UV

ID

PP

Anticorpi monoclonali marcati cu ITCF anti epitopi specifici de la nivelul anvelopei, ex. anti H1N1; anti H3N3

Diagnosticul de laborator al gripei Directii de diagnostic

Izolare virala + identificare

Detectie directa antigene virale- RIF acid nucleic- PCR

Diagnostic serologic

Diagnosticul serologic Necesita recoltarea de probe de ser pereche de la

acelasi pacient. Nu se practica in mod curent decit in caz de epidemii,

pentru diagnostic retrospectiv. Diagnosticul necesita demonstrarea unei cresteri

semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac specifici antivirali intre proba de faza acuta, recoltata la o saptamana de la debutul bolii si cea din convalescenta, recoltata 2-3 saptamani mai tarziu.

Metoda preferata de evidentiere a anticorpilor anti virali specifici este hemaglutinoinhibarea.

DIAGNOSTIC SEROLOGICRHAI = Tulpini de referinta + ser pacient

•diagnostic retrospectiv, •recoltarea de probe de ser pereche•cresteri semnificative (de peste 4 ori) a titrului Ac specifici

Pacient cu febra, cefalee, astenie, tuse neproductiva. Ce produse patologice utilizati?

Cum faceti diagnosticul rapid?Pe ce substraturi se poate face

izolarea virala?Este diagnosticul serologic de

prima intentie in aceasta viroza?

Precizati tipul de reactie reprezentata in sirurile de godeuri C, D, E si principiul tehnicii. Pentru ce viroze tehnica aceasta este de electie si ce simptome clinice prezinta pacientul?

Precizati tipul de reactie si infectiile virale care pot fi diagnosticate cu aceasta.

Cum demonstrati izolarea unui virus hemaglutinant?

Cum se face identificarea virusurilor hemaglutinante?