LP 4

DOZAREA ENZIMATIC A GLICEMIEI. DOZAREA ENZIMATIC A COLESTEROLULUI / 2 ORE

Glucoza serica

Glucoza este cel mai important monozaharid din sange. Rezulta din digestia

carbohidratilor si din conversia hepatica a glicogenului in glucoza.

Glucoza este un furnizor indispensabil de energie care sustine activitatea celulara. Cei

doi hormoni care regleaza in mod direct nivelul glucozei in sange sunt glucagonul si

insulina.

Glucagonul accelereaza conversia glicogenului in glucoza si determina astfel cresterea

glicemiei.

Insulina creste permeabilitatea membranelor celulare la glucoza, transporta glucoza in

celule (pentru metabolism), stimuleaza formarea glicogenului si reduce concentratia

glucozei din sange.

Alti hormoni care detin un rol important in metabolismul glucozei sunt: ACTH-ul,

glucocorticoizii, adrenalina, tiroxina.

Dozarea glucozei n ser prin metoda enzimatic

Principiul metodei

n prezena glucozoxidazei glucoza este oxidat la acid gluconic. Apa oxigenat

rezultat din reacie reacioneaz cu indicatorul Trinder (fenol si 4-aminoantipirina) n

prezena peroxidazei rezultnd un compus colorat in rosu fotocolorimetrabil.

Cantitatea de glucoz din prob este direct proporional cu intensitatea coloratiei

obtinute.

glucozoxidaz Glucoz + O2 + H2O acid gluconic + H2O2

peroxidaz H2O2 + fenol + 4-amino-antipirina chinonimina (rosu) + H2O

Reactivi:

1. Reactiv 1 conine: tampon TRIS-Cl sau Srensen 90 mmoli/l i fenol 0,3 mmoli/l (pH = 7,5 ).

2. Reactiv 2 conine: glucozoxidaz 10000 U/l, peroxidaz 1000 U/l i 4-aminoantipirin 2,6 mmoli/l PREPARAREA REACTIVULUI DE LUCRU: R1 se amesteca cu R2 in proportia consemnata de producator

3. Reactiv 3 conine: standard de glucoz 5,56 mmoli/l (1g/l sau 100mg %)

Probe: ser nehemolizat, plasm heparinat, snge deproteinizat, LCR

Mod de lucru: n trei eprubete (prob, standard i martor) se pipeteaz:

REACTIVI P S M

Prob ml 0,01

Standard ml 0,01

Ap distilat ml - 0,01

Reactiv de glucoz (R1+R2) ml

1 1 1

Se agit i se incubeaz eprubetele 10 min. la 370C, apoi se citesc extinciile probei i standardului la = 505 nm fa de martor.

Calcul: mg glucoz/100 ml snge = (EP / Es) x C standard

Valori normale

Glicemia 70 100 mg/100 ml snge

Modificri patologice ale glicemiei

Hiperglicemia (in diabet, glicemie > 126 mg/dl) poate apare:

Clinic, hiperglicemia se asociaz diabetului zaharat. Diabetul zaharat este de dou tipuri:

IDDM = insulin dependent diabetes mellitus

NIDDM = non-insulin dependent diabetes mellitus

Dar si in:

boala Cushing, acromegalie/gigantism, adenom hipofizar (secretor de hormon de crestere), hemocromatoza, pancreatita acuta/cronica, neoplasm de pancreas, glucagonom, afectiuni renale cronice, boala hepatica avansata, deficienta de vitamina B1 (encefalopatia Wernicke), stres acut emotional sau fizic (infarct miocardic, AVC, convulsii)

Hipoglicemia (glicemie < 50 ml/dl asociat cu manifestri clinice) poate fi asociat cu:

- tumori hipersecretante de insulin (insulinom pancreatic)

Dar si in:

tumori extrapancreatice (ex. hepatom), boala Addison, malabsorbtie, necroza hepatica (hepatita, intoxicatii), prematuri, nou-nascuti din mame diabetice, deficiente enzimatice (ex. galactozemie), supradozaj insulinic, hipoglicemie reactiva (hiperinsulinism indus alimentar, tulburari endocrine), hipoglicemie postprandiala (dupa interventii chirurgicale gastrointestinale, intoleranta ereditara la

fructoza, galactozemie)

Colesterolul seric

Determinarea nivelului colesterolului evalueaza statusul lipidic si tulburarile

metabolice, riscul de ateroscleroza, stenoza coronariana si infarct miocardic.

Dozarea colesterolului si a fractiunilor HDL- si LDL-colesterol reprezinta test

screening pentru evaluarea gradului de ateroscleroza, hipertensiune arteriala,

cardiopatie ischemica si accident vascular cerebral sau pentru monitorizarea

pacientilor cu afectiuni coronariene.

Prin urmare, colesterolul se determina pentru:

- Monitorizarea factorilor de risc crescut pentru boala coronariana;

- Screening-ul dislipidemiilor primare si secundare;

- Monitorizarea tratamentului dislipidemiilor (TG mari, HDL-col mic)

Dozarea colesterolului total prin metoda enzimatica colorimetrica

Principiul metodei

Metoda enzimatica permite determinarea cantitativa si specifica a colesterolului total

din lichide biologice.

Colesterolul si esterii colesterolului sunt eliberati din lipoproteine sub actiunea

enzimelor colesterolesteraza, colesterol oxidaza si peroxidaza.

Peroxidaza in prezenta fenolului si a 4-aminoantipirinei (PAP) conduc la formarea

produsului final, chinonimina (rosu), direct proportional cu cantitatea de colesterol din

proba.

colesterol esteraza Esteri de colesterol + H2O colesterol + acizi grasi

colesterol oxidaza Colesterol + O2 3-colesten (colestenona) + H2O2

peroxidaza 2 H202 + fenol + 4-aminoantipirina (PAP) chinonimina (rosu)

Reactivi

REACTIVUL l Tampon PIPES pH 6,9 (90 mmol/l); fenol (26 mmol/l);

REACTIVUL 2: colesterol esteraza (300 U/1); colesterol oxidaza (300 U/1);

peroxidaza (1250 U/I); 4-aminoantipirina (0,4 mmol/l).

STANDARD colesterol:colesterol 200 mg/dl, 2g/l, 5,17 mmol/l.

PREPARAREA REACTIVULUI DE LUCRU: R1 se amesteca cu R2 in proportia consemnata de producator

Proba: ser sanguin, plasma heparinizata (nehemolizata).

Mod de lucru

In trei eprubete PROBA (P), STANDARD (S) si MARTOR (M) se adauga reactivii

conform tabelului:

REACTIVI PROBA (P) STANDARD

(S)

MARTOR

(M)

Amestec reactivi (enzimatic-

culoare) 1ml 1ml 1ml

PROBA (ser) 10 l - -

STANDARD - 10 l -

APA DISTILATA - - 10 l

Se agita, se incubeaza 10 minute la 37C. Se masoara extinctia probelor (Ep) si a standardului (Es) fata de martor la =546nm (sau =505 nm) in cuva de 1 cm. Culoarea este stabila timp de o ora.

CALCUL:

COLESTEROL (mg/dl)= (Ep/Es) x conc. standard exprimata in mg/dl (200mg/dl)

VALORI NORMALE: 160 200 mg/dl

Colesterol total optim adulti < 200 mg/dl; 150-200 mg/dl

Colesterol total optim adolescenti, copii < 170 mg/dl;

Suspiciune de dislipidemie = colesterol total 220-240 mg/dl

Hipercolesterolemie cu risc crescut >240 mg/dl

Variatii patologice

Valori crescute hipercolesterolemie

- Hiperlipoproroteinemii primare - Hipotiroidie - Ateroscleroza - Colestaza - Sindrom nefrotic - Anotrexie nervoasa - Guta - Diabet - Alcoolism

Valori scazute hipocolesterolemie

- Malabsorbtie - Maldigestie - Inanitie - Carente alimentare - Casexie - Afectiuni hepatice, ciroze - Hipertiroidie - Hipo-alfa-lipoproteinemie