ETAPA III OPTIMIZAREA NOULUI DISPOZITIV DE …ivb.ro/cercetare/proiecte/parteneriate/RENET_RAPORT 3...

PN-II-PT-PCCA-2011-3.2.0623 _RENET 91/2012 _ R3 /2014

1

Contract finantare nr. 91/2012 Cod proiect: PN-II-PT-PCCA-2011-3.2.0623 Titlu: EVALUAREA PRIN qPCR A DIFERENTIERII SENSIBILITATII LA TERAPIE SI PROGNOSTICULUI IN TUMORILE ENDOCRINE

ETAPA III

OPTIMIZAREA NOULUI DISPOZITIV DE DIAGNOSTIC, PROGNOSTIC SI MODULARE A TERAPIEI IN

TUMORI NEUROENDOCRINE CU DIFERITE LOCALIZARI

ACTIVITATEA III.1 EVALUAREA IMUNOHISTOCHIMICA A CAZURILOR SELECTATE DE CAZURILOR DE TUMORI GASTRICE

Tumorile neuroendocrine gastroenteropancreatice (GEP-NET) constituie un grup heterogen de tumori a caror origine este la nivelul celulelor neuroendocrine din tubul digestiv si a caror incidenta a crescut semnificativ in ultimii ani. Recent s-a raportat o incidenta de 11-14 % a tuturor NET-urilor gastrointestinale, cu o incidenta anuala a celor gastrice de 0.18 -0.24/ 100000, in crestere fata de anii trecuti. NET-urile gastroenteropancreatice pot apare la toate varstele, cea mai mare incidenta fiind incepand cu decada a 5a, cu exceptia carcinoidelor apendiceale (~ 40 ani). S-a observat si o frecventa usor mai crescuta la barbati (5.35) fata de femei (4.76). Pacientii cu neoplazii endocrine multiple 1 (MEN-1) sau boala von Hippel–Lindau (VHL) pot avea un debut clinic mai devreme cu 15-20 ani decat cei cu NET-uri sporadice [1].

Familia NETurilor gastroenteropancreatice constituie un grup heterogen dar, toate prezinta un imunofenotip comun pentru markerii pan-neuroendocrini cum ar fi cromogranina A si sinaptofizina, enolaza neuronal-specifica (NSE) si CD56 fiind adesea pozitive, dar mai putin specifice pentru aceste tumori. Coloratii specifice pentru hormoni cum ar fi serotonina, gastrina, insulina si glucagon se pot efectua pentru a confirma originea simptomatologiei clinice dar trebuie sa se tina seama deasemenea de faptul ca expresia lor imunohistochimica nu echivaleaza intotdeauna cu hipersecretia (NET functional). Expresia lui Ki-67 (MIB-1) este obligatorie pentru gradarea tumorii conform clasificarii World Health Organization (WHO) 2010 [2].

Tumorile endocrine gastro-entero-pancreatice pot genera simptome specifice ca urmare a hipersecretiei hormonale. Diagnosticul se sprijina pe argumente clinice, pe dozarea de hormoni, pe metodele imagistice de detectie a tumorii primare si a metastazelor, precum si pe metode scintigrafice. Standardul de aur este insa diagnosticul histologic care trebuie obtinut ori de cate ori este posibil.

NET-urile si carcinoamele neuroendocrine (NEC) gastrice se clasifica pe baza criteriilor comune tuturor neoplasmelor neuroendocrine gastrointestinale si pancreatice.

Cele mai multe neoplasme neuroendocrine gastrice sunt NET-uri carcinoide nonfunctionale cu celule enterocromafin-like (ECL) bine diferentiate si au originea mai ales in regiunea corpului si fundului gastric. S-au descris 3 tipuri de NET-uri gastrice: tipul I, cel mai des intalnit, asociat cu gastrita atrofica autoimuna, mai frecvent la femei cu varste cuprinse intre 15 si 88 ani (media 63 ani), tipul II asociat cu neoplazia endocrina multipla tip 1 (MEN1) si sindromul Zollinger-Ellison, reprezentand ~ 6% din total, cu distributie egala pe sexe si la varste cuprinse intre 28 si 67 ani (medie 50 ani) si tipul III sporadic, cu incidenta de ~ 13 %, mai


2

frecvente la barbati cu varste cuprinse intre 21 si 38 ani. NET-urile secretante de serotonina, gastrina, grelina si ACTH sunt foarte rare (<1%) si pot lua nastere fie din regiunea fundica-corporeala fie din antru. NEC urile si tumorile mixte adenocarcinoame si carcinoame (MANEC urile) se pot dezvolta in orice zona a stomacului, reprezentand intre 6 si 16% din totalitatea neoplasmelor neuroendocrine, mai frecvente la barbati, cu varste cuprinse intre 41 si 61 ani. Din punct de vedere macroscopic, NET-urile tipul I sunt multiple in ~ 60% din cazuri si au aspect de noduli sau polipi localizati in mucoasa sau submucoasa, majoritatea< 1 cm; Pacientii cu NET-uri tipul 2 au peretele gastric ingrosat din cauza gastropatiei hipertrofice-hipersecretorii, a neoplasmelor mucosale-submucosale multiple, de dimensiuni crescute fata de cele din tipul I. NET-urile de tip 3 sunt de obicei unice si au > 2 cm in ~ 33 % din cazuri, cu infiltrarea muscularei propria si a seroasei in 76% si 53 % din cazuri. NEC-urile se prezinta ca mase tumorale mari ce infiltreaza intreg peretele gastric, cu metastaze limfoganglionare si hepatice frecvente. MANEC urile au aspectul unui cancer gastric conventional. NET-urile gastrice sunt intens pozitive la cromogranina A si sinaptofizina.

Din punct de vedere histopatologic, majoritatea NET-urilor cu celule enterochromaffin-like tip I si II si o minoritate din cele de tip III sunt caracterizate prin agregate celulare de talie mica alcatuite din celule de monomorfe, distribuite regulat, formand siruri, trabecule sau microlobuli. Celulele acestor tumori au nuclei monomorfi, caracteristici, margini nucleare regulate, nucleoli inaparenti si citoplasma relativ abundenta, eozinofilica. Mitozele sunt foarte rare, aproape absente. Tumorile cu aceste caracteristici histologice sunt clasificate ca si tumori neuroendocrine grad 1 (NET G1) si sunt de obicei limitate la mucoasa si submucoasa gastrica.

Tipul III, sporadic, de tumori neuroendocrine gastrice cu celule ECL adesea are trasaturi histologice mai agresive , cu agregate solide de celule tumorale, cu distributie celulara neregulata. Celulele acestui tip de tumora sunt fie cu nuclei mari,veziculosi, fie cu nuclei de talie mica, hipercomi, cromatina dispusa neregulat si mici nucleoli. Rata mitotica este crescuta, intre 2 si 20 mitoze/10 campuri obiectiv 40X, iar nivelul de expresie Ki 67 este intre 3 si 20%. Aceste tumori sunt clasificate ca si tumori neuroendocrine grad 2 (NET G2), sunt invazive si asociate cu metastaze locale si la distanta [2]

Tratamentul curativ este posibil in foarte putine cazuri, din cauza descoperirii in stadii tardive, intre 40%-70% din pacienti avand metastaze hepatice in momentul diagnosticului. [3,4] Tratamentul chirurgical este singurul tratament curativ. Deseori se intampla ca pacientii sa se prezinte in urgenta (ocluzie, sindrom apendicular), iar examenul histopatologic sa deceleze ulterior o tumora neuroendocrina; in aceste situatii se va lua in considerare o interventie mai radicala, in limite oncologice, si pentru evaluarea situatiei loco-regionale.

Chimioterapia aduce beneficii in special in formele slab diferentiate si anaplazice, utilizand scheme care asociaza etoposid si cisplatin.[5]

Chemoembolizarea se utilizeaza in NET-uri nerezecabile pentru reducerea masei tumorale, cu ameliorarea simptomatica si ameliorarea supravietuirii.

Evolutia clinica a acestor tumori este de multe ori imprevizibila, exista anumiti factori care influenteaza prognosticul acestor bolnavi [6]

Somatostatina (SST) este un hormon peptidic ce regleaza sistemul endocrin, influenteaza neurotransmisia si proliferarea celulara si inhiba eliberarea altor hormoni secundari. SST actioneaza prin intermediul receptorilor de somatostatina (SSTR) ce reprezinta o familie de 7 proteine transmembranare la nivelul domeniului G, codificate de 5 gene distincte [7-9] . SSTR sunt frecvent exprimati in NET-uri, in special daca acestea au originea la nivelul tractului gastroenteropancreatic (GEP) [10]. Utilizarea unor tehnici ca autoradiografia, hibridizarea in situ , reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR) si immunohistochimia (IHC) au permis identificarea a cel putin 5 subtipuri de SSTR[11-14]. Aceasta descoperire a reprezentat baza moleculara pentru utilizarea analogilor de SST in


3

scop diagnostic si therapeutic [15,16]. Astfel, identificarea tumorii si evluarea extinderii ei se realizeaza prin scintigrafia receptorilor de somatostatina (SRS) iar analogii de SST de lunga durata de actiune si compusii lor radiomarcati reprezinta atat un tratament simptomatic eficient cat si o posibila noua metoda in managementul NET-urilor metastatice.[17,18].

Se cunoaste deja faptul ca analogii SST de tipul octreotidului si lancreotidului au o mare afinitate pentru SSTR2 si SSTR5, o afinitate scazuta pentru SSTR3 si nu prezinta afinitate pentru SSTR1 si SSTR4 [19].

Prin identificarea statusului receptorilor tumorilor neuroendocrine, SRS a dobandit un rol unic in stadializarea clinica a tumorii iar prin demonstrarea in vivo a expresiei receptorilor NET-urilor (mai ales SSTR2 si SSTR5) a devenit principalul criteriu de selectie a pacientilor ce pot beneficia de tratament cu analogi de SST [20].

Identificarea expresiei SSTR in NET-urile gastroenteropancreatice a adus modificari majore in diagnosticul si terapia acestor tumori si a condus la utilizarea analogilor de SST in clinica [11, 15,17]. Acestia reprezinta tratamentul standard al sindromului hipersecretant din NET-urile gastroenteropancreatice, putand fi utilizati si ca agenti antitumorali, avand rol in felul acesta in controlul cresterii tumorale si al cresterii sperantei de viata. Mai mult decat atat, disponibilitatea unor noi analogi radiomarcati a deschis noi perspective in tratamentul acestor tumori [18].

Recenta validare a imunohistochimiei ca o metoda eficienta, reproductibila, sensibila si relativ ieftina de evidentiere a SSTR [13,23,24], ofera noi perspective strategice in managementul NET-urilor si din punct de vedere al costurilor. Astfel, IHC ar putea avea un rol important in selectia pacientilor ce vor raspunde la tratamentul cu analogi de SST si ofera informatii importante privind utilizarea SRS in tratamentul anumitor tipuri de NET-uri.

EVALUAREA IMUNOHISTOCHIMICA A CAZURILOR SELECTATE

In aceasta etapa s-au analizat histopatologic si imunohistochimic 30 cazuri de tumori gastrice cu

diferentiere neuroendocrina , materialul tumoral fiind obtinut fie din analiza fragmentelor biopsice gastrice cu diverse localizari: corporeal, fundica, antrala fie din rezectii chirurgicale : piese de gastrectomii.partiale sau totale.

Materialul tisular a fost fixat in formol 10%, deshidratat ,inclus la parafina, sectionat la 2-3 microni, colorat HE si examinat microscopic.

Criteriile histopatologice de selectie si de gradare au fost cele intalnite si pentru alte tumori neuroendocrine cu diverse localizari: patern organoid de crestere, cromatina nucleara, numar de mitoze, zone de necroza, dimensiunea tumorii.

Cazurile selectate au fost analizate imunohistochimic pentru: cromogranina, synaptofizina, factor de proliferare (ki 67) si receptori de somatostatina: SSTR2 si SSTR5 (Fig. 1.1 – 1.10).

Anticorp Clona Dilutie Sursa

Cromogranina A 5H7 1:200 Leica Sinaptofizina SY38 1:20 Dako Ki 67 MiB1 1:75 Dako SSTR2 UMB1 1:150 ABCAM SSTR5 UMB4 1:150 ABCAM

Intensitatea imunoreactiei pentru SSTR2 si SSTR5 a fost scorificata semicantitativ; intens si difuz

pozitiv(3+), reactie moderata (2+), si slab si focal pozitiva(1+) fiind luata in considerare atat reactia citoplasmatica cat si membranara.

Metoda imunohistochimica utilizata a constat in deparafinare in 3 bai de toluen (3x 10 minute) si hidratare in 2 bai alcool etilic absolut (2x10 minute), 1 baie alcool 70 (1x 10 minute). Pretratarea pentru descoperirea situsurilor


4

antigenice s-a facut prin fierberea lamelor la baia termostatata la 97 °C, in tampoane de fierbere cu pH diferit. A urmat incubarea cu anticorpul primar la temperatura camerei peste noapte. Ulterior, lamele au fost incubate cu sistemul polimer Ac secundar-streptavidina timp de 30 min. Developarea lamelor s-a facut cu DAB 5-10 min, urmata de spalare in apa de robinet si colorare cu HE. REZULTATE In functie de criteriile histopatologice si imunohistochimice, cele 30 cazuri studiate au fost incadrate astfel:

tumori neuroendocrine bine diferentiate - G1 (NET G1) 24 tumori neuroendocrine moderat diferentiate - G2 (NET G2) 2 tumori neuroendocrine slab differentiate - G3 ( NET G3) 3 hiperplazie neuroendocrina gastrica. 1

Expresia la Cromogranina a fost intalnita in 24 cazuri intens si difuz, fiind - pozitiva mai intens in tumorile NET G1, - focal pozitiva intr-un caz de NET G3 si - negativa in 5 cazuri de NET G1 si G3. Sinaptofizina a fost pozitiva in toate cazurile de tumori neuroendocrine gastrice G1 siG2 fiind negative si slab pozitiva in NET G3. Factorul de proliferare a fost exprimat astfel: - 1-10% in tumorile neuroendocrine bine diferentiate G1, - 15% in tumorile neuroendocrine cu grad moderat de diferentiere si - peste 30% in cele slab diferentiate G3. Receptorul de somatostatina SSTR2 a prezentat: - reactie membranara intensa si difuza (3+) in 21 cazuri de NET G1 (87,5%) - reactie moderata (2+) intr-un caz de NET G2 si in 2 cazuri de NET G1 - negativa in cele 3 cazuri de NET G3. In 3 cazuri reactia nu a putut fi cuantificata datorita cantitatii reduse de material tumoral ramas prin resectionare. Spre deosebire de SSTR2 , SSTR5 a prezentat: - o reactie intens si difuza (3+) in 4 cazuri de NET G1, - reactie pozitiv moderat( 2+) in 7 cazuri de NET G1 - negativ in toate cazurile de NET G3 si in 6 cazuri de NET G1 - slab pozitiv(1+) in 6 cazuri de NET G1 si un caz de NET G2. CONCLUZII_IHC Expresia receptorului de somatostatina SSTR2 s-a corelat cu gradul de diferentiere al tumorilor , neuroendocrine, fiind intens pozitiva in cele bine diferentiate, negativa in tumorile slab diferentiate si slab diferentiata in cele moderat diferentiate. SSTR5- s-a corelat cu gradul scazut de diferentiere al tumorilor , fiind negativ in toate cazurile de NET G3, in schimb in tumorile neuroendocrine bine diferentiate a prezentat o reactie variabila, variind intre 3+ si 1+ sau negativa.


5

Fig. 1.1. HE – NET gastric G1 – 4X – caz 170009

Fig. 1.2. HE – Carcinom neuroendocrin gastric – 4x – caz 163306


6

Fig. 1.3. SSTR2 – NEC gastric – 10x – caz 163306

Fig. 1.4. SSTR5 – NEC gastric – 10x – caz 163306


7

Fig. 1.5. KL1 pozitiv – NEC – 10x – caz163306

Fig. 1.6. Cromogranina pozitiva – NEC – 10x – caz163306


8

Fig. 1.7. SSTR2 pozitiv – NET G1 gastric – 10x – caz 161027

Fig. 1.8. SSTR5 pozitiv – NET G1 gastric – 10x – caz 187935


9

Fig. 1.9. SSTR2 pozitiv – NET G2 – 10x – caz 170358

Fig. 1.10. SSTR5 slab pozitiv – NET G2 – 20x – caz 170358


10

ACTIVITATEA III.2 ALCATUIREA SI VERIFICAREA COMBINATIILOR DE PARAMETRI NECESARI PENTRU NOUL KIT DE DIAGNOSTIC, PROGNOSTIC SI MODULARE A TERAPIEI NET

Tumori neuroendocrine (NET) sunt neoplasme epiteliale, care apar în multe organe ale corpului, dar în principal zona gastro-entero-pancreatica și la nivelul arborelui bronsic care sunt supuse unei diferențieri predominant neuroendocrine si care implică producția și secreția de mai multe proteine, hormoni, factori de creștere, neuropeptide, enzime de prelucrare, precum și catecolamine și neurotrasmitatori. Sunt caracterizate prin comportamente diferie de la tumori indolent clinic la carcinoame agresive, slab diferențiate.

NET derivă din celulele neuroendocrine (NE) ce produc hormoni polipeptidici specifici, care caracterizează tipuri de celule unice, precum și proteine comune mai multor tipuri de celule NE. Unele dintre aceste produse, care aparține familiei graninelor, sunt lipsite de o activitate hormonală specifică și sunt considerate ca precursori hormonali, în timp ce altii sunt proteine structurale legate de vezicule.

Kitul de diagnostic, prognostic si modulare a terapiei TNE va include primeri pentru fiecare genă din interst (hormoni, receptori, markeri de proliferare si angiogeneza). Aceste kituri pot fi comandate (custom-made) cu secvențe de 8, 16, 24, 48 sau 96 de gene. Un kit virtual initial a fost conceput special pentru analiza de tumori neuro-endocrine si a inclus a 96 godeuri/gene ce au inclus 90 de gene de interes, 2 gene de referinta, un control pentru contaminarea cu ADN genomic, 2 controale pentru revers transcriere si un control pentru eficienta amplificarii. Lista de gene de interes a inclus hormoni, markeri NE, receptori, markeri de proliferare, de angiogeneza, ai originii, precum și markeri de predictie a raspunsului la tratament [tabelul 1, 2].

Intr-o faza ulterioara numarul de gene a fost redus la 42 [tabel 3]. Scopul acestui studiu este utilizarea de ARN din tesuturi FFPE si pentru a limita și mai mult (până la 18), numărul de gene într-adevăr semnificative pentru definirea diferențierii, a comportamentului agresiv față de un comportament benign și potențialul de sensibilitate la terapie (Annaratone L, Volante M, Asioli S, Rangel N, Bussolati G. Characterization of neuroendocrine tumors of the pancreas by real-time quantitative polymerase chain reaction. A methodological approach. Endocr Pathol. 2013; 24(2):83-91).

Un număr de 24 de gene ar permite asamblarea de kituri de gene personalizate adaptate pentru studiul a 4 cazuri (kitul cuprinde 96 de godeuri) si, prin urmare, costul per test ar fi redus pana la o sumă similară sau mai mica decat cea necesară pentru testarea imuno-histochimica a tumorilor NE.

Au fost selectate gene care au fost exprimate diferentiat in tumorile maligne și benigne, precum si markeri semnificative pentru definirea diferențierii și a raspunsului terapeutic în tumorile NE [tabelul 4].

Aceste gene au fost asamblate în kituri personalizate de catre firma producatoare, care au inclus patru seturi a câte 18 de gene de referință + 2 gene de housekeeping + 4 gene de control, iar aceste kituri au fost testate ulterior folosind ADNc in etapa ulterioara (III.3). Tabelul 1. Proteinele de interes pentru realizarea unui kit de diagnostic, prognostic si modulare a terapiei NET.

Hormoni Insulina, Glucagon, Gastrina, Somatostatina, Calcitonina, PTH , PTH2, ACTH/MSH, Hormoni de crestere (1,2), Prolactina, FSH 8A,B9, TSH, Inhibina A, LH, LH-RH, Oxitocina, Vasopresina, VIP, Motilina, Grelina, GH-RH, IGF 1, IGF2, PP, PRLH, CRH.

Markeri neuroendocrine Cromogranina A,B,C, CEA, PDGFA, O-6-metilguanina-DNA metiltransferaza, PGP 9.5, Sinaptofizina, S100, Melan A, CD117, Vimentina, CK-20, ASCL1,DBH.

Receptori Somatostatina 1-5 (SSTR 1-5), ER, PgR, EGFR,VEGFR, TSHR. Markeri de proliferare

Ki67, PCNA, BCL2, CCNA1, CCND1, CCND2, CCNE1, CDKN2A, CDKN1C, CDKN2A, JUN, MYC, PTEN, RASSF1, RB1, SFN, TP53.

Markeri de angiogeneza

CDH13, CTNNB1, EGF, ERBB2, ID1, IL6, NOTCH1, PLAU, SERPINE 1, SLIT2, THBS1, VEGF (A,B).

Markeri ai originii TTF1, CK19 Markerii raspunsului la rapamicina

mTOR, RET


11

Tabel 2. Genele corespondente proteinelor de interes pentru realizarea unui kit de diagnostic, prognostic si modulare a terapiei NET

96-Well Custom PCR Array Template Proteina

# Gene Symbol Gene RefSeq #

1 INS NM_000207 insulin

2 GCG NM_002054 glucagon/GLP

3 GAST NM_000805 gastrin

4 SST NM_001048 somatostatin

5 CHGA NM_001275 chromogranin a

6 CHGB NM_001819 chromogranin b

7 SCG2 NM_003469 chromogranin c

8 CALCA NM_001741 calcitonin

9 PTH NM_000315 parathyroid Hormone

10 PTH2 NM_178449 parathyroid Hormone 2

11 POMC NM_000939 acth, msh

12 gh1 NM_000515 Gh 1

13 gh2 NM_022557 Gh 2

14 PRL NM_000948 prolactin

15 CGA NM_000735 FSHA

16 fshB NM_000510 FSHB

17 tshB NM_000549 TSH

18 CEACAM1 NM_001712 CEA

19 PDGFA NM_002607 PDGFA

20 MGMT NM_002412 O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

21 mTOR NM_004958 mTOR

22 ASCL1 NM_004316 ASCL1

23 DBH NM_000787 DBH

24 INHBA NM_002192 inhibin A

25 LHB NM_000894 LH

26 GNRH1 NM_000825 LH-RH

27 uchl1 NM_004181 PGP9.5

28 PRLH NM_015893 PRF

29 RET NM_020630 RET

30 SYP NM_003179 Synapthophysin

31 TTF1 NM_007344 TTF1

32 OXT NM_000915 Oxytocin

33 AVP NM_000490 Vasopressin

34 crh NM_000756 CRH

35 vip NM_003381 VIP

36 MLN NM_002418 Motilin

37 GHRL NM_016362 Ghrelin

38 GHRH NM_021081 GH-RH

39 IGF1 NM_000618 IGF1


12

40 IGF2 NM_000612 IGF 2

41 PPY NM_002722 PP

42 S100A1 NM_006271 S-100

43 MLANA NM_005511 Melan A

44 KIT NM_000222 CD117

45 VIM NM_003380 Vimentin

46 KRT20 NM_019010 CK-20

47 MKI67 NM_002417 Ki67

48 PCNA NM_182649 PCNA

49 SSTR1 NM_001049 Somatostatin 1





54 ESR1 NM_000125 ER

55 PGR NM_000926 PgR

56 EGFR NM_005228 EGFR

57 FLT1 NM_002019 VEGFR1

58 TSHR NM_000369 TSHR

59 APC NM_000038 APC

60 BCL2 NM_000633 BCL2

61 CCNA1 NM_003914 CCNA1

62 CCND1 NM_053056 CCND1


64 CCNE1 NM_001238 CCNE1

65 CDK2 NM_001798 CDK2

66 CDKN1A NM_000389 CDKN1A

67 CDKN1C NM_000076 CDKN1C


69 JUN NM_002228 JUN

70 MYC NM_002467 MYC

71 PTEN NM_000314 PTEN

72 RASSF1 NM_007182 RASSF1

73 RB1 NM_000321 RB1

74 SFn NM_006142 SFn

75 TP53 NM_000546 TP53

76 VEGFA NM_003376 VEGF

77 VEGFB NM_003377 VEGF

78 KRT19 NM_002276 CK19

79 TP63 NM_003722 TP63

80 CDH13 NM_001257 CDH13

81 CTNNB1 NM_001904 CTNNB1

82 EGF NM_001963 EGF


13

83 ERBB2 NM_004448 ERBB2

84 ID1 NM_002165 ID1

85 IL6 NM_000600 IL6

86 NOTCH1 NM_017617 NOTCH1

87 PLAU NM_002658 PLAU

88 SERPINE 1 NM_000602 SERPINE 1

89 SLIT2 NM_004787 SLIT2

90 THBS1 NM_003246 THBS1

91 GAPDH NM_002046 Housekeeping Gene

92 ACTB NM_001101 Housekeeping Gene

93 HGDC SA_00105 Genomic DNA Control

94 RTC SA_00104 Reverse Transcription Control

95 PPC SA_00103 Positive PCR Control


Tabel 3. Genele corespondente proteinelor de interes pentru realizarea unui kit de diagnostic, prognostic si modulare a terapiei NET.

42-Well Custom PCR Array Template Proteina

# Gene Symbol Gene RefSeq #

1 INS NM_000207 insulin

2 GCG NM_002054 glucagon/GLP

3 GAST NM_000805 gastrin

4 SST NM_001048 somatostatin

5 CHGA NM_001275 chromogranin a

6 CHGB NM_001819 chromogranin b

7 CEACAM1 NM_001712 CEA

8 PDGFA NM_002607 PDGFA

9 MGMT NM_002412 O-6-methylguanine-DNA methyltransferase

10 mTOR NM_004958 mTOR

11 INHBA NM_002192 inhibin A

12 uchl1 NM_004181 PGP9.5

13 SYP NM_003179 Synapthophysin

14 TTF1 NM_007344 TTF1

15 vip NM_003381 VIP

16 IGF1 NM_000618 IGF1

17 PPY NM_002722 PP




21 GRPR NM_005314 Gastrin-Releasing Peptide Recepto

22 EGFR NM_005228 EGFR

23 FLT1 NM_002019 VEGFR1

24 PCNA NM_182649 PCNA


14

25 APC NM_000038 APC



28 CDK2 NM_001798 CDK2


30 JUN NM_002228 JUN

31 PTEN NM_000314 PTEN

32 RB1 NM_000321 RB1

33 TP53 NM_000546 TP53

34 VEGFA NM_003376 VEGF

35 VEGFB NM_003377 VEGF

36 KRT19 NM_002276 CK19

37 CTNNB1 NM_001904 CTNNB1

38 ID1 NM_002165 ID1

39 IL6 NM_000600 IL6

40 PLAU NM_002658 PLAU

41 SERPINE 1 NM_000602 SERPINE 1

42 SLIT2 NM_004787 SLIT2

43 GAPDH NM_002046 Housekeeping Gene

44 ACTB NM_001101 Housekeeping Gene

45 HGDC SA_00105 Genomic DNA Control

46 RTC SA_00104 Reverse Transcription Control



Tabel 4. Configuratia placii de PCR array pentru testarea simultana a 4 cazuri de NET

INS 1

SSTR3 9

CDH13 17

INS 1

SSTR3 9

CDH13 17

INS 1

SSTR3 9

CDH13 17

INS 1

SSTR3 9

CDH13 17

GAST 2

SSTR5 10

SLIT2 18

GAST 2

SSTR5 10

SLIT2 18

GAST 2

SSTR5 10

SLIT2 18

GAST 2

SSTR5 10

SLIT2 18

PPY 3

GRPR 11

ACTB 19

PPY 3

GRPR 11

ACTB 19

PPY 3

GRPR 11

ACTB 19

PPY 3

GRPR 11

ACTB 19

CHGA 4

MTOR 12

GAPDH 20

CHGA 4

MTOR 12

GAPDH 20

CHGA 4

MTOR 12

GAPDH 20

CHGA 4

MTOR 12

GAPDH 20

SYP 5

MGMT 13

HGDC 21

SYP 5

MGMT 13

HGDC 21

SYP 5

MGMT 13

HGDC 21

SYP 5

MGMT 13

HGDC 21

VGF 6

TYMS 14

RTC 22

VGF 6

TYMS 14

RTC 22

VGF 6

TYMS 14

RTC 22

VGF 6

TYMS 14

RTC 22

SSTR1 7

MKI67 15

RTC 23

SSTR1 7

MKI67 15

RTC 23

SSTR1 7

MKI67 15

RTC 23

SSTR1 7

MKI67 15

RTC 23

SSTR2 8

CCND1 16

PPC 24

SSTR2 8

CCND1 16

PPC 24

SSTR2 8

CCND1 16

PPC 24

SSTR2 8

CCND1 16

PPC 24


15

ACTIVITATEA III.3 VERIFICAREA FUNCTIONARII SI REPRODUCTIBILITATII REZULTATELOR OBTINUTE CU VARIANTE AL KIT-ULUI DE DIAGNOSTIC, PROGNOSTIC SI MODULAREA TERAPIEI PRIN APLICARE PE LOTURILE DE TUMORI SELECTATE COMPARATIV CU LOTURI MARTOR. COMUNICARI STIINTIFICE REZULTATE PARTIALE.

Tehnicile de RT-qPCR se utilizeaza din ce in ce mai mult in evaluarea profilului expresiilor diferitelor gene

implicate in angiogeneza, proliferare si terapia tumorala. In practica curenta a laboratorului de anatomie patologica, se utilizeaza fragmente tumorale fixate in formol si incluse in parafina. ARN-ul izolat din fragmentele incluse la parafină poate fi dificil de utilizat în reactiile de amplificare datorită formarii legaturilor de tip cross-link intre acizii nucleici si proteine precum si datorita fragmentarii și degradarii ARN. Din aceste considerente ne-am propus ca in aceasta etapa de verificare a kit-ului experimentele sa se realizeze pe fragmente de tesut fixate in RNA later si congelate. Genele de interes studiate au fost: INS, GAST, PPY, CHGA, SYP, VGF, SSTR1, SSTR2, SSTR3, SSTR5, GRPR, MTOR, MGMT, TS, Ki67, Cyclin D1, CDH13, SLIT2. S-au identificat niveluri de expresie genica relativa prin comparare tesut tumoral versus tesut peritumoral.

Izolarea ARN total din tesuturi congelate cu ajutorul RNeasy mini Kit (Qiagen).

Izolarea si purificarea ARN total s-a realizat din tesuturi tumorale si peritumorale, prezervate in prealabil in RNAlater (Qiagen) timp de 24 ore, dupa care au fost stocate la -80oC pana la efectuarea extractiei. Principiul metodei consta in izolarea moleculelor de ARN din lizatul celular (obtinut prin omogenizare in tampon de liza), fixarea acestora pe membrane de siliciu in prezenta unor concentratii ridicate de izotiocianat de guanidina si etanol si purificarea acestuie cu tampoane de spalare speciale existente in kit-ul de extractie. ADN-ul genomic contaminant este indepartat prin digestiet cu DN-aza, apoi ARN-ul total este spalat si purificat cu tampoane de spalare si eluat cu apa fara nucleaze.

Protocolul de lucru (in acord cu recomandarile producatorului): circa 10 - 30 mg de tesut congelat, conservat in RNAlater sunt lizate si omogenizate in tampon RLT (la care s-a adaugat in prealabil beta-mercaptoetanol) cu ajutorul dispozitivului TissueRuptor-Qiagen intr-un tub steril tip Eppendorf urmat de centrifugare pentru indepartarea debriurilor. ARN-ul prezent in supernatant va fi precipitat cu etanol absolut si fixat in membrana de siliciu a colonitelor de extractie prin centrifugare. Pentru indepartarea ADN-ului (precipitat si el cu ajutorul etanolului) se realizeaza un tratament cu DN-aza. Dupa 2 spalari succesive cu tampoane de spalare a moleculelor de ARN adsorbite in membrana, acestea vor fi eluate din membrana in apa pura fara Rnaze, prin centrifugare. Verificarea calitatii, puritatii si concentratiei extractelor de ARN

Verificarea calitatii, puritatii si concentratiei extractelor de ARN total a fost realizata prin analiza spectrofotometrica in UV (in lumina ultravioleta) cu ajutorul Spectrofotometrul tip NanoDrop ACTGene ASP-3700 (ACTGene)

Determinarea concentratiei de ARN se realizeaza pe baza valorilor absorbantelor masurate la lungimea de unda de 260 nm. O valoare de o unitate la 260 nm corespunde unei concentratii de ARN de 40 µg/ml. Obţinerea ADNc

Din ARN-ul total a fost obţinut ADNc folosindu-se trusa de revers-transcriere RT2 First Strand kit, optimizat pentru studiul expresiei genice prin PCR Array. Premergator reactiei de revers transcriere, trusa include un pas suplimentar de eliminare a posibililor contaminanti cu ADN genomic, contaminanti care scad specificitatea reactiilor ulterioare. Trusa contine de asemenea, primeri pentru obtinerea ARN extern de control, util in monitorizarea reactiilor de revers-transcrire si a reactiilor de amplificare. Astfel, in urma reactiei de revers-transcriere se obtine ADNc din proba precum si ARN extern de control. ADNc obţinut se stocheaza la -20°C până la efectuarea reacţiei de amplificare.


16

RT-qPCR Experimentul de real time PCR a respectat manualul producatorului - User Manual of RT2 Profiler PCR Array

system (SABioscience), utilizand SYBR Green/ROX PCR Master Mix in aparatul Stratagene, identificandu-se niveluri de expresie relativa prin comparare tesut tumoral cu tesut peritumoral.

Intr-o placa de testare cu 96 godeuri pot fi studiate 4 cazuri. Pentru fiecare caz, pe langa cele 18 perechi de primeri pentru genele de interes au fost inclusi primeri pentru 2 gene de referinta (ACTB si GAPDH), precum si primeri pentru controlul contaminarii cu ADN genomic strain (HGDC), primeri pentru controlul revers-trancrierii (RTC) si primeri pentru controlul eficientei reactiei de amplificare (PPC).

După realizarea amplificarii este necesară realizarea curbei de disociere. Existenta unei curbe cu mai multe varfuri denotă existenta produsilor de amplificare nespecifici si deci, godeurile în care se constată existenta produsilor nespecifici vor fi excluse din analiza.

Analiza rezultatelor. Controlul de calitate. - Orice valoare a CT ≥ 35 se considera lipsa a amplificării - Controlul de contaminare cu ADN genomic (GDC) trebuie sa prezinte CT ≥ 35. La o valoare CT ≤ 35

contaminarea este evidenta iar experimentul se repeta. - Controlul performantei amplificarii (PPC) trebuie sa prezinte valoarea CT = 20 ± 2. - Controlul reactiei de revers-transcriere (RTC). Se realizează calculand diferenta dintre media CT a

RTC si media CT a PPC. Aceasta valoare trebuie sa fie ≤ 5. Calculul nivelului de expresie genica relativa se realizează prin compararea valorii CT a unei gene de interes

(GI) in anumite conditii cu valoarea CT a aceleeași gene in conditii de referintă, in cazul nostru tesut tumoral versus tesut peritumoral sau tesut tumoral versus media mai multor probe de tesut normal.

Calculul se realizeaza utilizand softuri dedicate puse la dispozitie de către firmele producatoare ale reactivilor utilizati. Calculul manual este mai dificil de realizat, mai ales dacă se doreste calcularea valorii fold change. In primul rand se realizează normalizarea valorilor CT prin intermediul genelor de referință (GR), utilizandu-se formula:

ΔCT = CTGI - CTGR

Dupa normalizare, se calculează ΔΔCT pentru identificarea expresiei genice relative:

ΔΔCT = ΔCT (probă) - ΔCT (control)

Valoarea fold change a fiecărei GI comparativ cu aceeasi genă din grupul control este dată de valoarea lui 2(-ΔΔCT). Supraexpresia este data de catre o valoare supraunitară, în timp ce o valoare subunitară indică subexpresie genică. In practica, fiind vorba de fenomene biologice, se preferă utilizarea expresiei fold regulation care se exprima prin valori pozitive sau negative, valoarea lui 2(-ΔΔCT) ramânând aceeași pentru genele supraexprimate in timp ce pentru genele subexprimate devine (-2(ΔΔCT)). REZULTATE

Probe biologice. Pentru aceasta activitate au fost studiate doua cazuri de tumori pulmonare: - un carcinom microcelular - un carcinom slab diferentiat Pentru fiecare caz s-a recoltat tesut tumoral si tesut peritumoral prezervate prin fixare in RNA later si

congelare. S-a extras si purificat ARN total, calitatea si cantitatea acestuia verificandu-se prin spectrofotometrie (fig. 2.1).

Dupa extractie, ARN-ul cu caracteristici corespunzatoare cerintelor testului a fost supus reactiei de revers-transcriere dupa care ADNc a fost verificat spectrofotometric (fig. 2.2).


17

Etapa de real-time PCR a respectat manualul producatorului - User Manual of RT2 Profiler PCR Array system (SABioscience), utilizand SYBR Green/ROX PCR Master Mix in aparatul Stratagene Mx3005. S-a trasat valoarea prag (fig. 2.3) și s-au analizat curbele de disociere (topire) (fig. 2.4).

a. b. Fig. 2.1. Verificare spectrofotometrică a cantității și a calității extractelor de ARN, ARN tumoral (a.) si ARN peritumoral (b.) Raportul absorbanțelor A260/A280 de 2.01 sau 1.95, precum și A260/A230 de 2.19 sau 2.28 demonstreaza puritatea extractului ARN, fără contaminați proteici sau chimici

a. b. Fig. 2.2. Verificare spectrofotometrică a cantității și a calității extractelor de ADNc, ADNc tumoral (a.) si ADNc peritumoral (b.) Raportul absorbanțelor A260/A280 de 1.62 sau 1.61, precum și A260/A230 de 2.18 sau 2.14 demonstreaza puritatea extractului ARN, fără contaminați proteici sau chimici

a. b. Fig. 2.3. Curbele liniare (a) și logaritmice (b) de amplificare ale produșilor PCR cu stabilirea valorii prag.


18

Fig. 2.4. Curbele de disociere a produsilor PCR. Nu s-a observat existenta curbelor multivârf.

Valorile CT obtinute pentru controalele testului au fost verificate pentru validare.

Pentru controalele de contaminare cu ADN genomic s-au obtinut valori optime ale CT, (35,14 – 40,06). Pentru controlul performanței amplificării (PPC) valorile CT au fost 18,59 – 18,77 . Controlul reacției de revers-transcriere (RTC). Diferența dintre media CT a RTC si media CT a PPC a fost ≤ 5.

Rezultatele sunt redate sub formă de hărţi calorice sau grafice de tip scatter plot. Pentru compararea expresiilor normalizate ale fiecărei gene de pe array in graficul de tip scatter plot, linia centrala indica expresie genica nemodificată, genele dispuse superior acestei linii fiind supraexprimate, iar cele situate inferior subexprimate (fig. 2.5).

Fig. 2.5. Scatter plot logaritmic al genelor, tesut tumoral versus tesut peritumoral (stanga – carcinom microcelular, dreapata – carcinom slab diferentiat).


19

Tabelul 5. Detalierea rezultatelor experimentale (genele supraexprimate sunt colorate in rosu, cele subexprimate in albastru).

GENA FOLD CHANGE CARCINOM MICROCELULAR

FOLD CHANGE CARCINOM SLAB DIFERENTIAT

GAST 724,08 195,36 PPY 724,08 -5,24 INS 362,04 -2,62

SSTR1 362,04 -41,93 CHGA 181,02 -5,24 STTR5 181,02 -2,62 SSTR3 45,25 -2,62

VGF 45,25 48,84 TYMS 22,63 6,11 MKI67 22,63 12,21 SSTR2 11,31 1 CDH13 5,66 -5,24

SYP 5,66 -5,24 SLIT2 2,83 -20,97 MTOR 2,83 1 MGMT 2,83 -2,62 GRPR -5,66 3,05

CCND1 1 -2,62 In cazul carcinomului microcelular, din cele 18 gene studiate, 16 au fost supraexprimate, o gena a fost

subexprimata (GRPR) si o gena a prezentat expresie nemodificata (CCND1). Pentru carcinomul pulmonar slab diferentiat 5 gene au fost supraexprimate (GAST, VGF, MKI67, TYMS, GRPR), 2 gene au prezentat expresie nemodificata (SSTR2 si MTOR), restul de 11 gene fiind subexprimate.

Rezultatele experimentale obtinute in aceasta etapa releva urmatoarele aspecte:

1. In cazul carcinomului pulmonar microcelular, - 10 gene sunt puternic supraexprimate avand fold change >22,63 - 3 gene sunt supraexprimate moderat, valoarea fold change este 5,66 – 11.31 - 3 gene sunt slab supraexprimate, valoarea fold change este 2.83 - O singura gena este subexprimata, valoarea fold change este (-5,66)

2. In cazul carcinomului pulmonar slab diferentiat - 2 gene sunt puternic supraexprimate avand fold change >48,84 - 3 gene sunt supraexprimate moderat, valoarea fold change este 6,11 – 12,21 - O singura gena este slab supraexprimata, valoarea fold change este 3,05 - 11 gene sunt subexprimate, valoarea fold change este (-2,62) – (-41,93)

CONCLUZII

1. Rezultatele obtinute sunt clare, pot fi interpretate si corelate cu testele de imunohistochimie. 2. Kit-ul de diagnostic este functional si poate fi aplicat pentru studiul loturilor de tumori selectate comparativ

cu loturile martor. 3. Studiul se va extinde si la tesuturile tumorale fixate in formol si incluse in parafina. 4. Rezultatele obtinute in cazul ambelor metode de prezervare a tesuturilor vor fi comparate in vederea

stabilirii unei metode optime de stabilire a diagnosticului, prognosticului si monitorizarea terapiei NET.


20

BIBLIOGRAFIE

1. Yao JC, Hassan M, Phan A et al. One hundred years after "carcinoid":epidemiology of and prognostic factors for

neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States. J Clin Oncol; 26: 3063–3072. 2008

2. Rindi G, Arnold R, Bosman FT et al. Nomenclature and classification of neuroendocrine neoplasms of the digestive

system. In Bosman FT, Hruban RH, Theise ND (eds), WHO Classification of Tumours of the Digestive System. Lyon:

IARC; 13–14. 2010

3. Ramage J.K., Davies AHG, Ardill J., Guidelines for the management of gastroenteropancreatic neuroendocrine (including

carcinoid) tumours, Gut 54: 1-16, 2005

4. Shebani KO, Souba WW, Finkelstein DM., Prognosis and survival in patients with gastrointestinal tract carcinoid tumors.

Ann. Surg. 229: 815-21,1999

5. Van Gompel JJ, Sippel RS, Warner TF, Chen H. Gastrointestinal carcinoid tumors: factors that predict outcome.

World J Surg. ;28(4):387-92. 2004

6. Li TT, Qiu F, Qian ZR, Wan J, Qi XK, Wu BY. Classification, clinicopathologic features and treatment of gastric

neuroendocrine tumors. World J Gastroenterol. ;20(1):118-25. 2014

7. Yamada Y, Post SR, Wang K, Tager HS, Bell GI, Seino S: Cloning and functional characterization of a family of

human and mouse somatostatin receptors expressed in brain, gastrointestinal tract, and kidney. Proc Natl Acad Sci,

89: 251-255, 1992.

8. Yamada Y, Reisine T, Law SF, Ihara Y, Kubota A, Kagimoto S, Seino M, Seino Y, Bell GI, Seino S: Somatostatin

receptors, an expanding gene family: cloning and functional characterization of human SSTR3, a protein coupled to

adenylyl cyclase. Mol Endocrinol, 6: 2136-2142, 1992.

9. Yamada Y, Kagimoto S, Kubota A, Yasuda K, Masuda K, Someya Y, Ihara Y, Li Q, Imura H, Seino S, Seino Y:

Cloning, functional expression and pharmacological characterization of a fourth (hSSTR4) and a fifth (hSSTR5)

human somatostatin receptor subtype. Biochem Biophys Res Commun, 195: 844-852, 1993.

10. Papotti M, Bongiovanni M, Volante M, Allìa E, Landolfi S, Helboe L, Schindler M, Cole S, Bussolati G: Expression of

somatostatin receptor types 1-5 in 81 cases of gastrointestinal and pancreatic endocrine tumors. Virchows Arch, 440:

461-475, 2002.

11. Kubota A, Yamada Y, Kagimoto S, Shimatsu A, Imamura M, Tsuda K, Imura H, Seino S, Seino Y: Identification of

somatostatin receptor subtypes and an implication for the efficacy of somatostatin analogue SMS 201-995 in

treatment of human endocrine tumors. J Clin Invest, 93: 1321-1325, 1994.

12. Janson ET, Gobl A, Kälkner KM, Oberg K: A comparison between the efficacy of somatostatin receptor scintigraphy

and that of in situ hybridization for somatostatin receptor subtype 2 messenger RNA to predict therapeutic outcome

in carcinoid patients. Cancer Res, 56: 2561-2565, 1996.

13. Janson ET, Stridsberg M, Gobl A, Westlin JE, Oberg K: Determination of somatostatin receptor subtype 2 in

carcinoid tumors by immunohistochemical investigation with somatostatin receptor subtype 2 antibodies. Cancer

Res, 58: 2375-2378, 1998.


21

14. John M, Meyerhof W, Richter D, Waser B, Schaer JC, Scherübl H, Boese-Landgraf J, Neuhaus P, Ziske C, Mölling

K, Riecken EO, Reubi JC, Wiedenmann B: Positive somatostatin receptor scintigraphy correlates with the presence

of somatostatin receptor subtype 2. Gut, 38: 33-39, 1996

15. Lamberts SWJ, Krenning EP, Reubi JC : The role of somatostatin and its analogs in the diagnosis and treatment of

tumors. Endocr Rev, 12: 450-482, 1991.

16. Hofland LJ, Lamberts SW, van Hagen PM, Reubi JC, Schaeffer J, Waaijers M, van Koetsveld PM, Srinivasan A,

Krenning EP, Breeman WA: Crucial role for somatostatin receptor subtype 2 in determining the uptake of [111In-

DTPA-D-Phe1] octreotide in somatostatin receptor-positive organs. J Nucl Med, 44: 1315-1321, 2003

17. Oberg K, Kvols L, Caplin M, Delle Fave G, de Herder W, Rindi G, Ruszniewski P, Woltering EA, Wiedenmann B:

Consensus report on the use of somatostatin analogs for the management of neuroendocrine tumors of the

gastroenteropancreatic system. Ann Oncol, 15: 966-973, 2004.

18. Van Essen M, Krenning EP, De Jong M, Valkema R, Kwekkeboom DJ: Peptide receptor radionuclide therapy with

radiolabelled somatostatin analogues in patients with somatostatin receptor positive tumours. Acta Oncol, 46: 723-

734, 2007.

19. Reubi JC, Schär JC, Waser B, Wenger S, Heppeler A, Schmitt JS, Mäcke HR: Affinity profiles for human

somatostatin receptor subtypes SST1-SST5 of somatostatin radiotracers selected for scintigraphic and

radiotherapeutic use. Eur J Nucl Med, 27: 273-282, 2000.

20. Janson ET, Westlin JE, Eriksson B, Ahlström H, Nilsson S, Oberg K: [111In-DTPA-D-Phe1] octreotide scintigraphy in

patients with carcinoid tumours: the predictive value for somatostatin analogue treatment. Eur J Endocr, 131: 577-

581, 1994.

21. Chiti A, Briganti V, Fanti S, Monetti N, Masi R, Bombardieri E: Results and potential of somatostatin receptor imaging

in gastroenteropancreatic tract tumours. Q J Nucl Med, 44: 42-49, 2000.

22. Lebtahi R, Cadiot G, Sarda L, Daou D, Faraggi M, Petegnief Y, Mignon M, le Guludec D: Clinical impact of

somatostatin receptor scintigraphy in the management of patients with neuroendocrine gastroenteropancreatic

tumors. J Nucl Med, 38: 853-858, 1997.

23. Kulaksiz H, Eissele R, Rössler D, Schulz S, Höllt V, Cetin Y, Arnold R: Identification of somatostatin receptor

subtypes 1, 2A, 3, and 5 in neuroendocrine tumours with subtype specific antibodies. Gut, 50: 52-60, 2002.

24. Asnacios A, Courbon F, Rochaix P, Bauvin E, Cances-Lauwers V, Susini C, Schulz S, Boneu A, Guimbaud R,

Buscail L: Indium-111-pentetreotide scintigraphy and somatostatin receptor subtype 2 expression: new prognostic

factors for malignant well-differentiated endocrine tumors. J Clin Oncol, 26: 963-970, 2008.

Director Proiect Dr. Mihaela Gherghiceanu

ETAPA III OPTIMIZAREA NOULUI DISPOZITIV DE …ivb.ro/cercetare/proiecte/parteneriate/RENET_RAPORT 3...

Documents

Transcript of ETAPA III OPTIMIZAREA NOULUI DISPOZITIV DE …ivb.ro/cercetare/proiecte/parteneriate/RENET_RAPORT 3...