Proiect 42-124/2008:ANALIZA MOLECULARA A PROTEINELOR IMPLICATE IN PRINCIPALELE TIPURI DE NEUROPATII PERIFERICE CU COMPONENTA DEMIELINIZANTA – NPD

Program: Parteneriate in Domeniile Prioritare

Domeniul: 4 – Sanatate

Autoritatea contractanta: Centrul National de Management Programe (CNMP)

Durata: 2008-2011

Bugetul proiectului: 2.000.000 lei (de la Bugetul de stat)

Coordonator: Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in Domeniul Patologiei si Stiintelor Biomedicale “Victor Babes”

Splaiul Independentei 99-101, Sector 5,050096 Bucuresti, ROMANIATel. +40-21-319.27.32; 319.45.28; 319.45.30; 319.27.34; Fax.: +40-21-319.45.28; 319.27.34; E-mail: info@vbabes.ro

Director de Proiect: Dr. Bogdan Ovidiu POPESCU, CS I, Sectia Biologie, Laboratorul de Medicina Moleculara, INCD Victor BabesTel.: 021-319.4528, e-mail: bogdan_ovidiu_popescu@yahoo.com ; bogdan.popescu@ivb.ro

Parteneri:P1 – Universitatea din Bucuresti, Departamentul de Biochimie – BCUM-BM - Dr. Gisela Gaina, CS IIP2 - Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti - Prof. Dr. Ovidiu Alexandru Bajenaru

Rezumatul proiectului:

Neuropatiile periferice sunt boli ale sistemului nervos periferic, cu manifestari dureroase, stresante,

invalidante si uneori fatale. Diagnosticul este de multe ori dificil de pus, iar terapiile efective sunt limitate.

Avand in vedere complexitatea patologiei neuropatiilor periferice si greutatii diagnosticarii lor, ne

propunem sa abordam noi metode de investigare si anume cele moleculare, pe langa cele clasice. Dorim

ca analiza genetica a mutatiilor aparute la nivelul genelor unor proteine implicate major in mentinerea tecii

MINISTERUL SANATATII

INSTITUTUL NATIONAL DE CERCETARE-DEZVOLTARE IN DOMENIUL PATOLOGIEI

SI STIINTELOR BIOMEDICALE

“VICTOR BABES”

de mielina in stare de functionare sa aduca date noi atat din punct de vedere diagnostic, cat si din punct de

vedere stiintific. De asemenea ne propunem sa studiem interactiunile care apar intre aceste proteine in

stare normala si patologica, studiile de pana acum privind partial aceasta problema. Un aspect important

va fi corelarea dintre modificarile genotipice si manifestarile fenotipice, respectiv expresia proteinelor

investigate in diferite forme de neuropatii periferice cu componenta demielinizanta.

Deoarece celulele Schwann sunt o componenta atat de importanta a nervului periferic, pentru ca

sunt de cele mai multe ori afectate in mod primar in neuropatiile periferice si pentru ca prin rolul protectiv

asupra axonului sunt si primele care reactioneaza in procesul de regenerare si reparare a nervului, ne-am

gandit sa abordam in studiul nostru principalele proteine schwannice implicate in formele ereditare si

inflamatorii de neuropatii periferice demielinizante: proteina mielinica periferica 22 (PMP22), proteina

mielinica zero (MPZ sau P0), Conexina 32 (Cx32), factorul transcriptional reglare a cresterii

timpurii (Egr2), periaxina (PRX). Fiecare din aceste proteine este esentiala pentru o mielinizare

normala, dar si in relatia stransa dinte axon si celula Schwann. Expresia lor este posibil sa fie modificata

secundar si in neuropatiile periferice axonale sau in formele intermediare, lucru pe care ne propunem sa-l

verificam in proiectul de fata, in afara de diagnosticul de certitudine pe care-l putem oferi in cazul

neuropatiilor in care aceste proteine sunt modificate primar.

O situatie de exceptie o are proteina numita eritropoietina (Epo), care nu este implicata in

producerea unor procese patologice, dar este implicata in procese reparatorii. Vom urmari expresia acestei

proteine in nervul periferic sanatos si in conditii patologice. Scopul acestui proiect este acela de a gasi noi

metode de diagnostic molecular al neuropatiilor periferice si de a aprofunda aspecte ale modul de

interactiune a proteinelor gliale din sistemul nervos periferic pentru a intelege modul de aparitie a

modificarilor patologice la acest nivel si posibilitatea de remielinizare a bervului periferic de catre celulele

Schwann.

Ca urmare a acestui studiu se vor obtine rezultate valoroase care sa duca la elaborarea unui

diagnostic precis in cadrul unui grup complex de neuropatii periferice, in care metodele clasice de

investigatie a nervului periferic, clinice si paraclinice, nu pot aduce date certe cu privire la cauza

declansarii maladiei. In acest context credem ca proiectul nostru va clarifica cel putin unele aspecte

privind implicarea celulei Schwann in procesele patologice de degenerescenta, dar mai ales de regenerare

a nervului periferic in diferite neuropatii periferice. In afara de rezultatele cu aplicabilitate practica,

scontam pe rezultate stiintifice care sa imbogateasca baza de date privind interactiunile care se stabilesc

intre proteinele schwannice pentru o buna functionare a celulei.

Obiectivele generale si specifice ale proiectului:Obiectivele generale ale proiectului sunt: determinarea expresiei fenotipice si genotipice a principalelor

proteine ale celulelor Schwann in neuropatiile periferice cu componenta demielinizanta in scopul stiintific

de a afla conexiunile dintre ele in celula aflata in stare normala si patologica si in scop medical, pentru a

putea imbunatati diagnosticul dificil al bolnavilor cu neuropatii periferice. Studiile ne vor ajuta la

stabilirea unor directii de abordari terapeutice viitoare.

Obiectivele s tiintifice specifice ale proiectului sunt:

1. Stabilirea unui model experimental de studiere moleculara a proteinelor schwannice. Avand in vedere

complexitatea proiectului, se vor stabili principalele etape de studiu a neuropatiilor periferice cu

componenta demielinizanta; se vor stabili conditiile de prelevare a probelor biologice, respectand

legislatia romaneasca si cea europeana in legatura cu aspectele de bioetica; se vor repartiza sarcinile de

lucru ale partenerilor consortiului; se vor stabili tipurile de investigatii clinice si paraclinice (viteze de

conducere, EMG, anatomie patologica) care se vor face.

2. Investigatii antomopatologice ale biopsiilor de nerv si muschi. Date directe despre nerv: pe biopsia de

nerv periferic, privind modifcarile patologice ale nervului periferic senzitiv (nu poate fi biopsiat un nerv

motor, nervul care se biopsiaza este un nerv senzitiv, nervul sural, superficial si care nu provoaca decat

minime pierderi temporare ale sensibilitatii pe partea laterala a labei piciorului). Date indirecte despre

nervul motor sunt date de biopsia musculara, care se ia odata cu biopsia de nerv. Se vor face de asemenea

studii de morfometrie pentru a vedea numarul si densitatea pe unitate de suprafata a fibrelor mielinice. De

asemenea se va urmari situatia tecii de mielina pe fibre nervoase disociate (demielinizare segmentala,

remielinizare, teaca normala).

3. Introducerea tehnicii de imunohistochimie cu markeri fluorescenti, in vederea stabilirii expresiei

fenotipice a proteinelor luate in studiu, pe sectiuni de nerv periferic. In afara de proteinele structurale ale

celulei Schwann, se va investiga si prezenta eritropoietinei la nivelul tecii de mielina degradate.

4. Introducerea tehnicii Western blotting pentru identificarea expresiei calitative si cantitative a

proteinelor investigate. Este important sa urmarim prezenta (normala sau partiala) a proteinelor investigate

mai ales in cazul in care imunohistochimia nu este concludenta.

5. Introducerea tehnicii MLPA in vederea analizei mutationale la nivelul genelor unora din proteinele

investigate. Vom face analiza genica prin MLPA a proteinelor la care se gasesc kit-uri comerciale.

6. Validarea modelului experimental propus. Dupa ce toate metodele de investigare clinica si paraclinica

a pacientilor, ca si metodele de analiza moleculara a proteinelor implicate in producerea de neuropatii

periferice cu componenta demielinizanta au fost folosite, se va face o cuantificare a modelului de

investigare complexa propus. Astfel se va putea implementa acest model in diagnosticul neuropatiilor

periferice la nivelul clinicilor de neurologie si la nivelul laboratoarelor de anatomie patologica din spitale

sau centre de excelenta.

7. Dezvoltarea cunostintelor in domeniul stiintelor medicale, geneticii si biologiei moleculare.

8. Formarea resursei umane in domeniu.

9. Eliminarea decalajului existent fata de nivelul european in privinta serviciilor medicale, obiectiv aflat

in concordanta cu obiectivul programului de accelerare a procesului de aliniere si integrare tehnologica,

conform cerintelor si reglementarilor Uniunii Europene.

10. Formarea, dezvoltarea, integrarea si consolidarea unei retele de cercetare a caror activitate atinge

nivelul de excelenta, recunoscut conform normelor internationale. Asa cum se poate observa în “Schema

de realizare a proiectului”, realizarea tuturor acestor obiective specifice presupune defalcarea pe obiective

masurabile, pentru fiecare din partenerii participanti la proiect.

Protocolul de lucru (vezi extrasul din Planul de activitati)

Extras din PLANUL DE REALIZARE A PROIECTULUIANALIZA MOLECULARA A PROTEINELOR IMPLICATE IN PRINCIPALELE TIPURI DE NEUROPATII PERIFERICE CU

COMPONENTA DEMIELINIZANTA – NPD

Anul Etape/ Activitati Organizatia executanta

Termene Rezultate/Documente de prezentare a

rezultatelor

2009

Etapa ISTABILIREA MODELULUI EXPERIMENTAL

CO, P1, P2 28.02.2009 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.I.1Stabilirea loturilor de studiu

CO, P1, P2 Protocoale de lucru

A.I.2Stabilirea procedurilor de recoltare a probelor biologice

CO, P1, P2 Proceduri de recoltare

A.I.3Prelevarea de material biologic de la subiecti de diferite varste

P2 nr. probe prelevate

A.I.4Pregatirea probelor biologice

CO, P1 nr. sectiuni; nr. probe incluzionate pentru microscopie electronica; nr. probe congelate

A.I.5Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu

CO, P1 nr. probe analizate anatomopatologic

A.I.6Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic

CO nr. probe analizate morfometric

A.I.7Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate

CO nr. probe analizate prin disociere

A.I.8Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei I

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analiza

Etapa IIINVESTIGATII ANATOMOPATOLOGICE ALE BIOPSIILOR DE NERV SI MUSCHI

CO, P1, P2 30.09.2009 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.II.1Continuarea investigatiilor clinice si paraclinice si a unor noi pacienti cu neuropatie periferica

P2 nr. pacienti introdusi in studiudate clinice si paraclinice

A.II.2Continuarea prelevarii de probe bioogice de la pacientii cu neuropatii periferice

P2 nr. biopsii de nerv si muschi

A.II.3Pregatirea probelor biologice

CO, P1 nr. sectiuni; nr. probe incluzionate pentru microscopie electronica; nr. probe congelate

A.II.4Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu

CO, P1 nr. probe analizate anatomopatologic

A.II.5Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic

CO nr. probe analizate morfometric

A.II.6Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate

CO nr. probe analizate prin disociere

A.II.7Integrarea datelor obtinute pana in acest moment

CO, P1, P2 studiu

A.II.8Evaluarea rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii

CO, P1, P2 studiu

A.II.9Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei II

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analiza

2010

Etapa IIIINTRODUCERA TEHNICII IHF IN VEDEREA STABILIRII EXPRESIEI FENOTIPICE A PROTEINELOR LUATE IN STUDIU

CO, P1, P2 10.12. 2010 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.III.1Continuarea investigatiilor clinice si paraclinice si a unor noi pacienti cu neuropatie periferica

P2 nr. pacienti introdusi in studiudate clinice si paraclinice

A.III.2Continuarea prelevarii de probe bioogice de la pacientii cu neuropatii periferice

P2 nr. biopsii de nerv si muschi

A.III.3Pregatirea probelor biologice

CO, P1 nr. sectiuni; nr. probe incluzionate pentru microscopie electronica; nr. probe congelate

A.III.4Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu

CO, P1 nr. probe analizate anatomopatologic

A.III.5Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic

CO nr. probe analizate morfometric

A.III.6Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate

CO nr. probe analizate prin disociere

A.III.7Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor schwannice investigate prin IHF

CO protocol de lucru

A.III.8Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor fenotipice ale proteinelor prin WB

CO protocol de lucru

A.III.9Optimizarea conditiilor de identificare a mutatiilor prin tehnica MLPA

P1 protocol de lucru

A.III.10Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei III

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analiza

2011

Etapa IVINTRODUCEREA TEHNICII DE WB PENTRU IDENTIFICAREA EXPRESIEI CANTITATIVE SI CALITATIVE A PROTEINELOR INVESTIGATE

CO, P1, P2 15.05.2011 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.IV.1Continuarea investigatiilor clinice si paraclinice si a unor noi pacienti cu neuropatie periferica

P2 nr. pacienti introdusi in studiudate clinice si paraclinice

A.IV.1Continuarea prelevarii de probe bioogice de la pacientii cu neuropatii periferice

P2 nr. biopsii de nerv si muschi

A.IV.1Pregatirea probelor biologice

CO, P1 nr. sectiuni; nr. probe incluzionate pentru microscopie electronica; nr. probe congelate

A.IV.1Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu

CO, P1 nr. probe analizate anatomopatologic

A.IV.1Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic

CO nr. probe analizate morfometric

A.IV.1Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate

CO nr. probe analizate disociate

A.IV.1Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu

CO nr. sectiuni analizate prin IHF

A.IV.1Analiza prin WB a proteinelor luate in studiu

CO nr.probe analizate prin tehnica WB

A.IV.1Diseminare prin comunicare a rezultatelor

CO, P1, P2 - nr. articole- nr. comunicari

A.IV.1Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei IV

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analiza

Etapa VANALIZA MLPA A STATUSULUI MUTATIONAL LA PROTEINELE LUATE IN STUDIU SI VALIDAREA MODELULUI EXPERIMENTAL

CO, P1, P2 30.09.2011 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara; raport final de activitate.

A.V.1Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu

CO nr. sectiuni analizate prin IHF

A.V.2Analiza prin WB a proteinelor luate in studiu

CO nr.probe analizate prin tehnica WB

A.V.3Analiza prin MLPA a statusului mutational la proteinele celulei Schwann

P1 nr.probe analizate prin tehnica MLPA

A.V.4Analiza electrono-microscopica a modificarilor ultrastructurale ale nervului periferic

CO nr. sectiuni analizate la microscopul electronic

A.V.5Integrarea datelor clinice, anatomopatologice, proteomice si genomice

CO, P1, P2 Studiu

A.V.6Analiza functionala a modelului

CO, P1, P2 Studiu

A.V.7Participare la manifestari stiintifice

CO, P1, P2 nr. manifestari stiintifice

A.V.8Validarea modelului experimental

CO, P1, P2 Studiu

A.V.9Diseminarea rezultatelor prin comunicare si publicare

CO, P1, P2 nr. articolenr. comunicari

A.V.10Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei V

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analiza

Diseminarea rezultatelor proiectului:LUCRARI PUBLICATE:

D.C. Marinescu, E. Manole, O. Bajenaru, A.M. Oproiu, A. Ene, I. Mindruta, M. Sajin, B.O. Popescu - Diagnostic considerations in a case of multiplex mononeuropathy, Romanian Journal of Neurology, 2009, VII, 2: 95-99 (categ. CNCSIS B+)

COMUNICARI LA MANIFESTARI STIINTIFICE NATIONALE SI INTERNATIONALE

1. E. Manole, D.C. Marinescu, O. Bajenaru1, A.M. Oproiu, A. Ene, I. Mindruta, M. Sajin, B.O. Popescu - Multiplex Mononeuropathy – Case Presentation, al 6-lea Simpozion National de Patologie, “Patologie celulara si moleculara” si Sesiunea Anuala a Institutului National “Victor Babes”, 3-5 noiembrie 2009, Bucuresti; poster - rezumat publicat in volumul de rezumate al simpozionului, pag. 87

2. Manole E., Popescu B.O. - Molecular diagnosis and treatment targets of Spinal muscular atrophy and Amyotrophic lateral sclerosis, al 6-lea Simpozion National de Patologie, “Patologie celulara si moleculara” si Sesiunea Anuala a Institutului National “Victor Babes”, 3-5 noiembrie 2009, Bucuresti;prezentare orala - rezumat publicat in volumul de rezumate al simpozionului, pag. 71

3. E. Manole, B. O. Popescu - Value of the peripheral nerve biopsy, al VIII-lea Congres al Societatii de Neurologie din Romania, 19-22 mai 2010, Bucuresti; poster

Rezumatul Rapoartelor de cercetare

Rezumatul Etapei 1 de executieDENUMIREA PROIECTULUI:Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de neuropatii periferice cu componenta demielinizanta

Acronim: NPD

Director de proiect, Institutul National “Victor Babes” (INCD): CS I, Dr. Bogdan O. Popescu Responsabil de proiect Universitatea Bucuresti –BCUM-BM (UB): CS II, Dr. Elena IonicaResponsabil de proiect Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti (SUUB): Prof. Dr. Ovidiu A. Bajenaru

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 1, 28.02.2009Stabilirea modelului experimental.

OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUI“Stabilirea modelului experimental”, privind studierea celulelor Schwann in neuropatiile periferice cu componenta demielinizanta.

OBIECTIVELE SPECIFICE ALE ETAPEI 1

1. Stabilirea loturilor de studiu (CO, P1, P2)

2. Stabilirea procedurilor de recoltare a probelor biologice (CO, P1, P2)

3. Prelevarea de material biologic de la subiecti de diferite varste (P2)

4. Pregatirea probelor biologice (CO, P1)

5. Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu (CO, P1)

6. Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic (CO)

7. Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate (CO)

8. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei I (CO)

Rezumatul Etapei 1

Neuropatiile periferice sunt boli ale sistemului nervos periferic, cu manifestari dureroase,

stresante, invalidante si uneori fatale. Diagnosticul este de multe ori dificil de pus, iar terapiile efective

sunt limitate. Identificarea unei neuropatii la pacienti la care coexista mai multe probleme poate fi din

aceasta cauza foarte dificila. Se pot identifica clinic mai multe tipuri de neuropatii periferice, unele

acute, altele cronice, unele simetrice altele de tip mononeuropatic, fiecare cu un diagnostic diferential

diferit. Fiecare din componenetele nervului periferic poate fi afectata primar: celula Schwann, axonul,

vasele sangvine. Faptul ca demielinizarea celulelor Schwann poate produce degradarea secundara a

axonului este un fapt important pentru gasirea unor metode de tratament a neuropatiilor demielinizante

(fie inflamatorii, fie genetice) care sa previna degenerarea axonala si/sau sa promoveze regenerarea

axonala. Neuropatiile cel mai frecvent intalnite (1/2.500-3.000) sunt neuropatiile ereditare senzitivo-

motorii, urmate de polineuropatiile autoimune, de tip inflamator.

In aceasta etapa, obiectivul general a fost stabilirea modelului experimental. Pentru indeplinirea

acestuia, s-au formulat 7 Obiective specifice ale etapei si anume: stabilirea loturilor de studiu,

stabilirea procedurilor de recoltare a probelor biologice, prelevarea de material biologic de la subiecti

de diferite varste, pregatirea probelor biologice, analiza anatomopatologica a probelor de muschi si

nerv periferic luate in studiu, analiza morfometrica a probelor de nerv periferic, Analiza tecii de

mielina pe fibre nervoase disociate si demonstararea functionalitatii modelului la sfarsitul etapei 1.

In etapa I s-au examinat clinic un numar de 12 pacienti cu polineuropatii cronice inflamatorii

demielinizante. S-au prelevat biopsii de nerv periferic si musculare de la 5 pacienti. Biopsiile au fost

prelucrate in vederea analizei anatomopatologice, imunohistochimice, imunoblot, microscopie electronica,

morfometrie, tesing. In etapa curenta s-a analizat anatomopatologic tesutul nervos si muscular,

aplicanduse tehnici de colorare histologice, histochimice si histoenzimologice. S-a facut morfometria

biopsiilor de nerv si disocierea fibra cu fibra (teasing). S-a constatat ca atat nervul sural, cat si muschiul au

suferit modificari patologice de tip neurogen.

CONCLUZII:

In aceasta etapa au fost luati in studiu din punct de vedere neurologic un numar de 12 subiecti cu

diagnosticul de CIDP. Au fost examinati luandu-se in considerare mai multi parametri:

- Varsta medie: femei 48,8 si barbati 52,8;

- Sexul: 5 barbati si 7 femei;

- cronicitatea (1-15 ani) si evolutia bolii: la 4 pacienti boala a evoluat progresiv; la ceilalti cu pusee

si remisiuni;

- deficitul motor: 2 pacienti normali, ceilalti s-au situat intre 1-3,5 pe Scala MRC modificata;

- gradul de dezabilitate: s-a folosit Scorul Rankin;

- afectarea senzitiva (toti subiectii cu parestezii, 3 avand in plus si durere); motorie (9 nu sunt

afectati, la 2 au o afectare a trigemenului si 1 prezinta pareza faciala periferica) si autonoma

(afectati 8 subiecti, 2 femei si 2 barbati);

- examenul electrofiziologic: pacientii prezinta blocuri de conducere si/sau dispersie temporala a

potentialului muscular;

- prezenta limfocitelor T in sange (usoara crestere) si lichidul cefalorahidian (prezenta

semnificativa).

S-au analizat 5 biopsii de nerv sural si 4 de muschi gastrocnemian.

Examenul anatomopatologic al biopsiilor de nerv periferic, morfometria si disocierea fibrelor

mielinice, au demonstrat o afectare a acestuia la toti subiectii, intr-o masura mai mare sau mai mica, dupa

cum urmeaza:

- o reducere a numarului de axoni; ca urmare densitatea fibrelor mielinice/mm2 a fost scazuta la toti

pacientii din lotul de studiu (intre 1500-5300 fibre mielinice/mm2). Dar aceasta reducere s-a facut

la nivelul tuturor categoriilor de fibre (toate dimensiunile).

- histograma fibrelor mielinice a avut un aspect bimodal, normal, ca urmare a faptului ca proportia

fibrelor mielinice (deci ca procent, nu ca numar) de diferite dimensiuni, de la cele mai subtiri la

cele mai groase, s-a pastrat in limite normale.

- s-au observat demielinizari segmentale, degenerari axonale, regenerari de fibre mielinice, alaturi

de fibre normale.

Examenul anatomopatologic al muschiului scheletic a relevat o afectare de origina neurogena, ca

urmare a faptului ca si nervul motor a suferit modificari patologice. S-au observat urmatoarele aspecte:

- variabilitate accentuata de talie a fibrelor musculare, prin prezenta unor grupuri mai mici sau mai

mari de fibre in diverse grade de atrofie; uneori fibrele atrofice au fost izolate, dar cu o forma

specifica neuropatiilor, respectiv angulara sau alungita, in forma de piscot;

- in cele mai multe din cazuri, s-a observat o alterare la nivelul retelei intermiofibrilare pe coloratiile

pentru enzime oxidative (zone mici areactive, asa numitele „ciupituri de molii”), tipic pentru o

afectare de origina neurogena;

- s-a remarcat o grupare de fibre musculare pe tipuri histoenzimatice pe coloratiile pentru ATP-aze

la pH alcanin si bazic (fibre musculare dit I si II), fapt datorat distrugerii terminatiilor nervoase ale

unui neuron si preluarii de catre terminatii nervoase ale altui neuron a inervarii fibrelor musculare.

Rezumatul Etapei 2 de executieDENUMIREA PROIECTULUI:Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de neuropatii periferice cu componenta demielinizanta

Acronim: NPD

Director de proiect (INCD ‘Victor Babes’): CS I, Dr. Bogdan O. Popescu Responsabil de proiect Universitatea Bucuresti –BCUM-BM (UB): CS II, Dr. Gisela GainaResponsabil de proiect Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti (SUUB): Prof. Dr. Ovidiu A. Bajenaru

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 2, 20.11.2009Investigatii anatomopatologice ale biopsiilor de nerv si muschi

OBIECTIVUL GENERAL AL ETAPEI 2

Investigatii anatomopatologice ale biopsiilor de nerv si de muschi

OBIECTIVELE SPECIFICE ALE ETAPEI 2

1. Continuarea investigatiilor clinice si paraclinice a unor pacienti cu neuropatie periferica (P2)

2. Continuarea prelevarii de probe biologice de la pacientii cu neuropatii periferice (P2)

3. Pregatirea probelor biologice in vederea prelucrarii acestora (CO, P1)

4. Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu (CO, P1)

5. Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic (CO)

6. Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate (CO)

7. Integrarea datelor obtinute pana la acest moment (CO, P1, P2)

8. Evaluarea rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii (CO, P1, P2)

9. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei 2 (CO)

Rezumatul Etapei 2In etapa 2 s-a continuat investigarea altor pacienti cu diagnosticul clinic de polineuropatie cronica

demielinizanta si care au fost indrumati pentru biopsie de nerv periferic si muschi scheletic pentru

precizarea sau confirmarea diagnosticului. Astfel, s-au examinat clinic un numar de alti 7 pacienti cu

polineuropatii cronice inflamatorii demielinizante. S-au prelevat biopsii de nerv periferic si musculare de

la acesti pacienti. Biopsiile au fost prelucrate in vederea analizei anatomopatologice, imunohistochimice,

imunoblot, microscopie electronica, morfometrie, teasing. In etapa curenta s-a analizat anatomopatologic

tesutul nervos si muscular, aplicandu-se tehnici de colorare histologice, histochimice si histoenzimologice.

S-a facut morfometria biopsiilor de nerv si disocierea axonilor fibra cu fibra (teasing) acolo unde s-a putut

obtine suficient material biologic. S-a constatat ca atat nervul sural, cat si muschiul au suferit modificari

patologice mai mult sau mai putin accentuate, de tip neurogen demielinizant.

S-au studiat datele stiintifice obtinute in primele doua etape si s-a facut integrarea datelor obtinute

de la cei trei parteneri in proiect. S-a constatat ca biopsia de nerv periferic a adus date importante in

confirmarea si precizarea diagnosticului clinic. De asemenea s-au observat modificarile celulare

patologice la nivelul fibrelor nervoase in demielinizare, modificari mai mult sau mai putin accentuate, in

corelatie cu manifestarile clinice ale bolii.

In urma evaluarii rezultatelor partiale s-au luat cateva decizii pentru imbunatatirea si eficientizarea

activitatii viitoare.

Ca urmare a indeplinirii obiectivelor Etapei a 2-a, s-a demonstrat ca modelul propus in proiect

pana in aceasta faza este functional.

CONCLUZII:

- In aceasta etapa au fost luati in studiu din punct de vedere neurologic un numar de 7 subiecti cu

diagnosticul de polineuropatie demielinizanta. Diagnosticul clinic a fost in 4 cazuri CIDP, in 2 cazuri

polineuropatie mixta demielinizanta, fie difuza, fie paraneoplazice si intr-un caz meningita cronica cu

multiple pareze de nervi cranieni si tetrapareza.

- S-au analizat 6 biopsii de nerv sural si 5 de muschi gastrocnemian.

Examenul anatomopatologic al biopsiilor de nerv periferic, morfometria si disocierea fibrelor

mielinice, au demonstrat o afectare a acestuia la toti subiectii, intr-o masura mai mare sau mai mica, dupa

cum urmeaza:

- o reducere a numarului de axoni; ca urmare densitatea fibrelor mielinice/mm2 a fost scazuta la un

pacient sub limita inferioara a normalului, la ceilalti pacienti fiind foarte aproape de aceasta limita

(intre 5443-8821 fibre mielinice/mm2). Aceasta reducere s-a facut la nivelul tuturor categoriilor de

fibre (toate dimensiunile).

- histograma fibrelor mielinice a avut diferite aspecte: aspect bimodal, normal, ca urmare a faptului

ca proportia fibrelor mielinice (deci ca procent, nu ca numar) de diferite dimensiuni, de la cele mai

subtiri la cele mai groase, s-a pastrat in limite normale; aspect unimodal si deplasat spre dreapta, ca

urmare a disparitiei unui numar de fibre mielinice extreme (mici si foarte mari); trimodal, ca

urmare a reducerii fibrelor mielinice medii.

- s-au observat demielinizari segmentale, degenerari axonale, regenerari de fibre mielinice, alaturi

de fibre normale; in doua cazuri s-au observat in numeroase fibre ingrosari mielinice mai mici sau

mai mari, pana la nivelul de tomacule.

Examenul anatomopatologic al muschiului scheletic a relevat o afectare de origina neurogena, ca

urmare a faptului ca si nervul motor a suferit modificari patologice. S-au observat urmatoarele aspecte:

- variabilitate accentuata de talie a fibrelor musculare, prin prezenta unor grupuri mai mici sau mai

mari de fibre in diverse grade de atrofie; uneori fibrele atrofice au fost izolate, dar cu o forma

specifica neuropatiilor, respectiv angulara sau alungita, in forma de piscot;

- s-au observat fibre clivate;

- s-au observat fibre cu nuclei interni;

- in cele mai multe din cazuri, s-a observat o alterare la nivelul retelei intermiofibrilare pe coloratiile

pentru enzime oxidative (zone mici areactive, asa numitele „ciupituri de molii”), tipic pentru o

afectare de origina neurogena;

- s-a remarcat o grupare de fibre musculare pe tipuri histoenzimatice pe coloratiile pentru ATP-aze

la pH alcanin (fibre musculare dit I si II), fapt datorat distrugerii terminatiilor nervoase ale unui

neuron si preluarii de catre terminatii nervoase ale altui neuron a inervarii fibrelor musculare;

- intr-un fascicul de fibre musculare s-au observat alterari importante asemanatoare cu cele din

miopatii, demonstrand o suferinta neurogena cronica.

Datele de laborator s-au corelat cu cele clinice si paraclinice, aducand date in plus in sprijinul

diagnosticului.

Din punct de vedere stiintific, s-au facut observatii ale comportamentului celulelor Schwann in

neuropatiile demielinizante in special de tipul CIDP. Se preconizeaza in continuare analiza moleculara a

acestor celule.

Rezumatul Etapei 3 de executieDENUMIREA PROIECTULUI:Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de neuropatii periferice cu componenta demielinizanta

Acronim: NPD

Director de proiect (INCD ‘Victor Babes’): CS I, Dr. Bogdan O. Popescu Responsabil de proiect Universitatea Bucuresti –BCUM-BM (UB): CS II, Dr. Gisela GainaResponsabil de proiect Spitalul Universitar de Urgenta Bucuresti (SUUB): Prof. Dr. Ovidiu A. Bajenaru

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - FAZA 3, 10.12.2010Intrtoducerea tehnicii IHF in vederea stabilirii expresiei fenotipice a proteinelor luate in studiu

OBIECTIVUL GENERAL AL ETAPEI 2

Intrtoducerea tehnicii IHF in vederea stabilirii expresiei fenotipice a proteinelor luate in studiu

OBIECTIVELE SPECIFICE ALE ETAPEI 2

1. Continuarea investigatiilor clinice si paraclinice a unor pacienti cu neuropatie periferica (P2)

2. Continuarea prelevarii de probe biologice de la pacientii cu neuropatii periferice (P2)

3. Pregatirea probelor biologice in vederea prelucrarii acestora (CO, P1)

4. Analiza anatomopatologica a probelor de muschi si nerv periferic, luate in studiu (CO, P1)

5. Analiza morfometrica a probelor de nerv periferic (CO)

6. Analiza tecii de mielina pe fibre nervoase disociate (CO)

7. Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor

schwannice investigate prin IHF sau IHC (CO, P1)

8. Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor fenotipice ale proteinelor prin WB (CO)

9. Optimizarea conditiilor de identificare a mutatiilor prin tehnica MLPA (CO)

10. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei 2 (CO)

Rezumatul Etapei 3In etapa 3 s-a continuat investigarea altor pacienti cu diagnosticul clinic de neuropatie periferica si

care au fost indrumati pentru biopsie de nerv periferic si muschi scheletic pentru precizarea sau

confirmarea diagnosticului. Astfel, in aceasta etapa s-au examinat clinic un numar de alti 7 pacienti, care

au primit urmatoarele diagnostice: neuropatie vasculitica (1), mononeuropatie multiplex (2),

polineuropatie senzitiva cronica (1), tetrapareza (1), neuropatie periferica (1), polineuropatie senzitiva

motorie axonala severa (1). S-au prelevat biopsii de nerv sural si muschi de la acesti pacienti. Biopsiile au

fost prelucrate in vederea analizei anatomopatologice, imunohistochimice, imunoblot, microscopie

electronica, morfometrie, tesing. In etapa curenta s-a analizat anatomopatologic tesutul nervos si

muscular, aplicandu-se tehnici de colorare histologice, histochimice si histoenzimologice. S-a facut

morfometria biopsiilor de nerv, pe sectiuni semifine si disocierea axonilor fibra cu fibra (teasing) acolo

unde s-a putut obtine suficient material biologic. S-a constatat ca atat nervul sural, cat si muschiul au

suferit modificari patologice mai mult sau mai putin accentuate, de tip neurogen demielinizant.

S-au optimizat tehnicile de imunohistochimie pe sectiuni la gheata de nerv sural, de Western blot

pe tesut prelevat de la sobolan si MLPA pe probe de sage de la pacienti.

Ca urmare a indeplinirii obiectivelor Etapei a 3-a, s-a demonstrat ca modelul propus in proiect

pana in aceasta faza este functional.

CONCLUZII:

- In aceasta etapa au fost luati in studiu din punct de vedere neurologic un numar de alti 7 subiecti cu

diagnosticul de polineuropatie demielinizanta.

- S-au analizat 5 biopsii de nerv sural si 6 de muschi gastrocnemian.

Examenul anatomopatologic al biopsiilor de nerv periferic, morfometria si disocierea fibrelor

mielinice, au demonstrat o afectare a acestuia la toti subiectii, intr-o masura mai mare sau mai mica, dupa

cum urmeaza:

- O densitate normala sau usor redusa a numarului de axoni;

- histograma fibrelor mielinice a avut diferite aspecte: aspect bimodal, normal, ca urmare a faptului

ca proportia fibrelor mielinice s-a pastrat in limite normale; aspect unimodal si deplasat spre

dreapta, ca urmare a disparitiei unui numar de fibre mielinice mari;

- s-au observat demielinizari segmentale, degenerari axonale, regenerari de fibre mielinice, alaturi

de fibre normale; intr-un caz s-au observat in numeroase fibre ingrosari mielinice mai mici sau mai

mari, pana la nivelul de tomacule.

Examenul anatomopatologic al muschiului scheletic a relevat o afectare de origina neurogena, mai

mult sau mai putin severa, ca urmare a faptului ca si nervul motor a suferit modificari patologice. S-au

observat urmatoarele aspecte:

- variabilitate accentuata de talie a fibrelor musculare, prin prezenta unor grupuri mai mici sau mai

mari de fibre in diverse grade de atrofie; uneori fibrele atrofice au fost izolate, dar cu o forma

specifica neuropatiilor, respectiv angulara sau alungita, in forma de piscot;

- s-au observat fibre clivate;

- s-au observat fibre cu nuclei interni;

- in cele mai multe din cazuri, s-a observat o alterare la nivelul retelei intermiofibrilare pe coloratiile

pentru enzime oxidative (zone areactive), tipic pentru o afectare de origina neurogena;

- s-a remarcat o grupare de fibre musculare pe tipuri histoenzimatice pe coloratiile SDH si NADH,

fapt datorat distrugerii terminatiilor nervoase ale unui neuron si preluarii de catre terminatii

nervoase ale altui neuron a inervarii fibrelor musculare;

Datele de laborator s-au corelat cu cele clinice si paraclinice, aducand date in plus in sprijinul

diagnosticului.

- S-au optimizat tehnicile de WB pentru Conexina 32 si imunohistochimie pentru proteinele PMP22,

Conexina 32 si MPZ pentru a putea aplica in continuare aceste tehnici in studierea proteinelor schwannice

la pacientii cu neuropatii periferice.