ENZIME

CONSIDERAŢII GENERALE

Una din trăsăturile caracteristice ale celulelor vii este capacitatea acestora de a înfăptui reacţii complexe întru-un timp scurt, la temperatura mediului înconjurător. Principalul factor care participă la realizarea transformărilor metabolice din celule il constituie enzimele.

Enzimele sunt substanţe care catalizeaza reacţiile biochimice din organism. Ele au rol esenţial în biosinteza şi degradarea substanţelor din materia vie. Se găsesc în toate organismele vegetale, animale şi în microorganisme. Toate transformările biochimice în ţesuturi şi celule sunt posibile numai prin acţiunea enzimelor, care se mai numesc şi biocatalizatori. Enzimele determină în organism realizarea unor reacţii chimice cu viteză mare, în condiţii compatibile cu viaţa. Dacă aceste reacţii s-ar produce în vitro, nu s-ar putea realiza decât în condiţii incompatibile cu fenomenele de viaţă ,temperatură şi presiune mare, mediu puternic acid sau bazic, etc. . În lipsa enzimelor, majoritatea covârşitoare a reacţiilor chimice din organism nu s-ar produce şi deci nu ar mai putea exista procese metbolice şi nici fenomene de viaţă. Enzimele au un rol fundamental în reglarea proceselor metabolice din organism.

Sub aspect chimic, enzimele sunt proteine sau proteide cu rol funcţional foarte important. Ele sunt produse numai de organismele vii şi îşi pot manifasta activitatea enzimatică atât în interiorul cât şi în afara organismului. Substanţa asupra căreia acţionează enzimele poartă numele de substrat.

În celulă, enzimele nu se găsesc izolate de componenţii celulari (nucleu, citoplasmă, etc.). Ele se găsesc fie absorbite sau adsorbite pe anumite formaţiuni subcelulare (plastide, mitocondrii, etc.),fie dizolvate în protoplasmă sau în sucul celular. Prin această distribuire, enzimele din celule vin în contact cu o cantitate mai mare de substanţe.

Enzimele fiind substanţe proteice îşi pierd puterea catalitică sub acţiunea căldurii, a acizilor sau bazelor tari, a solvenţilor organici sau a altor substanţe ce denaturează structura proteinelor.

Bogate în enzime sunt seminţele în stare de germinaţie, plantulele, frunzele, ţesuturile meristematice, fructele, etc.

În general, plantele tinere au un conţinut mai ridicat de enzime decât plantele bătrâne. Puterea catalitică a enzimelor din organismele în creştere este mai mare decât a celor din organismele bătrâne.

După locul unde îşi manifestă activitatea, enzimele se pot clasifica în exoenzime şi endoenzime.

1

Exoenzimele, după formarea lor în celule, sunt eliminate în lichidele din organism, unde îşi exercită activitatea catalitică. Aşa sunt enzimele din lichidele interstiţiale, din diferite cavităţi, din seva elaborată etc.

Endoenzimele, numite şi enzime intracelulare, îşi exercită acţiunea în celulele în care s-au format. Ele sunt: lioenzime, legate mai slab în celulă şi desmoenzime, legate mai puternic în celule.

Formarea şi degradarea enzimelor în organism se realizeaza cu o viteză mai mare decât se produce biosinteza şi degradarea proteinelor cu rol structural. Enzimele nu s-au putut sintetiza până în prezent în laborator, dar s-a reuşit să se stabilească succesiunea aminoacizilor din lanţul polipeptidic al unor enzime (ribonuclează, tripsină, liozim etc.).

CARACTERISTICILE GENERALE ALE ENZIMELOR

Ca biocatalizatori, enzimele se caracterizează prin următoarele proprietăţi generale:

- acţionează în cantităţi extrem de mici, dar manifestă o activitate extrem de intensă;

- nu se consumă şi nu se transformă în reacţiile catalizate;- catalizează reacţii termodinamic posibile, adică reacţii

care corespund unei diminuări a energiei libere;- orientează şi măresc viteza reacţiilor

biochimice,determinând scăderea energia de activare a moleculelor de substrat asupra cărora acţionează;

- constituie cei mai eficienţi catalizatori cunoscuţi, determinând reacţii extrem de rapide;

- nu modifică starea finală de echilibru a reacţiilor ci numai viteza cu care se realizează acest echilibru;

- într-o reacţie reversibilă care conduce la o stare de echilibru, enzima accelerează numai cele două viteze de reacţie (1 şi 2) care evoluează simultan şi în sens invers, determinând astfel atingerea mai rapidă a stării de echilibru;

- se disting printr-o specificitate de acţiune, conversia unui substrat întru-un produs de reacţie sau biosinteza unei substanţe din componentele constitutive fiind catalizate de un anumit tip de enzime;

- asigură coordonarea, reglarea şi controlul proceselor biochimice la care participă, modulând activitatea metabolismului celular.

2

STRUCTURA ŞI CONFORMAŢIA ENZIMELOR

Natura proteică a enzimelor. Enzimele sunt biocatalizatori de natură proteică. În consecinţă, structura lor chimică de ansamblu reprezintă un edificiu macromolecular complex determinat de nivelurile de organizare structurală a proteinelor. Totodată enzimele posedă proprietăţile generale fizice şi chimice ale proteinelor. Fiind însă o clasă specială de molecule proteice, enzimele se caracterizează, sub aspect structural, prin două trăsături generale distinctive în strânsă corelaţie, şi anume:

a) Existenţa unor particularităţi structurale specifice care le conferă activitatea catalitică; astfel, moleculele de enzimă posedă în structura lor anumite zone, denumite situsuri cu o secvenţă de aminoacizi şi conformaţia caracteristică, zone care sunt esenţiale pentru manifestarea activităţii catalitice (situs catalitic) sau pentru funcţia de reglare (situs allosteric) a unor secvenţe de reacţii.

b) Existenţa unei configuraţii structurale spaţiale a moleculei, configuraţie care – în ansamblul ei – este responsabilă sau contribuie la manifestarea activităţii enzimatice.

Conformaţia unei proteine enzimatice de tip globular implică existenţa unei regiuni interne hidrofobe a moleculei care este constituită din aminoacizi cu catene nepolare (hidrofobe), precum şi a unei regiuni hidrofile constituită din aminoacizi cu catene polare.

Situs catalitic. Manifestarea proprietăţiilor catalitice sau reglatoare ale enzimelor este conferită de existenţa în structura lor moleculară a unor regiuni sau zone privilegiate la care se leagă în mod specific substratul de reacţie sau efectorul allosteric care modulează funcţia de reglare a anumitor enzime.

Substratul enzimelor (S) reprezintă un compus chimic care se poate lega specific, la o enzimă (E) şi asupra căruia enzima acţionează transformându-l în produs de reacţie (P):

Ca structură moleculară substratul trebuie să îndeplinească următoarele condiţii:

a) să satisfacă necesitatea de specificitate a unei enzime;b) să prezinte o dispunere spaţială bine definită care să-i

permintă accesul la molecula de enzimă;c) să prezinte o complementaritate structurală şi

conformaţională, cu situsul catelitic al enzimei cu care trebuie să stabilească cel puţin trei puncte de interacţiune specifică;

d) reactivitatea acestor puncte de contact ale enzimei trebuie să fie diferită sau asimetrică;

3

e) să se asocieze cu enzima pe baza unei orientări strict specifice.

Una din cele mai remarcabile proprietăţi ale enzimelor este capacitatea lor de a acţiona preferenţial numai asupra unor anumite substraturi, proprietate denumită generic ’specificitate enzimatică’.

Această specificitate este strict determinată de existenţa în structura moleculei de enzimă a situsului catalitic, situs activ.Între situsul catalitic al enzimei şi substratul de reacţie se produce o interacţiune specifică ce stă la baza catalazei enzimatice.

Situsul catalitic reprezintă o zonă specifică şi delimitată constituită dintr-un număr mic de radicali de aminoacizi; aceştia formează o geometrie spaţială perfect ordonată şi structural asimetrică, la nivelul căreia se exercită proprietatea catalitică a enzimei prin capacitatea de a interacţiona cu moleculele de substrat asupra cărora acţionează. Situsul catalitic este localizat în porţiunea internă, hidrofobă a moleculei de protein-enzimă, iar conformaţia sa structurală este determinată şi stabilizată de către conformaţia întregului edificiu molecular al enzimei. Porţiunea hidrofobă a moleculei oferă condiţii extrem de favorabile pentru realizarea transferului de electroni, de protoni sau de grupări chimice dintre proteina enzimatică şi substratul legat la situsul catalitic, transfer pe care se bazează efectuarea reacţiilor catalizate de către enzime.

Situsul catalitic include grupări chimice active din catenele laterale ale radicalilor de aminoacizi ( - OH, - NH2, - COOH, - SH, heterociclul imidazol ) care , în mod individual şi împreună , participă la stabilirea legăturii dintre enzimă şi substrat, determinând astfel reacţia specifică.

Interacţiunea şi funcţionalitatea aminoacizilor care constituie situsul catalitic sunt consecinţa structurii spaţiale a moleculei de protein-enzimă care, prin înfăşurarea sa într-o conformaţie nativă,stabilă, aduce anumite grupări chimice ale unor aminoacizi – distanţaţi în secvenţa structurii primare – într-o anumită poziţie apropiată spaţial; această dispunere permite realizarea unui contact intim între grupările chimice ale aminoaciziilor respectivi, determinând astfel constituirea situsului catalitic.

Aminoacizii implicaţi în constituţia situsului catalitic diferă prin funcţia lor de alţi aminoacizi componenţi ai moleculei de enzimă. ”Anotomia” unei astfel de molecule implică existenţa a patru categorii de aminoacizi:

1) aminoacizi neesenţiali, care pot fi înlocuiţi sau detaşaţi din structura enzimei fără repercursiuni asupra conformaţiei sau funcţiei catalitice a moleculei de enzimă;

2) aminoacizi structurali, care asigură suportul structural al moleculei şi care sunt esenţiali pentru menţinerea unei conformaţii ordonate şi stabile a întregi molecule de enzimă;

3) aminoacizi auxiliari, care asigură o anumită flexibilitate a regiunilor limitrofe situsului catalitic şi respectiv a structuri tridimensionale a moleculei de enzimă;

4

4) aminoacizi de contact sau catalitici, care prezintă o importanţă determinantă pentru activitatea catalitică a enzimei, deoarece sunt constituenţi ai situsului catalitic şi deţin un rol decisiv în legarea directă a substratului

Pe baza acestor considerente rezultă că: situsul catalitic ocupă o zonă restrânsă din molecula enzimei; substratul pe care-l transformă catalitic enzima este o micromoleculă dimensionată pe măsura situsului catalitic cu care interacţionaeză; numărul de aminoacizi care constituie situsul catalitic şi care participă la activitatea catalitică propriu-zisă este foarte restrânsă; geometria spaţială a situsului catalitic este asigurată şi menţinută prin interacţiunea aminoacizilor structurali şi auxiliari şi în ultima analiză, prin organizarea spaţială sau conformarţia întregii molecule de enzimă. Diferiţi agenţi chimici şi fizici cu acţiune denaturată pot induce modificări ireversibile în conformeţia situsului catalitic care devine astfel impropriu pentru accesul şi legarea substratului de reacţie. În aceste condiţii, enzima este denaturată şi proprietăţiile sale catalitice sunt diminuate sau anulate.

În concluzie condiţia manifestării activităţii catalitice a unei enzime este menţinerea conformaţiei sale native, deoarece această conformaţie determină distanţele optime de interacţiune între grupările chimice ale situsului catalitic şi cele ale substratului succeptibil de a fi legat la acest situs.

Situs allosteric. O serie de enzime oligomere constituite din două sau mai multe subunităţi, denumite ensime allosterice şi care au rol de reglare enzimatică, conţin în molecula lor – pe lângă situsul catalitic – şi un al doilea situs numit situs allosteric. Existenţa şi funcţiile situsului allosteric stau la baza teoriei allostericecare explică mecanismele de reglare anzimatică a unor reacţii metabolice, În aceste mecanisme de reglare prin interacţiuni allosterice (activator sau inhibator) care se leagă la situsul allosteric şi astfel modulează tranziţiile moleculei de enzimă între diferite conformaţii posibile pe care le poate lua. Prin asemenea tranziţii induse de efectorul allosteric, se realizează efectele reglatoare ale enzimelor allosterice. De fapt, conceptul de allosterism se referă la variaţiile posibile ale conformaţiei tridimensionale ale moleculei de enzimă.

Aspecte teoretice

Peroxidaza, transelectronaza (enzima tranportoare de electroni) face parte, împreună cu catalaza, din grupa hidroperoxidazelor, clasa oxidoreductazelor. Oxidoreductazele, prima clasă de enzime din sistemul de clasificare a U.I.B. (Uniunea Internaţională de Biochimie) sunt enzime care participă la reacţiile de oxidoreducere biologică.

Termenul de peroxidaze include o grupare de enzime specifice ca NAD peroxidaza; NADP peroxidaza; acid gras peroxidaza; citrocom peroxidaza; glutaţion peroxidaza şi o grupa de enzime nespecifice, izolate din diferite surse,

5

cu nomenclatură sistemică ”donor de hidrogen: H2O2- oxidoreductaza” şi codul E.C.1.11.1.7. sau ”donor: peroxid de hidrogen oxidoreductaza”

Peroxidaza se găseşte atât în regnul vegetal cât şi animal. Este distribuită în mitocondrii, peroxizomi şi catalizează dehidrogenarea unui număr mare de compuşi organici cum sunt: fenoli şi amine aromatice, hidrochinone, în special derivaţi ai benzidinei.

În particular pot fi menţionaţi: o-crezolul; guiacolul; acidul homovanilic; p-hidrochinona; o-fenildiamina şi p-fenildiamina; leucomalachitul verde; 2,6-diclorfenol indofenolul redus; 4-4’-diaminodifenil amina; benzidina; o-tolidina.

Peroxidaza este o glicoproteidă deoarece este alcătuită din prohemina IX care conţine Fe3+ şi o componentă de natură glicoproteică.

Din punct de vedere structural peroxidaza este considerată o enzimă heminică, fiind alcătuită dintr-o parte proteică numită apo-enzimă şi o parte neproteică ce poartă denumirea de grupare prostetică. Ca şi în cazul citocromilor şi catalazei, gruparea prostetică este o grupare porfirinică. Legătura dintre apo-enzima peroxizazei şi gruparea porfirinică este o legătură trainică de tip covalent asemănătoare legăturii dintre hem şi globina din hemoglobină sau clorofilă. Gruparea prostetică a acestei enzime se deosebeşte de gruparea prostetică (hem) a hemoglobinei prin faptul că cele patru nuclee pirolice nu se leagă coordinativ de un atom de fier, aflat în starea de oxidare bivalentă Fe 2+, ci de un atom de fier aflat în stare de oxidare superioară Fe3+.

Peroxidaza este numele generic dat unui grup de enzime care catalizează reacţii de oxido-reducere după reacţia generală:

H2 + ROH ROOH + AH APeroxidazele pot cataliza un număr larg de reacţii separate. Cu câteva

excepţii, majoritatea lor sunt hemproteine care se găsesc în plante, mucegaiuri, bacterii şi drojdii. Cinetica activităţii enzimatice variază în funcţie de sursă. În general peroxidazele sunt definite ca enzime care catalizează reacţii de dehidrogenare. Peroxidul de hidrogen (H2O2) este în general, substrat oxidant (ROOH). Adăugarea peroxidazei în sistemul aluat poate induce implicarea grupărilor feruloil, esterificate de reziduuri de arabinoză, în gelatinizarea oxidativă a pentozanilor.

Deşi efectul de îmbunătăţire al proprietăţilor reologice ale aluatului a fost demonstrat, reacţiile care au loc în aluat sunt puţin înţelese. Implicarea peroxidazei în întărirea aluatului are loc prin agregarea proteinelor, prin legarea încrucişată a glucidelor între ele şi cu proteinele.

HIDROPEROXIDAZELE

Reprezintă oxidoreductaze care utilizează ca substrat de reacţie peroxidul de hidrogen (H2O2). Din această categorie fac parte peroxidazele şi catalazele.

6

Peroxidazele sunt hemiproteide (Fe3+) care catalizează reacţia generală:

H2O2 + AH2 2H2O + AÎn această reacţie, peroxidul de hidrogen este redus, comportându-se ca

un acceptor de H şi respectiv de electroni:H2O2 + 2H+ 2e- 2H2OPeroxidazele sunt enzime foarte mult răspândite în regnul vegetal, mai

puţin în regnul animal. Prezintă o specificitate relativ mare faţă de acceptori; de obicei acceptorul este H2O2 şi foarte rar alţi hidroperoxizi. Peroxidazele sunt mai puţin specifice faţă de donori. Ca donori pot funcţiona o serie de fenoli, aminofenoli, diamine, aminoacizi. De exemplu când donorul de H este un difenol, sub influenţa peroxidazei acesta este oxidat la chinonă.

Peroxidul de hidrogen şi un co-substrat, cum ar fi pirogalor, purpogalin sau o-dianisidina, au fost utilizate pentru măsurarea activităţii peroxidazei. Metoda poate fi apoi realizată, în mod convenţional, prin măsurarea produşilor de reacţie coloraţi, tip chinona, care sau format. Într-un studiu realizat pe grâu, oxigenul format prin descompunerea Peroxidului de hidrogen s-a măsurat monometric(Irvine şi alţii, 1954). Într-o altă metodă prezentată de Kruger(1976) scăderea concentraţiei de peroxid de hidrogen a fost determinată prin reducerea dicromatului la acid cromic şi măsurarea culorii la 570 nm.

O cale pron care se poate suspende transferul atomilor de hidrogen la oxigen prin intermediul citocromilor este calea de transfer direct a hidrogenului la oxigenul molecular cu formare de H2O2 (peroxidul de hidrogen). Recţiile de transfer direct sunt catalizate de transhidrogenazele aerobe. Acestea sunt enzime care conţin ca grupe prostetice flavin – nucleotide şi uneori şi metale grele (de exemplu molibden). Peroxidul de hidrogen format este utilizat apoi pe diferite căi sau descompus, după specia organismului. Asemenea căi există atât în organismele aerobe care conţin citocromi cât şi în cele care nu conţin citocromi (de exemplu în bacteriile lactice Lactobacillus delbrückii şi Lactobacillus acidophilus). Ca exemmple de transhidrogenaze aerobe se citează enzima galbenă veche din drojdie, care catalizează dehidrogenarea TPNH-ului conform reacţiilor:

TPNH + H+ + FP TPN+ + FPH2 FPH2 + O2 FP + H2O2 şi glucoz- oxidaza despre care s-a vorbit.Peroxidul de hidrogen care se acumulează în mediile biologice de pe

urma acestor reacţii este, fie descompus de catalaze în organismele care conţin catalază, fie utilizat de peroxidaze pentru oxidarea altor substrate. Catalazele la concentrţii mici de H2O2 pot îndeplini şi funcţie de peroxidaze şi pot să catalizeze şi ele oxidarea cu H2O2 a numeroase substrate; ca alcool, formaldehidă, formaţii, nitriţi.

Peroxidazele din plante şi animale sunt, la fel ca şi catalazele, enzime fer-polifirinice înrudite cu catalazele dar activitate peroxidazică pot să aibă şi o

7

serie de enzime flavinice din bacterii. Dintre acestea din urmă cea mai bine studiată a fost peroxidaza flavinică din Streptococcus faecalis care oxidează DPNH-ul la DPN+ cu ajutorul peroxidului de hidrogen conform reacţiei:

DPNH + H+ + H2O2 DPN+ + 2H2OAPLICAŢII ALE PEROXIDAZEI

Prin congelare se poate întâmpla ca anumite enzime mai sensibile să fie inactivate şi prin aceasta lanţul reacţiilor să fie întrerupt complet nu numai încetinit, iar alte enzime ca de exemplu catalaza, peroxidaza, polifenoloxidazele să fie activate. Prin congelare apar raporturi noi între enzime şi substrate, deoarece prin formarea cristalelor de gheaţă are loc o concentrare simţitoare a tuturor substanţelor existente în soluţie, iar prin spargerea formaţiunilor structurale din celule de către cristalele de gheaţă, enzimele sunt eliberate şi scapă de sub controlul organizat al celulei. După decongelare, produsele vegetale se alterează prin şedere ca şi cum ar fi suferit vătămări mecanice, loviri sau striviri.

Pentru prevenirea schimbărilor de gust şi apariţia de substanţe urât mirositoare în timpul conservării prin congelare, produsele vegetale, înainte de congelare se supun unui tratament, fie de inactivare a enzimelor, fie de inhibare a activităţii lor în timpul conservării prin congelare. Inactivarea se realizează în mod obişnuit pe cale termică prin opărire, aburire sua fierbere. Datorită faptului că la inactivarea pe cale termică prin metodele arătate se produc pierderi de substanţe, modificări de culoare şi schimbarea gustului (apare gustul de fiert), s-a propus în ultimul timp şi inactivarea pe cale chimică, care constă în imersare sub vacuum a produsului vegetal tăiat, într-o soluţie cu un anumit pH ce conţine alcool (48%) şi diferite substanţe înhibitoare pentru enzime, apoi spălare şi congelare.

La inactivarea termică a enzimelor, prin opărire, aburire sau fierbere, este extrem de importantă temperatura şi durata tratamentului care trebuie să asigure o inactivare completă. Temperatura şi durata necesară tratamentului de inactivare depind de specia şi soiul de fruct care urmează să fie congelat şi se stabilesc experimental.

Pentru stabilirea acestor parametri se aleg mai multe temperaturi de opărire şi pentru fiecare temperatură diferite durate. Produsele opărite experimental se depozitează apoi la – 17 o C şi periodic se apreciază mirosul şi activitatea enzimelor presupuse a fi responsabile de transformări, rezistenţe la temperaturi ridicate şi care se determină uşor. Aceste enzime sunt catalaza şi peroxidaza. S-a constatat că peroxidaza, catalaza şi enzimele proteilitice din produsele vegetale au tendinţa să se reactiveze în timpul conservării prin congelare când tratamentul termic de inactivare nu a fost suficient de energic.

Alegerea determinării activităţii catalazei sau peroxidazei ca un criteriu de inactivare a enzimelor pe cale termică se justifică astfel: activitatea acestor enzime se determină uşor, sunt enzime relativ rezistente la inactivarea termică şi

8

o dată cu inactivarea lor se presupune că sunt inactivate toate enzimele, dar motivul cel mai important este faptul că, ori de câte ori s-a constatat o activitate peroxidazică sau catalazică după tratamentul de inactivare, au apărut în timpul conservării prin congelare substanţe rău mirositoare.

Pentru testarea rapidă în industrie a activităţii peroxidazei se folosesc hârtii indicator. O asemenea hârtie se poate prepara astfel: fâşii de hârtie de filtru se scufundă întru-un amestec format din părţi egale dintr-o soluţie alcoolică de 1% o-toluidină; fâşiile de hărtie se usucă la aer şi intuneric şi se păstreză în exicator la răcitor. Pentru executarea determinării se aplică o picătură din extractul obţinut din material sau prin aplicarea hârtiei pe tăietura materialului şi se observă schimbarea de culoare.

Din cele arătate nu trebuie să se înţeleagă că transformările nedorite din timpul conservării prin congelare la produsele neopărite sau insuficient opărite s-ar datora numai catalazei şi peroxidazei. Procesele enzimatice care au loc în produsele congelate sunt complexe şi sunt catalizate de multe enzime.

Cercetări mai sistematice, pentru a stabili influenţa individuală şi în amestec a câtorva enzime presupuse responsabile de apariţia substanţelor urât mirositoare, în timpul conservării prin congelare a produselor vegetale, s-au făcut în cazul mazării. Din mazăre s-au obţinut în stare parţial purificată enzimele: lipoxidaza, lipaza, catalaza şi peroxidaza. Aceste enzime s-au adăugat separat şi în amestec la terciuri preparate din mazăre verde opărită; probele s-au congelat la – 17,8 o C şi în această stare s-au conservat 18 luni, după care ele au fost examinate chimic şi organoleptic în comparaţie cu probe martor. S-a constatat că mirosul neplăcut dat de probele tratate cu preparate de enzime se identifică cu mirosul dat de probele de mazăre care nu au fost opărite. Mirosurile cele mai neplăcute s-au constatat la probele tratate cu catalază şi lipoxidază şi în mică măsură la probele tratate cu peroxidază. În cazul lipazei, de asemenea s-au constatat mirosuri neplăcute însă preparatele de lipază cuprindeau şi lipoxidază, catalază şi peroxidază. Lipoxiza singură sau în amestec cu celelalte enzime produce degradarea clorofilei prin reacţii de autooxidare cuplate, transformând clorofila în substanţe incolore. În timpul conservării prin congelare nu s-a constatat scăderea activităţii peroxidazei, catalazei şi lipoxidazei, în schimb activitatea lipazei a scăzut cu 52%.

În continuare vom vorbi despreprocesele enzimatice care au loc în produsele vegetale în urma tratamentelor macanice: strivirea, stoarcerea, măcinarea, prin care ţesuturile şi celulele sunt distruse. După destrămarea ţesuturilor şi celulelor, în produsele vegetale respective nu mai au loc procese normale de metabolism.

Metabolismul normal al ţesuturilor şi celulelor care alcătuiesc ţesuturile este asigurat de o anumită structură internă a celulelor cu localizarea în spaţiu a substratelor şi a sistemelor enzimatice în anumite anumite formaţiuni structurale, mitocondrii, microzomi şi altele şi de o anumită succesiune a diferitelor căi de sinteză şi degradare a substanţelor care alcătuiesc metabolismul. O dată cu

9

distrugerea mecanică a ţesuturilor şi celulelor se produce şi o dezorganizare a metabolismului, diferitele substrate şi enzime se amestecă, succesiunea naturală a reacţiilor este întreruptă, raporturile de concentraţie dintre enzime şi substrate sunt altele şi din acest motiv în produse apar transformări de substanţe care în mod normal nu se constată în produsele naturale întregi şi vii; ele apar însă după moartea acestora în urma proceselor de autoliză. Ca exemple de procese enzimetice care apar în urma distrugerii mecanice a ţesuturilor şi celulelor, uşor de constatat organoleptic, se citează apariţia mirosurilor caracteristice la strivirea usturoiului, la raderea hreanului şi la tăierea cepei şi apoi înnegrirea pe tăietură a cartofilor, merelor şi a fructelor.

Procesele enzimatice care au loc la prelucrarea mecanică a produselor vegetale sau după moartea naturală a acestora sunt complexe şi insuficient studiate. Cele mai importante din punct de vedere practic sunt procesele de hidroliză catalizate de hidrolaze şi procesele de oxido-reducere catalizate de diferite enzime din clasa principală a oxido-reductazelor.

Prin distrugerea mecanică a ţesuturilor şi celulelor, procesul normal de respiraţie este întrerupt. Sistemele finale transportoare de hidrogen de la coenzimele piridin-nucleotidice şi flavin-nucleotidice, din lanţurile de respiraţie, cum sunt, sistemul de citocromi, sistemul acid ascorbic-dehidro-ascorbic şi sistemul fenoli-chinone, sunt oxidate ireversibil nemaifiind reduse de coenzimele arătate. Reacţiile de oxidare respective sunt catalizate de citocrom-oxidază, ascorbinat-oxidază şi de fenol-oxidaze şi polifenol-oxidaze. Catalaza, peroxidaza şi lipoxidaza, care în produsele vegetale vii par să fie mai puţin active, îşi intensifică foarte mult activitatea.

Cartofii curăţaţi şi fructele tăiate (merele, perele, gutuile, caisele şi altele) se închid la culoare pe tăietură, prin şederea în contact cu aerul. Închiderea la culoare, înnegrirea sau brunifierea se datorează oxidării substanţelor fenolice existente în plante, sub acţiunea fenol-oxidazelor şi polifenol-oxidazelor cu participarea oxigenului molecular din aer. Oxidarea poate să fie efectuată şi de peroxidaze cu participarea apei oxigenate.

Peroxidazele oxidează atât monofenolii cât şi polifenolii cu participarea apei oxigenate. Apa oxiganată este furnizată de reacţiile catalizate de transhidrogenazele aerobe,enzime flavinice.

Cercetătorul sovietic Rubin şi colaboratorii săi acordă un rol important polifenol-oxidazelor şi peroxidazelor în rezistenţa plantelor la atacul ciupercilor. O activitate mare a polifenol-oxidazelor şi peroxidazelor măreşte rezistenţa plantelor la atacul ciupercilor.

Din punct de vedere practic, oxidarea substanţelor polifenolice de către polifenol-oxidaze sau peroxidaze în timpul prelucrării produselor vegetale poate să fie nedorită, cum este cazul cartofilor comercializaţi în stare curăţată sau la conservarea prin congelare a pireurilor de fructe, sau dorită, cum se întâmplă la fermentarea mustului, tutunului şi a boabelor de cacao.

10

Reactivarea enzimelor în conservele de produse vegetale sterilizate termic. În scopul reducerii preţului de cost şi al îmbunătăţirii calităţii produselor se practică o nouă tehnică de sterilizare numită sterilizarea la temperatură înaltă-timp scurt. Scopul sterilizării termice este distrugerea microorganismelor pentru asigurarea conservării. La stabilirea parametrilor de sterilizare pentru noua metodă şi anume a relaţiei temperatură-timp, trebuie să se ţină seama, nu numai de distrugerea totală a microorganismelor, ci şi de inactivarea definitivă a enzimelor prin urmărirea, în timp, după sterilizare a activităţii peroxidazei în cazul conservelor din produse vegetale. Urmărirea activităţii enzimelor după sterilizare este necesară, deoarece s-a constatat în cazul acestei metode că, în conservele de produse vegetale sterilizările din punct de vedere microbiologic, apar uneori modificări de gust şi miros asemănătoare cu cele întâlnite la conservarea produselor vegetale prin congelare sau uscare care nu au fost suficient opărite pentru inactivarea enzimelor. La conservele cu gust şi mirosuri străine, dar sterile din punct de vedere microbiologic s-a constatat activitate peroxidazică. Urmărirea activităţii peroxidazei trebuie să se facă imediat după sterilizare şi apoi, în timp, până la un an, deoarece s-au constatat reactivări şi după patru luni de conservare.

Relaţia timp-temperatură se stabileşte pentru fiecare tip de conservă în parte. Ea este influenţată de forma, capacitatea şi materialul ambalajului şi de natura produsului vegetal de conservat.

Peroxidaza din lapte are o temperatură de inactivare ridicată, circa 80 o C. Proba peroxidazică este folosită pentru a deosebi laptele fiert şi cel pasteurizat la temperatură ridicată, de cel pasteurizat la temperatură joasă, sau cel pasteurizat după metoda Stassano (15 secunde la temperatură cuprinsă între 73 o C – 75 o C). Proba peroxidazei este cunoscută sub numele de proba Storch p – fenilen – diamina.

O variantă a acestei metode numită proba cu sare şi piper propusă de Tillmans foloseşte ca reactiv un amestec solid sub formă de praf format din p – fenilen – diamină şi peroxid de bariu. Amestecul este pus într-o sticluţă cu capac perforat din care praful se poate presăra pe lapte prin scuturare. Laptele crud, pasteurizat la temperatură joasă sau după procedeul Stassano prin presărare de reactiv dă o culoare albastră închisă.

Pentru sensibilizarea reactivului şi mărirea stabilităţii s-a recomandat adăugarea în plus de bisulfit de sodiu şi guiacol. Laptele fiert sau pasteurizat la temoeratură ridicată nu dă nici o coloraţie.

11

12