L I P I D E L E Lipidele sunt compui organici naturali larg rspndii n organismele vii. Din punct de vedere al structurii lor lipidele constituie o clas eterogen de compui, n general, esteri ai alcoolilor ( trioli, steroli, alcooli, superiori) cu acizi grai superiori. Lipidele se clasific n: - lipide simple (gliceride, steride, ceride, etolide); - lipidele complexe (heterolipide) subdivizate n: glicerofosfolipide fr azot (acizi fosfatidici, inositofosfatide) i cu azot (gliceroaminofosfatide: lecitine, cefaline, serinfosfatide) i lipide derivate. Lipidele constituie o important surs energetic; au rol plastic, intrnd n structura diferitelor componente celulare i subcelulare, n structura membranelor celulare (n asociaie cu proteinele); au rol de protecie mecanic i termic prevenind uscarea dermei; n diferite procese metabolice. Structura lor hidrofob apolar explic insolubilitatea n ap i solubilitatea lor n solveni organici (eter, cloroform, benzen, tetraclorur de carbon, aceton, alcool) i amestecuri ale acestora. Extracia i determinarea lipidelor din plante. Metoda Soxhlet La baza extraciei, separrii i determinrii lipidelor se afl solubilitatea diferit a acestora n diferii solveni organici. Amestecul extras, rmas dup ndeprtarea solventului, constituit din lipide, ceruri, rini, uleiuri eterice, pigmeni vegetali .a. constituie ceea ce se numete grsimi brute. Extracia grsimilor n solveni se realizeaz cu ajutorul extractorului Soxhlet, iar determinarea se face prin dou metode: - metoda direct (gravimetric), care const n cntrirea reziduului dup extracie i dup ndeprtarea solventului; - metoda indirect, care const n stabilirea substanei extrase ca diferen intre masa materialului nainte de extracie i dup extracie. Determinarea coninutului de grsimi prin metoda direct Se cntresc la balana analitic 5-10 g (m1) din materialul uscat la 950 C i se introduc n cartuul de hrtie poroas, care se plaseaz n extractorul aparatului Soxhlet, dup ce a fost adus n prealabil la pondere constant. - Se cntresc, tot la balana analitic, balonul curat i uscat n care s-a introdus o bucic de porelan poros, pentru reglarea fierberii. - Se introduce solventul ales pentru extracia cu ajutorul unei plnii n extractor, peste cartuul de extracie cu ncrctura sa, intr-o cantitate care s realizeze o sifonare, i n plus, cu exces de 20-30 mL. - Se monteaz refrigerentul ascendent i se ncepe nclzirea pe baia de ap electric; Prin nclzirea balonului vaporii de solvent ajung n refrigerent, unde se condenseaz i cad n cartuul cu material, extrgnd o parte din substanele solubile n solventul ntrebuinat. - Nivelul solventului din extractor crescnd mereu, n momentul n care fig. 28 ajunge la nlimea cotului turbuorului de sifonare se va scurge, prin sifonare, atrennd deci i o parte din lipide (plus alte substane amintite) produsului analizat (fig. 28). Solventul din balon distilnd, va urma, n continuare, acelai drum (refrigerent-extractor) transportnd o nou cantitate de substan extras. -

Dup 15-20 sifonri (3-4 ore) se ntrerupe nclzirea; dup rcire se demonteaz balonul, se ndeprteaz solventul, prin distilare, se usuc balonul ntr-o etuv la 1050 C pn la pondere constant, stabilit la balana analitic, dup prealabila rcire (cam 1/2 or) ntr-un exicator cu CaCl2 anh. Calculul: Coninutul de substan extras (grosime brut) se stabilete efectund diferena dintre masa balonului cu reziduul de extracie (mr) i masa balonului gol (m0), dinaintea extraciei. Raportat la 100 g material analizat: % lipide (grsime brut) = Pentru a verifica dac a fost extras ntreaga cantitate de grsimi ar fi necesar repetarea operaiilor i compararea rezultatelor. Dac nu este cunoscut coninutul aproximativ de lipide al materialului analizat i corelarea timpului de extracie (numrul de sifonri) cu acest coninut nu a fost corespunztoare pot aprea diferene. Lipidele sunt caracterizate, din punct de vedere fizic i chimic printr-o serie de constante (densitatea, punct de solidificare .a.) i indici (indicele de aciditate, saponificare i de iod). Determinarea indicelui de aciditate Indicele de aciditate reprezint cantitatea de KOH, n mg, necesar pentru neutralizarea acizilor grai liberi dintr-un gram de grsime. Grsimile naturale sunt neutre. Aciditatea lor apare n timpul conservrii sau prelucrri, cu urmare a aciunii O2, din aer i a vaporilor de ap, proces care poate fi reprezentat, n general, prin reacia:

Indicele de aciditate stabilit la date diferite d indicaii asupra intensitii procesului de degradare a grsimii. Principiul metodei: Metoda de determinare a indicelui de aciditate se bazeaz pe reacia de neutralizare a acizilor grai liberi cu KOH de titru cunoscut, n prezena unui indicator (fenolftaleina). Reacia de baz: R-COOH +KOH = R-COOK +H2O Reactivi necesari: soluie KOH 0,1 N; amestec de alcool i eter 1:2 sau alcool i benzen 1:2; soluie alcoolic 1% de fenolftalein. Modul de lucru: ntr-un flacon Erlenmayer de 100-150 mL se cntresc 3-5 grame (sau un volum de 2 mL de ulei cu densitatea cunoscut), care se dizolv n 20 mL alcool + eter neutralizat. Se adaug 2-3 picturi de fenolftalein i, sub agitare, se titreaz cu o soluie KOH 0,1 N pn la roz persistent timp de un minut. Dac n timpul titrrii amestecul se tulbur, se nclzete uor prin cufundarea vasului ntr-o baie de ap cald.

Calculul: Cunoscnd c 1000 mL soluie KOH 0,1 N conine i deci 1 mL g KOH = 5,6104 g 5,6014 mg KOH

precum c i la titrarea probei de grsime (m grame) consumat V mL soluie KOH, n care se afl V5,6104 mg KOH, atunci numrul de mg KOH corespunztor la un gram grsime, adic indicele de aciditate, va fi dat de formula care rezult din acest raionament: la m g grsime........................ V5,6104 mg KOH 1 g grsime........................ x = indice de aciditate indicele de aciditate = 5,6104 g KOH corespunde la 1 mL KOH 0,1 N. Determinarea indicelui de saponificare Indicele de saponificare exprim cantitatea de KOH, n mg necesar pentru a saponifica total, un gram de grsime. Indicele de saponificare d indicaii asupra constituiei chimice a grsimii cercetate, i anume, cu ct masa molecular a grsimii (lipidelor) respectiv a acizilor grai superiori coninui, este mai mare, indicele de saponificare este mai mic. Exemple: trioleina din uleiuri vegetale = 192; untul = 126; nuca de cocos = 245. Principiul metodei: La baza metodei de determinare a indicelui de saponificare se afl reacia de saponificare la cald a acizilor grai liberi i a celor esterificai cu alcooli, din lipide, cu ajutorul KOH. Aceast cantitate va fi dat de diferena dintre o cantitate de KOH cunoscut, aleas arbitrar, i cantitatea rmas nereacionat, determinat prin titrare cu HCl de concentraie cunoscut. Reacia care are loc:

Reactivi necesari: soluie alcoolic de KOH, aprox. 0,5 N (sau N/2); soluie de HCl 0,5N (sau N/2); soluie alcoolic de fenolftalein. Modul de lucru: ntr-un flacon Erlenmayer de 150 mL se cntresc 1-2 g grsime sau 2 mL ulei (cu densitatea cunoscut) peste care se adaug 25 mL KOH 0,5 N, msurat exact cu o biuret. Flaconul se acoper cu un dop prin care trece un refrigerent ascendent. n paralel se face o prob martor, tot ntr-un balon de saponificare (sau balon Erlenmayer cu tub ascendent) n care se iau tot 25 mL KOH. Ambele flacoane se aeaz intr-o baie de ap electric, se aduce la fierbere i se menin n aceste condiii 30 de minute.

-

Fiind calde, le se adaug 2-3 picturi de fenolftalein i se titreaz cu o soluie de HCl 0,5 N pn la ultima pictur de acid care determin dispariia culorii roz-roii a fenolftaleinei, n mediul alcalin.

Calculul: Notnd: V1 = volumul de HCl 0,5 N consumat la titrarea probei martor (fr lipide), mL; V2 = volumul de HCl 0,5 N consumat la titrarea probei de lipide + KOH 0,5N adugat din care o parte reacioneaz cu lipidele V1-V2 = volumul de KOH ntrebuinat la saponificare, exprimat prin volume egale de HCl utilizat la titrare, fiind de aceeai normalitate tiut fiind c: V1N1 = V2N2 i cnd N1 = N2 V1 mL KOH = V2 mL HCl

tiind c 1000 mL soluie KOH 0,5 N conin 56,104/2 = 28,052 g KOH i c 1 mL 0,02805 g KOH = 28,05 mg KOH atunci V1-V2 mL cons. la titrarea probei care conine m grame grsime = (V1-V2). 28,56 mg KOH iar pentru 1 = x (indicele de saponificare) indicele de saponificare = 28,052 reprezint titrul HCl N n raport cu KOH, respectiv, numrul de mg KOH corespunztor la 1 mL HCl, n cazul cnd f = 1, adic volumul V1 mL KOH 0,5 N este neutralizat la titru exact cu V2 mL KOH 0,5 N. Dac aceast coresponden nu se constat se introduce factorul fHCl iar formula de calcul al indicelui de saponificare devine: indicele de saponificare =

Determinarea indicelui de iod. Metoda Hanus Indicele de iod exprim cantitatea de iod, exprimat n grame pe care-l poate fixa, prin adiie, 100 grame lipid. Valoarea indicelui de iod caracterizeaz gradul de neutralizare al lipidelor, respectiv proporia de acizi grai superiori nesaturai prezeni n structura lipidelor. Orientativ grsimile vegetale au indicele de iod cuprins ntre 30 i 60; grsimile animale au indicele de iod sub 90. Uleiurile de in, cnep, nuc (uleiuri sicative) au indicele de iod peste 120; uleiul de floarea soarelui (semisicativ) are indicele de saponificare ntre 127-136. Variaia ntre anumite valori a indicelui de iod, chiar peste acelai material analizat, este corelat cu dependena acestui indice de gradul de maturitate al seminelor sau fructelor din care se extrage, de modul de pstrare, vechime. nvechirea materialului extras (grsime, ulei) nsoit de afectarea numrului de duble legturi, prin oxidare, atrage modificarea indicelui de iod. Principiul metodei: La baza metodei se afl reacia de adiie a iodului i bromului din monobromura de iod (reactivul Hanus) la dublele legturi cuprinse n structura acizilor grai superiori din materialul analizat.

Indicele de iod se determin pe cale iodometric prin msurarea cantitii de iod rezultate din reacia BrI nereacionat cu KI, folosind ca reactiv o soluie de Na2S2O3 (tiosulfat de sodiu), cu concentraie cunoscut. Reaciile care au loc:

BrI + KI = I2 + KBr I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6 tetrationatul de sodiu Reactivi necesari: reactivul Hanus; Soluie de KI 10%; soluie de Na2S2O3 0,1 N; soluie de amidon 1%. Modul de lucru: ntr-un flacon Erlenmayer cu dop rodat de 200 mL se introduce o prob de 0,2-0,4 g ulei (sau un volum corespunztor calculat cu densitate cunoscut), care se dizolv n 15 mL cloroform (se lucreaz sub ni i nchiznd ori ce surs de nclzire cu flacr deschis). Se adaug 15 mL reactiv Hanus, msurat cu biureta i se las la ntuneric timp de 15 minute. n paralel se face o prob martor, deci indic cu prisma (15 mL cloroform + 15 mL reactiv Hanus), fr materialul de analizat, i se las la ntuneric acelai timp. Dup timpul de ateptare pentru desvrirea reaciei, se adaug n ambele flacoane cte 15 mL soluie de KI 10 % i 25 mL ap distilat; n ambele flacoane are loc reacia de punere n libertate a iodului. IBr + KI = I2 + KBr desigur n cantiti diferite, avnd n vedere c n flaconul cu prob de grsime (ulei) o parte din Ibr participat la reacia de adiie corespunztoare. Iodul eliberat se trateaz cu soluie de Na2S2O3 de titru cunoscut, n dou etape: - n prima etap, fr s fi adugat indicator (amidon), pn la transformarea culorii portocalii (mai mult sau mai puin intense, funcie de cantitatea de iod prezent) n galben; - n a doua etap, titrarea se face, n continuare, n acelai flacon, n prezena amidonului, pn la dispariia culorii i nuanei albastre. Calcul:

-

-

Notnd: V1 = mL Na2S2O3 0,1 N cunoscut la proba martor; V2 = mL Na2S2O3 0,1 N cunoscut la proba cu grsime (ulei); Diferena V1-V2 = numrul de mL Na2S2O3 corespunztoare cantitii de iod consumat n reacia de adiie la dubla legtur coninut de proba de grsime (ulei). Din ecuaia reaciei: I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6 calculat pe baza sistemului de ecuaii electronice:

rezult echivalenii reaciilor:

substanele reacionnd n cantiti proporionale cu echivalenii lor, la g corespund ................. = 248,23 g innd seama de concentraia reactivului (0,1 N), nseamn c la E/10 Na2S2O3 n 1000 mL soluie corespunde la E/10 I2 = 12,69 g I2

iar la

1mL

g I2

iar la V1-V2 mL Na2S2O3 utilizat la titrarea I2 corespund la proba de m g grsimex x = (V1-V2)0,01269 g iod innd seama de definiia indicelui de iod (g iod/100 g grsime): dac pentru m g prob grsime corespund (V1-V2)0,01269 I2 100 g x = indicele de iod indicele de iod = n cazul utilizrii, ca reactiv, a unei soluii aproximativ 0,1 N de tiosulfat de sodiu este necesar introducerea factorului de normalitate al soluiei, deci: Indicele de iod = unde: V1 = mL tiosulfat de sodiu consumat la titrarea probei martor; V2 = mL tiosulfat de sodiu consumat la titrarea probei cu grsime; (reac) = factorul soluiei de tiosulfat de sodiu = 0,1 N; 0,01269 = titrul soluiei de tiosulfat de sodiu 0,1 N n raport cu iodul (numrul de grame de iod corespunztor unui mL de tiosulfat de sodiu 0,1 N). Determinarea indicelui de peroxizi Peroxizii sunt compui care se formeaz n faza iniial a procesului de oxidare al grsimilor, la care se adaug apoi combinaiuni epoxidice, aldehide, cetone, conferind miros i gust caracteristic, neplcut de rnced. Indicele de peroxizi se exprim prin numrul de grame de iod pus n libertate de un gram de lipide, sau avnd n vedere reactivul utilizat pentru dozarea cantitativ a iodului, tiosulfatul de sodiu, indicele de peroxizi se mai poate definii prin numrul de mL de tiosulfat de sodiu 0,01 N consumat pentru determinarea (titrare) iodului eliberat de peroxizii dintr-un gram de lipide. Principiul metodei: La baza metodei se afl reacia dintre peroxizi i KI, n mediu slab acid, nsoit de o cantitate echivalent de iod care se elibereaz i se titreaz cu tiosulfatul de sodiu:

I2 + 2 Na2S2O3 = 2 NaI + Na2S4O6 Reactivi necesari: soluie de Na2S2O3 0,01 N; soluie saturat de KI; acid acetic glacial + Cloroform 1:2; amidon 1%.

Modul de lucru: - ntr-un flacon idometric (sau Erlenmayer cu dop rodat) se cntrete cam 1 g grsime peste care se adaug 20 mL amestec de acid acetic glacial i cloroform 1:2 i 1 mL soluie saturat de KI; Se agit bine. - n paralel se pregtete o prob martor, cu aceeai cantitate de reactivi, fr prob de grsime. - Ambele probe se in 3 minute la ntuneric dup care li se adaug 20 mL ap distilat i se titreaz cu tiosulfat de sodiu 0,01 N, n dou etape ca i n cazul determinrii indicelui de iod. Calcul: Indicele de proxid = Unde: V = mL tiosulfat de sodiu 0,01 N consumat la titrarea probei cu grsime; Vm = mL tiosulfat de sodiu 0,01 N consumat la titrarea probei martor; m = masa probei de grsime luat n analiz, grame; sau: Indicele de peroxid = 0,001269 = g/mL = titrul soluiei de Na2S2O3 0,01 N n raport cu iodul.

P R O T I D E Protidele sunt componente structurale i funcionale cele mai importante ale organismelor vii. Prezente n toate organismele animale i vegetale, protidele ndeplinesc multiple roluri: structural (constituent principal al protoplasmei i nucleului celular); fizico-chimic (regulator al echilibrului electrostatic acido-bazic); catalitic (componeni proteici ai biocatalizatorilor); energetic (furnizor de energie). n mod convenional, n grupul protidelor sunt cuprinse toate substanele naturale care prin hidroliz total pun n libertate aminoacizi. innd seama de complexitatea structurii, protidele se clasific n: - monoprotide = aminoacizii: - poliprotide: - inferioare: - oligopeptide (2-10 aminoacizi); - polipeptide (10-100 aminoacizi); - peptone i albumoze; - superioare = PROTEIDE: - holoproteide = PROTEINE - heteroproteide: glico-, lipo-, nucleo-proteide. Cele mai simple proteide sunt deci, aminoacizii, reprezentai prin formula general:

Toate celelalte protide sunt constituite din resturi de aminoacizi legai prin legturi peptidice: - CO NH Obinerea extractelor proteice - de origine vegetal: 50 g fin de gru se amestec cu 200 mL ap i se las s stea 30-40 minute, agitnd din cnd n cnd. Se filtreaz. Primele poriuni tulburi se retoarn pe filtru; - de origine animal: la 100 mL lapte se adaug un volum egal de ap i apoi, sub agitare, 0,5-0,6 mL acid acetic glacial, pn la formarea unui precipitat floconos. Dup 5-10 minute amestecul se filtreaz pintr-o pnz umezit n prealabil. Primele cantiti de filtrat, tulburi, se refileaz. Soluia limpede puin glbuie, conine albumin i o parte din globuminele din lapte. Reziduul de pe filtru este format din cazein amestecat cu grdimi. - Laptelui proaspt i se adaug un volum egal de soluie saturat de sulfat de amoniu (NH4)2SO4. Precipit cazeina i globulinele, antrennd grsimi. Suspensia se filtreaz pe hrtie de filtru. - Albuul unui ou de gin se agit bine cu 100-150 mL ap distilat. Suspensia opalescent astfel obinut se filtreaz pe o pnz udat cu ap, din care s-a ndeprtat apretul, prin splare. - O soluie concentrat de proteine se obine dintr-un albu de ou la care se adaug 5-6 g NaCl. Se agit puin i se pune ntr-un vas de 500 mL agitndu-se nc puin. O soluie diluat se obine din aceast soluie la care se adaug un volum de 2-3 ori ap distilat. Reacii pentru identificarea protidelor 1. reacii de precipitare n cte o eprubet se iau cte 1-3 mL soluie proteic la care se adaug, separat urmtorii reactivi: Reactivul adugat Aspectul i comportarea produsului de reacie a. Alcool diluat sau aceton Dup agitare rezult un Solubil n ap distilat, sub diluat precipitat floconos agitare

b. soluie de sulfat de amoniu sau de Mg, Na a. prin nclzire la peste 600 C b. ACZI MINERALI concentrai: HCl, HNO3, H2SO4

Apare o tulbureal sau fulgi care se depun Se formeaz un ppt. floconos (coagul) Precipit la nivelul de separare a celor dou lichide

La diluare cu ap ppt. se redizolv Fenomen ireversibil Prin agitare clarific sistemul se

HNO3 concentrat c. Acizi organici: tricloracetic, sulfosalicilic, naftalinsulfonic; d. Reactiv Esbach e. Sruri ale metalelor grele (Pb, Cu, Hg, Ag) n soluii 0,5-3% f. Soluie apoas saturat de tanin, n prezena: acid acetic 1%, acid picric,fenol

Precipitat galben Precipitat abundent

Insolubil prin agitare n exces de reactiv Insolubil prin agitare

Precipitat galben Precipitat alb

Insolubil prin agitare Solubil n exces de reactiv, cel de Pb i Cu. Insolubil cel de Hg i Ag Precipitat galben, respectiv, Insolubil n exces de reactiv alb

Coagularea la punctul izoelectric Moleculele substanelor proteice au caracter amfoter datorit grupelor funcionale pe care le conin. La punctul izoelectric, sau pH-ului izoelectric, cnd numrul sarcinilor pozitive i negative devin egale, ca urmare adugrii unui acid sau baze, are loc precipitarea soluiei proteice.

Punctul izoelectric este o constant fizico-chimic caracteristic fiecrei proteine (ex. gelatina = 4,6; cazeina = 4,7). Determinarea punctului izoelectric al gelatinei Reactivi necesari. amestec tampon; soluie de gelatin. Modul de lucru - n 6 eprubete se realizeaz amestecul tampon corespunztor pH-ului cuprins ntre 4,1 i 5,6, prin amestecarea soluiilor componente n raportul indicat n tabelul 23. Tabelul 23 Nr. pH-ul CH3COOH CH3COONa ap Total volum eprub. distilat. 0,1 N mL 0,1 N mL 1. 4,1 1,2 4,8 6 mL 2. 4,4 2 4 6 mL 3. 4,7 2 2 2 6 mL 4. 5,0 2 1 3 6 mL 5. 5,3 2 0,5 3,5 6 mL 6. 5,6 2 0,25 3,75 6 mL - Se adaug n fiecare eprubet cte 2 mL soluie de gelatin 1% i aproximativ 8 mL alcool

(cu o pipet), agitnd puternic pn la apariia unei tulbureli albe. - Se las n repaus 30 minute i se noteaz n care eprubet s-a format cea mai mare cantitate precipitat. Valoarea pH-ului corespunztor eprubetei cu cea mai mare cantitate de precipitat reprezint (punctul izoelectric) pH-ul gelatinei. 2. Reacii de culoare pentru identificarea proteinelor Aproape roate reaciile de culoare se datoresc anumitor aminoacizi existeni n proteine: Numele reaciei Modul de lucru Aspectul produsului de (reactivului) reacie a. Reacia biuretului La un mL soluie puternic Culoare albastr-violet alcalin se adug 3 picturi soluie dil.de CuSO4 1%. Se va evita excesul de CuSO4 de oarece se formeaz ppt. de Cu(OH)2 care marcheaz culoarea violet Reacia biuretului se datorete legturilor peptidice. Identificarea se poate realiza i pe seciuni de material biologic (cartofi, mazre semine de gru, .a. dup 20 minute. b. Reacia La 2-3 mL soluie proteic se ppt. alb, fierbere se xantoproteic adaug 2-3 mL HNO3 conc. solubilizeaz i coloreaz galben. Sub aciunea NH4OH soluia devine portocalie. Reacia este datorat formrii nitroderivailor aromatici (triptofan, tirozina, fenilalanina .a. Se poate executa i pe materialul vegetal.

c. Reacia Millon

La 3 mL soluie proteic se Precipitat alb. La nclzire adaug 1 mL reactiv Millon devine rou. (Hg(NO3)2 n HNO3

Reacia este datorat aminoacizilor cu grup fenolic d. Reacia Soluia proteic cuagulat Culoarea violet-brun Libermann prin nclzire + 5 mL HCl conc. se fierbe pn la dizolvarea precipitatului. e. Reacia Soluia proteic alcanilizat Culoare roie-carmin. Sakaguchi cu NaOH 10 % + NaBrO Dispare la cald. (hipobromit de Na) + naftol + ap pn la 1000 mL. Hidroliza substanelor proteice Prin hidroliz acid, alcalin sau enzimatic substanele proteice se desfac treptat n compui mai simpli. n hidrolizatul complet al substanelor proteice se pot gsi, pe lng

aminoacizii constitueni i substane de natur neproteic reprezentnd grupri prostetice ale heteroproteidelor. Hidroliza acid a gelatinei Reactivi necesari: gelatin solid sau n soluie; HCl conc.; H2SO4 25%; NaOH 20-30%; CuSO4 5%, AgNO3 5%. Modul de lucru - ntr-un balon sau flacon Erlenmayer cu lif de 150-300 mL, prevzut cu refrigerent ascendent se iau 20-30 mL soluie de gelatin (sau 30-40 ggelatin solid) peste care se adaug 20-25 mL HCl conc. sau H2SO4 25%. Se las un timp, agitnd din cnd n cnd pn ce gelatina se dizolv complet. - Se nclzete pe baia de ap, sub ni; de obicei soluia se coloreaz n violet-violet intens sau negru-brun, datorit substanelor humice care se separ uneori. Din cnd n cnd, dup o or de nclzire, se iau cte 1-2 mL din soluie, se fierb cu crbune animal n eprubet, se filtreaz, se precipit cu AgNO3, se filtreaz din nou iar n filtrat se execut reacia biuretului (vezi reaciile de culoare pentru identificarea proteinelor, pag 141). Funcie de cantitatea de substane proteice luate, hidroliza poate dura 1-7 ore. Hidroliza se consider complet cnd reacia biuretului este negativ. Dozarea aminoacizilor prin metoda SRENSEN Deoarece aminoacizii au caracter amfoter, gruparea acid nu poate fi titrat cu o baz dect dup ce gruparea amino a fost blocat printr-o reacie de condensare cu aldehid formic: Aminoacidul amfoter devine astfel un compus metilenic cu funcie carboxilic liber, care poate reaciona cu NaOH:

Reactivi necesari: soluie de aldehid formic 20%, neutralizat cu NaOH n prezena unei picturi de fenolftalein; soluie de NaOH 0,1 N cu titru cunoscut; soluie de HCl 0,1 N; soluie alcoolic de fenolftalein. Modul de lucru a. Se cntresc 10 g material vegetal i se majoreaz cu 20 mL ap distilat cald (400 C); amestecul se trece cantitativ ntr-un cilindru gradat de 100 mL. Se aduce la cot cu ap distilat, se omogenizeaz i se las s stea cam 10 minute, agitnd din cnd n cnd pentru realizarea extraciei. Proba astfel pregtit se filtreaz printr-un filtru uscat ntr-un flacon Erlenmayer uscat i curat. Se iau, ntr-un flacon, 20 mL filtrat, se neutralizeaz cu NaOH 0,1 N n prezena fenolftaleinei, pn la slab roz persistent, se adaug 10 mL aldehid formic 20% i se titreaz cu NaOH 0,1 N pn la slab roz.

Calcul Cantitatea de aminoacizi, exprimat n % azot aminic (sau glicocol) se stabilete dup formula: % azot animic din aminoacizi = unde: V = mL NaOH 0,1 N utilizat la titrarea probei dup reacia de condensare cu aldehid formic; T = titrul soluiei de NaOH 0,1 N exprimat n azot sau glicocol (EN = 14; Eglicocol = 75) g/mL; m = masa de material vegetal analizat, g; d = diluia cu care s-a lucrat. b. Ca prob de analizat se poate utiliza i 10 mL din hidrolizatul acid obinut din gelatin. Se neutralizeaz, n prezena de fenolfutalein, cu NaOH 0,1 N pn la slab roz; se adaug 10 mL aldehid formic 20% (neutralizat n prealabil cu NaOH 0,1 N n prezena de fenolftalein) i se titreaz cu NaOH 0,1 N pn la slab roz. Calcul % aminoacid fa de =

volumul hidrolizat luat n analiz unde: V = mL NaOH 0,1 N consumat la titrare dup condensarea cu aldehid formic; f = factorul soluiei de NaOH; T= titrul aminoacidului considerat (Tglicocol = 0,75; Talanin = 0,008 g/mL. Separarea aminoacizilor dintr-un amestec prin cromatografie pe hrtie Reactivi i materiale necesare: - Amestec de 2-3 amonoacizi (1 mg/cm3, 0,1%); soluii etalon (de control) de aminoacizi (1mg/cm3); amestec de developare: n-butanol + acid acetic + ap (4:1:5); soluie de ninhidrin (0, 1-0, 2% n n-butanol); hrtie cromatografic Whatman nr.1; micropipete. Modul de lucru - Pe o foaie de hrtie cromatografic se traseaz cu creionul o linie paralel cu unul din capetele hrtiei la o distan de 20 cm de marginea hrtiei. - Pe aceast linie (start) se plaseaz, cu ajutorul unei micropipete o pictur din soluia de cercetat i separat, din soluia etalon, la cca. 2 cm interval. Se noteaz n prealabil aceste locuri. Diametrul picturilor trebuie s fie de 2-3 mm, iar cantitatea maxim de aminoacid ntr-o pat, n jur de 0,03 mg. - Hrtia cromatografic, cu petele uscate, se introduce n camera cromatografic, care conine un strat de amestec de developare de 2-3 mm grosime, astfel nct captul pe care au fost pui aminoacizii s ajung n acesta. Peretele aminoacizilor nu trebuie s intre n amestecul de developare. - Se las timp pn cnd frontul solventului ajunge la 1-2 cm de marginea superioar a hrtiei (developare ascendent); - Se scoate hrtia, se noteaz cu creionul frontul solventului, se usuc n etuv la 1000. - Se pulverizeaz cu soluie de ninhidrin i se introduce timp de10 minute ntr-o etuv la 900. - Se examineaz poziia i intensitatea culorii petelor aprute i se calculeaz Rf-urile. Valorile Rf-urilor ctorva aminoacizi n condiia experienei: - leucin 0,01 - alanina 0,24 - arginin 0,10 - fenilalanin 0,53 - ac. glutamic 0,17 - cisteina 0,08 - triptofan 0,43 - glicocol 0,17

N u c l e o p r o t e i d e Nucleotroteidele sunt heteroproteide constituite dintr-o component proteic i una neproteic, reprezentat de acizii nucleici. Acizii nucleici sunt polinucleotide macromoleculare, care prin hidroliz elibereaz acid fosforic H3PO4, o component glucidic (riboz sau dezoxiriboz) i componente azotate pirimidinice (citozina, uracilul, timina) i purinice (adenina, guanina). Datorit coninutului relativ mare de resturi fosforice nucleoproteidele au caracter acid. De aceea pentru extracie din materiale biologice (vegetale sau animale) se folosesc soluii diluate de hidroxizi. Extracia nucleoproteidelor din drojdia de bere Reactivi necesari: drojdie de bere; soluie de NaOH 0,4%; soluie de HCl 10%. Modul de lucru - O cantitate de 25 g drojdie de bere se majoreaz cu aproximativ 5 g nisip sau praf de sticl, 5 mL eter (pentru dizolvarea grsimilor) i 5 mL ap distilat. - Dup majorare se adaug o cantitate mic de ap distilat pn se obine o past omogen. - Se trece ntr-o sticl cu dop rodat se adug 100 mL NaOH 0,4%, puin toluen (pentru conservare) i se las s stea cteva zile, agitndu-se din cnd n cnd; - Dup acest timp se filtreaz. Reziduul se arunc iar din filtrat se separ nucleoproteidele prin precipitare cu o soluie de HCl 10%, adugat cu pictura, sub continu agitare, n prezena indicatorului rou de Congo. Se consider precipitarea complet la virarea culorii indicatorului n albastru. Nucleoproteidele se depun i se separ apoi de supernatant prin decantare. Hidroliza nucleoproteidelor din drojdia de bere Prin hidroliz acid nucleoproteidele se desfac n componentele lor care pot fi identificate apoi prin reacii chimice specifice. Se pot folosi n acest scop fie nucleoproteidele separate din drojdia de bere, fie direct drojdia de bere. Modul de lucru A. Dac hidroliza se face direct pe drojdia de bere, se iau ntr-un flacon Erlenmayer 5 g drojdie i 40 mL soluie H2SO4 25% i se fierbe timp de o or pe baia de ap. - Dup rcire se filtreaz. Filtratul se utilizeaz pentru reacii de identificare a componentelor nucleoproteidelor. B. Dac se utilizeaz precipitatul de nucleoproteide obinut dup dup extracie se fierbe, ntr-un Erlenmayer cu 50 mL H2SO4 5%, timp de o or. - Dup rcire hidrolizatul astfel obinut se utilizeaz pentru identificarea componeniilor rezultai. Identificarea produselor de hidroliz a nucleoproteidelor 1. pentru identificarea proteinelor se execut reaciile prezentate (pag. 139) ncepnd cu reacia biuretului (legturile peptidice). 2. Pentru identificarea componentelor glucidice se execut reaciile corespunztoare (pag. 106, respectiv: Molish, Fehling, Tollens, .a.). 3. Pentru identificarea acidului fosforic H3PO4, se execut reacia cu molibdat de amoniu (NH4)2MoO4, luat ntr-o eprubet 1 mL hidrolizat, 2 mL HNO3 conc. i 2 mL soluie de molibat de amoniu 5%. Dup nclzire se formeaz un precipitat galben fin, de fosfomolibdat de amoniu. H3PO4 + 12(NH4)2MoO4 + 21HNO3 = (NH4)3H4/P(MoO4)6/ + 21NH4NO3 + 10H2O

4. Bazele purinice se pun n eviden adugnd unei cantiti mici de hidrolizat (1-2 mL), amoniac concentrat pn la reacia alcalin. Precipitatul se filtreaz. n filtrat se adaug cu pictura i sub agitare cca. 1 mL AgNO3 5%. Rezult un ppt. galben-brun. PIGMENI NATURALI VEGETALI Pigmenii naturali vegetali sunt substane organice cu structur chimic variat, care determin culoarea diferitelor organe ale plantelor. Separarea i identificarea lor se realizeaz prin adsorbie cromatografic. Pricipiul metodei Extras cu un solvent adecvat, amestecul de pigmeni este trecut printr-o coloan cromatografic de material adsorbant. Adsorbindu-se diferit, fiecare pigment se plaseaz ntr-o anumit zon a coloanei, marcat prin culoarea corespunztoare. Reactivi necesari - solveni extractani: CCl4 + CH3OH sau aceton + amestec de eter de petrol + aceton 4:1 - coloana de adsorbie: tub de sticl efilat la un capt, loc n care se introduce un dop de vat), de 14-20 cm, diametrul de 1 cm n care se introduce material de adsorbie; - material de adsorbie: o Aa2O3 ca strat sau Mg n start omogen, omogen de 2 cm 1,5-2 cm; nlime zahr fin mcinat, o CaCO3 uscat, 4 cm n rest. o zahr fin pulverizat i uscat, 6 cm; o vat de sticl. Modul de lucru Pentru prepararea extractului de pigmeni, materialul vagetal (frunze proaspete) se tritureaz ntr-un mojar cu puin nisip, n prezena solveniilor de extracie alei. Dup un timp necesar desvririi procesului de extracie (cca. o or) amestecul se filtreaz pintr-un strat de vat ntr-o plnie de separare. Reziduul se spal cu acelai amestec de solveni de 2-3 ori. Prin adugare de ap distilat se separ dou straturi: alcoolul (respectiv acetona) rmnnd n stratul opus, iar pigmenii trec n stratul superior de CCl4 (respectiv, eter). Se ndeprteaz stratul opus i se continu splarea pentru ndeprtarea complet a componentei solubile n ap. Se ndeprteaz urmele de ap din solventul extractat (care cuprinde pigmentul) adugnd Na2SO4 anhidru, cristalizat i, agitnd pn la limpezirea complet a soluiei. Se trece soluia limpezit n coloana cromatografic dup prealabila umectare cu solventul care cuprinde pigmenii: CCl4 (respectiv eter); se cupleaz coloana la gura flaconului Eelenmayer cu tromp i se regleaz jetul de ap ca s se realizeze doar un vid foarte slab n timpul turnrii solventului. Se toarn n poriuni mici extractul cu pigmeni; pe msur ce extractul de pigmeni strbate coloana ncepe formarea zonelor colorate. Aceste zone se delimiteaz i mai bine (se developeaz) dac dup ce tot extractul a fost trecut n coloana cromatografic se spal cu nc 1-2 mL solvent extractant (CCl4, respectiv, eter). n partea inferioar a coloanei n zona ngust galben se afl caroten, corespunznd startului de Al2O3 (respectiv MgO). O alt zon, tot galben, care conine xantofil, se delimiteaz n stratul de CaCO3. n partea superioar a coloanei, cu umplutura de zahr, se formeaz o zon galbenverzuie de clorofil b, iar sub ea o zon verde-albstruie de clorofil a. Prin trecerea prin coloan a unui amestec de eter de petrol-benzen 4:1, clorofila a se separ de clorofila b iar carotenoidele ies din coloan fiind colectate ntr-un flacon Erlenmayer (fig. 78).

Dup ce developarea este terminat se usc coloana ntr-un curent de CO2, apoi zona se separ mecanic, fie dup ce se scoate din tubul de sticl (dac este posibil, alunec), fie o baghet efilat. Fiecare poriune, corespunznd uneia dintre clorofile, se colecteaz n cte o plnie mic de sticl n gtul creia se gsete puin vat. n final se euleaz, fiecare n cte un flacon mic Erlenmayer (2) i (3). Soluiile astfel obinute pot fi utilizate, mai departe, pentru spectrofotometrarea sau colorimetrarea. Separarea pigmenilor carotenoidici din morcovi prin metoda cromatografic pe coloan Materiale necesare: - coloan cromatografic: tub de sticl 14-20 mL/1 cm, umplut cu MgO + nisip foarte fin, n amestec 1:2; - reactivi necesari: aceton + eter de petrol 1:1; eter de petrol + eter etilic; eter de petrol + alcool etilic 10:1; Na2SO4 anhidru. Modul de lucru: a. Extracia pigmenilor ntr-un mojar se tritrureaz aproximativ 5 g morcov mrunit prin rztoare cu aproximativ 10 g nisip i 10 g Na2SO4 anh. Extracia se realizeaz adugndu-se, n mojar, un amestec de aceton + eter de petrol 1:1. - Extractul filtrat se trece ntr-o plnie de separare. - Se adaug ap distilat. Are loc separarea n dou straturi: pigmenii carotenoidici rmn n stratul de deasupra (eteric); n stratul inferior, ap + aceton. - Dup ndeprtarea stratului inferior se continu splarea extractului carotenoidic cu ap distilat pentru a completa ndeprtarea a acetonei. - Extractul carotenoidic se usc cu Na2SO4 sicc. i se trece pe coloan conectat la un flacon Erlenmayer cu tromp. La partea inferioar a coloanei apare o zon ngust galben de alfa-caroten, urmat de o zon mai lat de beta-caroten. La partea superioar a coloanei rmn ali pigmeni carotenoidici cum sunt: licopina, criptoxantina, luteina, zeaxantina. Prin developarea cu eter de petrol, alfa-carotenul se separ de bata-caroten. Developarea se face cu eter de petrol. Prin developare cu un amestec de eter de petrol- eter etilic (crescnd succesiv Cantitatea de eter pn la 25%) se separ xantofilia. Eluarea se face utiliznd amestecul de eter de petrol + alcool etilic 10:1 pentru alfa i beta caroten, sau alcool etilic, pentru xantofil. Soluiile astfel obinute pot servi pentru determinarea de spectre sau determinri Colorimetrice. V I T A M I N E Vitaminele sunt substane chimice organice sintetizate i foarte rspndite n regnul vegetal, ndeplinind rol de coeziune (pri constitutive ale enzimelor). Ca substane biologic active ele influeneaz desfurarea normal a proceselor metabolice. Organismele animale i procur aceste substane, absolut indispensabile funcionrii lor normale, din regnul vegetal fie ca atare (ca vitamine), fie sub form de provitamine.

Grupate pe criteriul solubilitii lor, vitaminele pot fi liposolubile (A, D, E, K) i hidrosolubile. Din punct de vedere al structurii lor chimice sunt foarte diferite unele de altele, ceea ce explic lipsa unor reacii comune pentru identificarea i dozarea lor. 1. Vitamina i provitamina A Determinarea calitativ Materialul vegetal (morcov) mojarat + civa mL soluie alcoolic de KOH 5% se trece ntr-o plnie de separare, se adaug 10 mL cloroform i se agit bine. Dup separarea fazelor, faza cloroformic se trece ntr-o eprubrt uscat i se agit cu Na2SO4 anh. Se las s sedimenteze dup care se adug cteva picturi pe o hrtie de filtru. Se formeaz o pat galben (caroten, vitamin A). Dup uscarea petei se adaug cteva picturi de soluie cloroformic de SbCl3. Se obine o culoare albastr. 2. vitamina C Determinri calitative a. Vitamina C reduce fericeanura de potasiu. Vitamina C (acidul ascorbic) + K3/Fe(CN)6/ acidul dehidroascorbic + K4/Fe(CN)6) b. Vitamina C reduce Cu2+ din reactivul Fehling Cu2O rou c. Vitamina C reduce Ag+ (reacia Tollens) Ag (oglind de argint) d. Vitamina C reduce Mn din KMnO4 decolornd astfel soluia apoas, violet, a acestuia. e. Soluia apoas de vitamin C (1:100) + 2 picturi de nitroprusiat de sodiu Na2/Fe(CN)5NO/ + 3 picturi de soluie KOH 1 N determin apariia unei culori galbenVerde-oliv, care prin tratare cu 3 picturi de acid acetic diluat devine albastr-verzuie. Determinarea cantitativ a vitaminei C Din punct de vedere chimi, vitamina C sau acidul ascorbic este lactona acidului 2-cetogulonic, avnd structura:

Se gseste aproape n toate produsele vegetale dintre care amintim: Mcese uscate 1500 mg/100 g material vegetal Nuci verzi 1200 zmeur 30 mg/100g coacze roii 130-170 fragi 30 catin alb 120-450 mure 30 coacze negre 140-300 mere 20-40 greep-fruit 40-65 afine 5 lmi 40-65 ciree 4-14 coarne (fructe) 50 Vitamina C care uor solubil n ap, alcool, glicerin, aceton. Grupele enolice, legtura dubl la C C explic proprietatea vitaminei C de a fi uor oxidat n contact cu O2 din aer, sau ali oxidani (ex. metale).

n solui acide la pH 5-6, vitamina C este destul de stabil, fapt luat n considerare la pregtirea materialului vegetal n vederea dozrii ei. Dozarea iodometric a vitaminei C Are la baz oxidarea ei cu iodul elementar rezultat n urma reaciei dintre iodatul de potasiu (KIO3) i iodura de potasiu (KI), n mediu HCl:

Substane necesare: soluie de KIO3 0,004 (N/250); soluie de KI !%, proaspt preparat; soluie de HCl 2%; amidon 1%; material vegetal de analizat (cartof, mr, fructe de mce, ctin, .a.). Modul de lucru a. Extragerea vitaminei C din materialul vegetal se face cu o soluie de HCl 2%. n acest scop. Se cntrete cu o precizie de 0,01 g (la o balan farmaceutic) o cantitate de 10 g material vegetal, care se introduce ntr-un mojar de porelan n care se afl cam 20 mL soluie de HCl 2% i 5-10 g nisip splat n prealabil cu HCl pn la comLeta ndeprtare a carbonailor (produc efervescen). Se majoreaz (tritureaz) bine avnd grije ca materialul de anlizat s fie permanent ferit de contactul cu aerul, deci s fie bine acoperit cu soluie de HCl. Masa omogen obinut se trece cantitativ (fr pierderi) ntr-un balon cotat de 1000 mL, mpreun cu apa (soluie de HCl) de splare a pistidului, mojarului, plnie. Se aduce la semn (cot) i se agit din cnd n cnd, timp de 10 minute, dup care se las s se depun suspensiile grosiere. Se filtreaz prin vat sau filtru curat ntr-un flacon conic uscat. b. Dozarea iodometric a vitaminei C - ntr-un flacon Erlenmayer se iau 10 mL exact filtrat, se adaug 30 mL ap distilat, 5 mL soluie KI 1% i 3-4 picturi de soluie de amidon, proaspt preparat, ca indicator. - Dup omogenizare se titreaz cu soluia de iodat de potasiu (din biuret) pn la apariia culorii slab albastr-cenuie, persistent cel puin 30 secunde. Calculul Considernd: = 214 i = 214/5 = 42,8 MVit.C = 176 EVit.C = 176/2 = 88,06 conform legii echivalenilor chimice (substanele reacioneaz n cantiti proporionale cu echivalenii lor chimici): la = 214/5 = 42,8 g KIO3 coresp. EVit.C = 176/2 = 88,06 g vit.C Dac la 42,8/250 din 1000 mL soluie 88,06/250 g vit.C = 0,352 La 1 mL soluie KIO3 (reactiv) corespund 0,352 mg vit.C Deci 0,352 reprezint titrul soluiei de KIO3 n raport cu vit: C Dac 1 mL soluie KIO3 corespunde la 0,352 mg vitamin C

Atunci V mL soluie KIO3 consumat la titrare corespund la V.0,352 mg vitamin C cuprins n cot parte din extract utilizat la titrare, adic 10 mL din totalul de 100 mL, cuprini n balon. n ntregul balon cu extract se afl deci V.0,35210 mL mg vit.C Pentru raportarea rezultatului la 100 mg material anlizat: Dac n m grame materia analizat avem V.0,35210 mL mg vit.C Atunci la 100 m grame materia analizat avem x X = % vitamina C = Obs. Prezena i a altor substane oxidabile care nsoesc vitamina C reduc gradul de precizie (cu erori n plus) al determinrii. Totui pentru determinri n serie, pe acelai produs, datele analitice obinute au valoare comparativ. ENZIME Enzimele sunt substane organice produse de celulele vii, care catalizeaz reaciile de biosintez i biodegradare din organismele plantelor, animalelor i microorganismelor, fapt pentru care se mai numesc biocatalizatori. Din punct de vedere structural enzimele sunt holoproteide (enzimele monocomponente) sau heteroproteide (enzimele bicomponente). Enzimele se caracterizeaz pintr-o serie de proprieti: formeaz i desfac legturi covalente n condiii compatibile cu viaa; au putere catalitic mult mai mare dect catalizatorii chimici; particip la aceste activiti n cantiti foarte mici .a. Activitatea enzimelor este influenat de o serie de factori: temperatura, pH-ul, prezena unor substane activatoare sau inhibitoare .a. Obinerea unui extract enzimatic de catalaz Catalaza este o enzim prezent n toate organismele vii. - Se iau 10 g produs care conine catalan (semine de gru, orz, cartofi, morcovi), se mrunesc bine, prin mojarare. - Se adaug 10 mL ap, cteva picturi de toluen i se las la temperatura camerei timp de o or, apoi se filtreaz. Filtratul astfel obinut va constitui extractul enzimatic cu care se va lucra n continuare. Studiul comparativ al activitii catalitice a catalazei n raport cu ali catalizatori chimici (ex.FeCl3) n dou eprubete se iau cte 2 mL ap oxigenat H2O2 n prima eprubet: n a doua eprubet: se adaug cteva picturi de extract enzimatic se adaug peste aceeai cantitate de H2O2 cu catalaz. Se observ o degajare intens de cteva picturi de soluie de FeCl3. Se O2 rezultat din reacia: observ o degajare mai lent de O2 datorit 2H2O2 = 2H2O + O2 reaciei: (intensific arderea) Inhibarea activitii catalazei Activitatea enzimelor poate fi inhibat datorit unor substane (inhibitori, efectori), ca urmare a blocrii gruprilor active. -

Experien. Dac ntr-o eprubet care conine 2 mL H2O2 se adaug extract de catalaz tratat n prealabil cu H2S (prin barbotatre sau adugare de soluie apoas de H2S, NU se mai observ degajarea de oxigen. Blocarea activitii enzimei, n acest caz, se explic prin aciunea H2S asupra fierului n structura feroporfirinic a coenzimei (partea neproteic a enzimei). Influena temperaturii asupra activitii enzimice Metoda se bazeaz pe dozarea comparativ a apei oxigenate rmas nedescompus dintro cantitate determinat de ap oxigenat, luat n trei probe: dou dintre ele fiind puse n condiii de dezactivare a enzimei, cea de a treia rmnnd n condiiile n care activitatea caralazei rmne neafectat. Reacia de bay: 5H2O2 + 2KMnO4 + 3H2SO4 = 5O2 + 2MnSO4 + K2SO4 + 8 H2O n cele trei eprubete se vor gasi cantiti diferite de ap oxigenat rmas nedescompus, anume cum? Substane necesare: Soluii d e H2O2 1%; H2SO4 10%; KMnO4 0,1 N. Modul de lucru - n trei flacoane Erlenmayer de 200 mL se iau cte 20 mL extract de catalaz. Una dintre probe va constitui proba martor i va rmne n condiiile iniiale de temperatur. I se adaug 20 mL H2O2 i 10 mL H2SO4 i se titreaz cu KMnO4 0,1 N pn la punctul de echivalen (culoare slab roz dat de ultima pictur de reactiv). - n cea de a doua prob se adaug 10 mL H2SO4 i se las la temperatura camerei timp de 30 minute, dup care i se adaug 20 mL H2O2 i se titreaz cu KMnO4 0,1 N. - Cea de a treia prob se fierbe pe baia de ap la 80-900 C timp de 5 minute, dup care se rcete n jet de ap la robinet; se adaug 20 mL H2O2 1%, 10 mL H2SO4 10% i se titreaz imediat de KMnO4. Se vor nota volumele de soluie de KMnO4 0,1 N utilizate n fiecare caz; se vor explica diferenele constatate. Calculul activitii catalazei Pornind de la sistemul de ecuaii electronice care se afl la baza determinrii coeficienilor stoechiometrici ai ecuaiei chimice ce mai sus, care st la baza determinrii;