Diagnosticul prenatal

Scopul lucrării practice: A face cunoştinţă cu tehnica de obţinere a preparatelor cromozomiale din vilozităţi coriale şi culturi de amniocite. Metodele molecular-genetice.

Materiale şi utilage:1. Medii de cultură: TC-199; RPMI – 1640; NAMSF-10 cu L- glutamină;2. Ser fetal de viţel, ser de bovine sau ser uman AB ;3. Colchicină sau colcemid;4. Sol. hipotonă 0,075 M de KCL; sol. 0,9 % citrat de Na;5. Fixator Carnoy acetic - alcool metilicsau etilic + acid acetic glacial ( 3:1 );6. Tampon fosfat ( pH 6,8 );7. Sol. tripsină de 0,025%;8. Colorant Romanovskii, colorant Giemsa;9. Flacoane culturale( de penicilină) cu dopuri de cauciuc;10. Incubator CO2, microscop invertat;11. Veselă sterilă pentru culturi(flacoane, slaid-flacoane, cutii Petri );12. Seringi getabile, pencete şi vată sterilă, alcol etilic de 70 şi 96.

Date generale:Diagnosticul prenatal citogenetic(DPC) este o metodă de profilaxie a patologiei cromozomiale

în famliile cu risc de a avea copii afectaţi de o patologie cromozomială. Metodele de DPC permit detectarea încă în perioada de dezvoltare intrauterină a unui număr considerabil de anomalii

cromozomiale şi eliminarea embrionilor afectaţi, fără a dăuna sănătăţii mamei.

Metodele invazive ale diagnosticului prenatal

Procedeele de diagnostic prenatal citogenetic permit depistarea patologiei cromozomiale în diferite perioade de dezvoltare embionară, utilizând diferite metode invazive

pentru colectarea materialului biologic corespunzător:

Metodele invazive pentru DPC

Trimestrul

de sarcină

Materialul biologic colectat

Cantitatea materialului prelevat

Biopsia transcervicală cu cleşte

Aspiraţia transcervicală cu cateter

Biopsia transabdominală( placentocenteza)

Amniocenteza transabdominală

Cordocenteza şi cardiocenteza

I

I

I, II, III

I, II

II, III

vilozităţi coriale

vilozităţi coriale

vilozităţi coriale

lichid amniotic

sânge fetal

5 – 10 mg

5 - 10 mg

5 - 10 mg

20 ml

0,5 – 1 ml

Biopsia vilozităţilor coriale (VC) – prelevarea sau aspirarea de ţesut trofoblastic din vilozităţile coriale sub ghidaj ecografic.

Amniocenteza (AC) – puncţionarea sacului amniotic la 16 – 20 săptămâni, cu prelevarea lichidului amniotic (LA) sub ghidaj ecografic.

Cordocenteza – puncţionarea cordonului ombilical de la 18 săptămânia în sus cu prelevarea sângelui fetal sub ghidaj ecografic.

Metodele diagnosticului prenatal , riscul obstetric şi timpul necesar pentru stabilirea diagnosticilui:

Aspecte obstetrice Timpul necesar pentru stabilirea diagnosticuluiMetodelediagnosticului

Termenul

sarcinii

( săpt.)

Riscul

procedurii

( % )

Cercetări citogenetice

Cercetări moleculare

Cultura de

celule

Metoda directă

Cultura de

celule

Metoda directă

Amniocenteza 16 –20 0,5 – 1 2 – 4 săp. --- 5 săp. 10 zile

Biopsia de 7 –11 2 – 4 2 săp. 1 – 3 zile --- 10 zilecorion

Cordocenteza 18 1 – 7 3 –7 zile --- --- 10 zile

Vilozotăţile coriale( VC ) – se dezvoltă şi funcţionează numai în timpul gravidităţii şi posedă un şir de particularităţi histofiziologice. La cea de-a 7-8 săptămână de gestaţie, el reprezintă un ţesut

vilozitar, bine ramificat care activ creşte. S-a demonstrat, că din cele 3 tipuri de celule din care sunt formate VC, numai monostratul de citotrofoblast dispune de o activitate înaltă mitotică spontană.

Anume această proprietate a citotrofoblastului de a se divide sporadic stă la baza metodei de obţinere a preparatelor cromozomiale directe.

Tehnica de obţinere a preparatelor cromozomiale din vilozităţile coriale( metoda directă):

1) Prelevarea – sub ghidaj ecografic în condiţii de asepsie. Materialul se preia într-un flacon steril cu 5ml de mediu TC-199, care conţine antibiotice( Peni/strepto 50000 U/25 mg/ml);

2) Spălarea – se efectuază sub controlul microscopului invertat: într-o cutie Petri cu o porţie nouă de mediu, se alege de membrana diciduală şi se spală de sânge.

3) Colchicinizarea – materialul ales se transferă într-o cutie care conţine 3 ml de mediu RPMI-1640(HAMSF-10) şi 1-3 pic. de colchicină(10 mg/l);

4) Incubarea – la incubator cu 5% de CO2 , t = 370 , T = 2-3 h.5) Şocul hipotonic - Materialul se transfară într-o cutie Petri, care conţine 3 ml de sol. 0,9%

citrat de Na, se pune la termostat t = 370 , T = 20 –30 min.;6) Fixarea - se efectuază cu fixator Carnoy acetic (3:1), pregătit extempore şi răcit. Celulele

suportă 3- 4 schimburi de fixator. Durata etapei variază de la 45min – 1h; 7) Hidratarea – cu 5-10 min înainte de expirarea ultimii fixaţii, în fixator se adaugă un volum

egal de H2O distilată8) Macerarea – materialul fixat se extrage pe o lamă microscopică uscată, bine curăţată şi se

absoarbe surplusul de lichid. Pe material se adaugă 3-4 pic. de sol. 60 % acid acetic,

macerarea decurge 3-4 min. Ieşirea celulelor se urmăreşte la microscopul invertat sau la lupă. Suspenzia celulară se înprăştie atent pe suprafaţa lamei. Se execută 3-4 lame, care se numerotează respectiv.

9) Colorarea (bandarea) şi examenul microscopic. Lichidul amniotic( LA ) – reprezintă o suspensie celulară, formată din celule fetale, care se

descuamează de pe diferite suprafeţe ale corpului fătului (cavitatea bucală, căile respiratorii, tractul digestiv, aparatul excretor, epiteliul amniotic). Numai un număr neânsemnat de celule fetale pot fi considerate relativ "viabile" şi sunt capabile în condiţii optime de existenţă in vitro să dea creştere, deci să se dividă. Anume acastă proprietate a celulelor fetale stă la baza obţinerii preparatelor cromozomiale.

Tehnica in situ de obţinere a preparatelor cromozomiale din cultură de amniocite:

Etapele de prelevare şi cultivare necesită condiţii maxime de asepsie şi se efectuază în încăperi specializate ( boxe sterile). 1) Prelevarea – prin puncţie, sub ghidaj ecografic se prelevă 20 ml de LA într-un flacon steril

(25 cm2) ;2) Separarea celulelor – LA prelevat se transferă în 2 eprubete centrifuge sterile şi se

centrfughează 5-8 min la 1000 rot/min.3) Cultivarea - se elimină supernatantul, lăsându-se 0,5-1 ml de sediment celular la care se

adaugă 2,5-3 ml de mediu. Amestecul se resuspendă şi se transferă cu pipeta sterilă în 4 slaid-flacoane (NUNC), apoi se examinează densitatea celulară la microscopul invertat.

4) Incubarea – se incubează T = 5-7 zile la t = 370, 5% CO2 ;5) Subcultivarea – suspensia celulară din cele 4 slaid-flacoane se transfară în eprubete centifuge

şi se separă celulele (prin centrifugare 5min, la 1000rot./min). Supernatantul se înlătură, se lasă 0,5 ml de sediment la care se adaugă 1,5 ml de mediu. Sedimentul celular se resuspendă şi se repartizează câte 1 ml în 2 slaid-flacoane. Flacoanele cultivate se întroduc la incubator pe 5-7 zile.

La cele 4 slaid- flacoane se adaugă câte 1-1.5 ml de mediu şi se studiază la microscopul invertat pentru a observarea procesului de diferenţiere fibroblastică şi formarea coloniilor. Flacoanele cu 4-5..... colonii medii sunt bune de fixare. Cu 18-24 ore înainte de fixare se schimbă mediul din slaid-flacoane.

6) colchicinizarea – în slaid-flacoanele alese se adaugă 0,5-1ml de colchicină şi se incubează 2-3 ore la incubator.

7) Fixarea – se efectuază direct pe lamă, schimbându-se 4-5 porţii de fixator proaspăt. Timpul de fixaţie variază: 45- 60 min, după care lamele se usucă la aer şi se păstrează la termostat (t = 370) până la colorare.

8) Colorarea (bandarea) şi examenul microscopic. Se colorează cu sol.Giemsa pe tampon fosfat ( 1ml:1pic.) , T = 5 – 10 min. Bandarea GTG se efectuiază cu sol. de 0,025% de tripsină (1pic. : 1ml colorant), T = 5 min. Se analizează metafaze din diferite colonii, pentru a depista mozaicurile.