www.referat.ro

Determinarea activitii antioxidante a extractului de ceai verdeCeaiul verde reprezint frunzele de Camelia sinensis. Acestea nu sunt lsate s fermenteze i sunt imediat uscate, fiind numit i ceai nefermentat i ceai virgin. Recent a fost dezvoltat un unguent pe baza extractului de ceai verde, care acioneaz mpotriva leziunilor HPV genitale i anale. Acestea sunt datorate aciunii HPV (human papilomavirus), un agent rezistent la majoritatea tratamentelor, cu excepia unor tehnici chirurgicale complicate. OH

HO

O

OH

OH OH Figura 1. Structura catechinei Efectul inhibitor este datorat catechinelor din compoziia extractului vegetal care au un puternic efect antioxidant i antioxidant. n general este cunoscut ca a avea efecte antioxidante puternice mpotriva radicalilor liberi. Este cel mai vechi i mai utilizat n tratamentele naturiste de prevenire a apariiei tumorilor canceroase. De asmenea extractul de ceai verde se utilizeaz pentru a preveni atacurile cardiovasculare i la scderea colesterolului. Se gsete sub form de pliculee cel mai frecvent. n farmaciile de specialitate se gsete i sub form de pastile sau ncoporat n diferite creme i unguente.

Materiale necesare: balan analitic, tvie de cntrire, spatul, pahar Berzelius, eprubete, stativ, pipete de sticl, spectrofotometru, rotavapor, ceai verde uscat, etanol., 2,2 Difenil 1 picrilhidrazil (DPPH). Mod de lucru: 1. Obinerea extractului vegetal 100 g produs vegetal (ceai verde) uscat se pun ntr-o sticl cu dop. Se toarn peste 200 de ml de metanol. Se las dou zile, dup care se ndeprteaz materialul vegetal prin centrifugare la 10.000 rpm timp de 10 minute, ntr-o centrifug EBA 32R cu rcire. Lichidul rezultat se concentreaz ntr-un rotavapor Buchi pn la 50%, la 400C, 150 rpm i 150 mbar. Produsului concentrat i se determin activitatea antioxidant total i coninutul n fenoli. 2. Determinarea activitii antioxidante totale Activitatea antioxidant total a fost evaluat prin metoda spectrofotometric indirect care utilizeaz 2,2 difenil 1 picrilhidrazil (DPPH) ca sistem de generare a radicalului liber stabil DPPH . Amestecul de reacie conine urmtoarele: Soluii Prob Etanol 80% Vitamina Prob 50 l Martor 50 l 5 ml Standard 50 l 5 ml

E/Trolox DPPH 0,04% 5 ml n etanol

Amestecurile se las timp de 30 de minute i se va msura absorbana la 517 nm, fa de etanol. Astfel, concentraia radicalilor DPPH a fost calculat prin utilizarea urmtoarei formule de calcul: A0 A1 100, unde: A0

Activitate antioxidant total (%) =

A0 absorbana martorului A1 absorbana probei 2. Determinarea coninutului fenolic total Determinarea s-a reaclizat cu reactiv Folin Ciocalteau utiliznd acidul galic ca standard. Amestecul de reacie este format din 1 ml extract vegetal diluat n 46 ml ap distilat. Se mai adaug 1 ml reactiv Folin Ciocalteau, iar dup 3 minute aproximativ 3 ml carbonat de Na 2%. Amestecul se las 2 ore, agitnd periodic Se citete absorbana la 760 nm. Concentraia total de fenoli se exprim n mg/g de extract uscat. Concentraia componenilor fenolici totali din extract se determin ca g de acid galic utiliznd ecuaia obinut de la curba standard de acid galic: Absorbana = 0,0008 acid galic (g). n funcie de materialul vegetal supus extraciei i de rezultatele ce se urmresc a se obine, se mai pot efectua urmtoarele analize: a. Determinarea puterii de reducere. Se fac diluii ale extractului n eprubete diferite cu ap ultrapur i se analizeaz fiecare diluie n parte. Amestecul va conine: - 1 ml diluie; - 2,5 ml tampon fosfat 0,2M, pH 6,6; - 2,5 ml fericianur de potasiu 1%. Amestecul se introduce la 500C, timp de 20 de minute. Peste amestec se adaug 2,5 ml acid tricloracetic 10% i se centrifugheaz la 1000 rpm 10 minute. ntr-o eprubet curat se pun 2,5 ml supernatant, 2,5 ml ap distilat i 1 ml FeCl3 1%. Se msoar absorbana la 700 nm. Creterea absorbanei odat cu creterea concentraiei extractului este direct proporional cu creterea puterii reductoare. Articol descifrat formulas

b. Determinarea activitii de legare a radicalului hidroxil. Se realizeaz o serie de eprubete ce vor conine extract vegetal de diferite concentraii. Amestecul de reacie are urmtorul coninut: 0,1 ml EDTA 1mM; 0,01 ml FeCl3 10 mM; 0,1 ml H2O2 10 mM; 0,36 ml deoxiriboz 10 mM; 1 ml extract vegetal dizolvat n ap ultrapur; 0,33 ml tampon fosfat 50 mM, pH 7,4; 0,1 ml acid ascorbic 1 mM.

COOH

HO OH

OH

Figura 2. Structura chimic a acidului galic Amestecul a fost introdus ntr-un termostat la 370C, timp de 1 or. n alte eprubete notate la fel se adaug: 1 ml amestec iniial; 1 ml TCA 10%; 1 ml acid tiobarbituric (TBA) 0,5%. n paralel se face i o prob martor n care se utilizeaz un compus ca martor (acid galic). Se msoar absorbana amestecului la = 532 nm. Capacitatea de legare a radicalului hidroxil (% OH-) se calculeaz dup formula: % OH- = AMartor APr ob 100, unde: AMartor

AMartor absorbana reaciei martor AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal c. Determinarea activitii de legare a radicalului oxid nitric. Metoda se bazeaz pe generarea oxidului nitric din nitroprusidul de Na n soluie i care au fost msurai prin utilizarea reaciei Griess.

O N 2Na + N C Fe C C N C N N C N

2-

Figura 3. Structura chimic a nitroprusidului de Na Se pregtesc o serie de eprubete cu diferite concentraii ale extractului vegetal. n paralel se face i o prob martor n care se utilizeaz un compus ca prob martor (butilat hidroxi-toluenul). Amestecul de reacie este format din: 3 ml mitroprisid de Na 10 nM n tampon fosfat 2 ml prob extract vegetal. Se prepar un martor, care are n locul extractului vegetal, metanolul sau etanolul, n funcie de solventul cu care se efectueaz extracia. Amestecul rezultat se incubeaz timp de or, n baie de ap la temperatura de 250C. ntre timp se pregtete reactivul Greiss, care conine: 1% sulfanilamid 0,1% N-l-naftiletilen-diamin-dihidroclorid de sodiu n 2% H3PO4. ntr-un alt set de eprubete notate identic se adaug urmtoarele: 5 ml soluie ce conine extract vegetal 5 ml reactiv Griess.

Se msoar absorbana fiecrei eprubete la 546 nm, fa de metanol. Calcularea activitii de legare a radicalului oxid nitric se face dup urmtoarea formul: AMartor APr ob 100, unde: AMartor

% NO =

AMartor absorbana reaciei martor AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal. d. Determinarea activitii de legare a anionului superoxid. Radicalii super oxid sunt generai prin oxidarea NADH i determinai prin reducerea nitro blue tetrazoliu (NBT). Pentru determinarea se procedeaz conform tabelului urmtor: Soluie Tampon Tris HCl 3 ml (16 mM, pH 8) NBT 50 M NADH 78 M Extract vegetal (50 300 g/ml) Acid ascorbic 1 ml 1 ml 3 ml Prob 3 ml 1 ml 1 ml 3 ml 1 ml Martor

(50 300 g/ml) Fenazin metosulfat 1 ml 10 M

Amestecurile se realizeaz n 2 eprubete care se vor introduce n etuv timp de 5 minute la 2500C. Se va citi absorbana martorului i a probei fa de blanc (realizat .........). Inhibarea generrii anionului superoxid se calculeaz conform formulei: AMartor APr ob 100, unde: AMartor

% SOD =

AMartor absorbana reaciei martor AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal.

e. Determinarea activitii de legare a radicalului H2O2. Metoda se bazeaz pe capacitatea extractului vegetal de a lega radicalii H2O2. Se prepar n eprubete diferite probe de extract vegetal n ap distilat i cu o concentraie diferit. Se adaug 0,6 ml H2O2 40 mM. Se prepar un martor n tampon fosfat pH7,4, la care se adaug 0,6 ml H2O2 40 mM. Amestecurile se fac n eprubete care se pstreaz 10 minute la temperatura camerei. Se citete absorbana la 230 nm fa de tampon fosfat pH 7,4. Capacitatea de legare a H2O2 se calculeaz conform formulei: % H2O2 = AMartor APr ob 100, unde: AMartor

AMartor absorbana reaciei martor AProb absorbana probei ce conine extractul vegetal.

Powered by http://www.referat.ro/ cel mai tare site cu referate