Cursul VCursul V

AntioxidanAntioxidanţi ne-enzimaticiţi ne-enzimatici

VITAMINA CVITAMINA C

Antioxidant important şi puternic, care acţionează în mediu Antioxidant important şi puternic, care acţionează în mediu aposapos

•La pH fiziologic 99,9% din vitamina C este prezentă ca AscH- şi numai 0,05% ca AscH2 şi 0,04% ca Asc-

•AscH- este un antioxidant donor şi reacţionează cu radicali formând radicali liberi ascorbat stabilizaţi prin rezonanţă•Produsul oxidării ascorbatului de către ROS este radicalul semidehidroascorbat

care este considerat o moleculă antioxidantă mică, al cărui nivel este o măsură a gradului de stres oxidativ în sistemele biologice

•Doze mari de vit C (până la 2000mg/zi) nu produc efecte secundare

•Nivele serice scăzute în populaţia cu risc crescut pot contribui la un risc crescut de metaplazie gastrică şi gastrită cronică, care sunt leziuni precanceroase

•Efectul pozitiv în reducerea incidenţei cancerului de stomac se datoreşte, probabil, acţiunii inhibitoare în generarea compuşilor N-nitrozilaţi prin inhibiţia reacţiei dintre nitriţi şi grupări amino

•Efect protector consistent în cancerul de plămân şi colorectal

•Efectul pro-oxidant al ascorbatului a fost atribuit eliberării ionilor metalici din celulele lezate

•Vit C induce descompunerea hidroperoxizilor lipidici cu formare de electrofili bifuncţionali ce pot reacţiona cu ADN: 4-oxo-2nonenal, 4,5-epoxi-2-decenal şi 4-hidroxi-2-nonenal.

•4,5-epoxi-2-decenal este precursor al eteno-2’-deoxiadenozina, care corespunde unei leziuni înalt mutagenice de la nivelul ADN uman

•În condiţii nefiziologice, vit C promovează formarea radicalilor hidroxil dependentă de ioni metalici

•Studii in vitro au dovedit că vit C inhibă peroxidarea lipidică dependentă de metale tranziţionale (Fe, Cu) în plasmă şi alte fluide biologice

•Produce o reducere a markerilor de oxidare a ADN, a lipidelor şi proteinelor

•În prezenţa fierului, reduce lezarea oxidativă

•Rol anti-apoptotic şi de modulare a sistemului imun

•Celulele tratate cu ascorbat expuse la iradiere UV-B au prezentat o descreştere cu 50% a fosforilării JNK (care activează AP-1), ceea ce inhibă calea de semnalizare JNK/AP-1.

Vitamina EVitamina E

Este liposolubilă şi există în 8 forme Este liposolubilă şi există în 8 forme diferitediferite

Alfa-tocoferolul este cea mai activă formă de vit E la oameni şi cel mai puternic antioxidant biologic, legat de membrană, folosit de celulă

Asigură protecţia împotriva peroxidării lipidice

•Alfa-tocoferolul şi acidul ascorbic funcţionează într-un proces ciclic: alfa-tocoferolul este convertit în radical alfa-tocoferil prin donarea unui hidrogen labil unui lipid sau unui radical peroxil lipidic. Acest radical poate fi redus la alfa-tocoferol de către acidul ascorbic.•Aportul de vit E reduce incidenţa cancerului colorectal prin declanşarea apoptozei în celulele canceroase prin inducerea unui inhibitor puternic al ciclului celular p21wafi/cip1

•Vit E inhibă formarea ROS şi activarea endonucleazelor

•Doze de 400 UI/zi sau mai mari pot creşte riscul letal

Antioxidanţii tiolici-GlutationulAntioxidanţii tiolici-Glutationul

NADPH + H+ + GSSG → NADP+ + 2GSH

• Este tamponul redox principal tiol-disulfură din celule

•În citosol (1-11 mM), în mitocondrie (5-11mM), în nucleu (3-15 mM)

•GSH din nucleu menţin grupările sulfhidril ale proteinelor ce sunt necesare reparării ADN şi expresiei acesteia

•Capacitatea antioxidantă a compuşilor tiolici se datoreşte atomului de sulf care poate pierde uşor un electron

Raportul GSH/GSSG este o bună măsură a stresului oxidativ a unui organism.

Disulfura mixtă, proteină-SSG, au un half life mai mare decât GSSG, probabil datorită plierii proteinelor

Rolurile GSH împotriva stresului Rolurile GSH împotriva stresului oxidativoxidativ

Este substrat al mai multor enzime de Este substrat al mai multor enzime de detoxifiere: GPx, GSTdetoxifiere: GPx, GST

Participă la transportul aminoacizilor prin Participă la transportul aminoacizilor prin membrana plasmaticămembrana plasmatică

Inactivează radicalul hidroxil şi oxigenul Inactivează radicalul hidroxil şi oxigenul singlet direct, detoxifiind peroxidul de singlet direct, detoxifiind peroxidul de hidrogen şi peroxizii lipidici prin acţiunea hidrogen şi peroxizii lipidici prin acţiunea catalitică a GPxcatalitică a GPx

Regenerează vit C şi E Regenerează vit C şi E

•Capacitatea glutationului de a regenera cei mai importanţi antioxidanţi este legată de raportul GSSG/2GSH, care are un impact mare asupra mediului redox total al celulei.

•Potenţialul de reducere al acestui cuplu depinde de mediul redox în care funcţionează.

•Potenţialul redox este -180mV în reticulul endoplasmatic şi

-232 mV în citosol. Acest potenţial nu depinde numai de raportul GSSG/2GSH ci şi de valoarea absolută a concentraţiei GSH (în funcţie de balanţa între sinteză şi utilizare).

•Expunerea la ROS determină creşterea concentraţiei GSH prin creşterea vitezei de sinteză a GSH.

•HNE creşte viteza de sinteză a GSH

•HNE activează JNK, care activează AP-1

GSH protejază celulele împotriva apoptozei prin aceea că modulează starea redox a celulei şi interacţionează cu semnalele pro- şi anti-apoptotice

De aceea o serie de medicamente anticancer determină depleţia în GSH

O serie de tipuri de cancer sunt asociate cu alterarea funcţionării unor enzime care acţionează în prezenţa glutationului (de ex. GST).

GST catalizează conjugarea glutationului cu o serie de compuşi lipofili: carcinogeni, medicamnte, produşi de stres oxidativ.

Există 5 clase de GST: alfa, miu, pi, gama şi teta

Clasa miu este reprezentată de 5 izoenzime diferite: M1-M5

Cele mai multe mutaţii apar la GST M1

În sângele pacienţilor de cancer de sân şi colon raportul GSH/GSSG este descrescut comparativ cu martorul, pentru că nivelul GSSG creşte în primele stadii ale progresiei tumorale, datorită generării de peroxid.

Antioxidanţi tiolici-sistemul Antioxidanţi tiolici-sistemul tioredoxineitioredoxinei

Tioredoxina (TRX) este o proteină mică, Tioredoxina (TRX) este o proteină mică, multifuncţională, cu funcţii redox ce conţine două multifuncţională, cu funcţii redox ce conţine două resturi de cisteină active redox la un situs activ resturi de cisteină active redox la un situs activ conservat:Cys-Gly-Pro-Cysconservat:Cys-Gly-Pro-Cys

Tioredoxina conţine două grupări –SH adiacente, Tioredoxina conţine două grupări –SH adiacente, care sunt convertite la o legătură disulfurică în care sunt convertite la o legătură disulfurică în tioredoxina oxidată, care suferă reacţii redox cu tioredoxina oxidată, care suferă reacţii redox cu proteine multipleproteine multiple

Reducerea legăturii disulfurice la puntea disulfurică este catalizată de tioredoxin reductază (TR), sursa de electroni fiind NADPH

Tioredoxina controlează un număr de factori de transcripţie ce afectează proliferarea celulară şi moartea prin mecanismul de reglare redox.

TRX este prezentă în concentraţii de 100-1000 mai mici decât GSH, iar cei doi compuşi au funcţii suprapuse şi compartimentalizate în activarea şi reglarea factorilor de transcriere (ca de ex. NF-kB şi AP_1).

Mecanismul de funcţionare:

•TRX este redusă la situsul său activ de către TR(SH)2

•TRX intră în nucleu pentru a regla activitatea factorilor de transcripţie

•TRX este excretată afară din celulă unde acţionează asupra altor factori de creştere

TRX:TRX:

•Inhibă activitatea NF-kB în citoplasmă

•Stimulează abilitatea NF-kB de a se lega ADN în nucleu

•Poate regla HIF-1 şi cyt 450

•Se translocă din citosol în nucleu ca răspuns la stresul oxidativ pentru a regla expresia genică prin Ref-1

•Reglează activitatea p53

IMPLICAŢII ÎN CANCERIMPLICAŢII ÎN CANCER

Nivele ridicate de TRX apar în carcinom cervical, Nivele ridicate de TRX apar în carcinom cervical, hepatom, tumori gastrice, carcinoame de plămân hepatom, tumori gastrice, carcinoame de plămân şi colorectalşi colorectal

O serie de celule canceroase secretă TRXO serie de celule canceroase secretă TRX TRX stimulează dezvoltarea unor linii celulare TRX stimulează dezvoltarea unor linii celulare

leucemice şi derivate de la tumori solideleucemice şi derivate de la tumori solide Supraexpresia TRX protejază celulele împotriva Supraexpresia TRX protejază celulele împotriva

apoptozei induse de stres oxidativ şi favorizează apoptozei induse de stres oxidativ şi favorizează creşterea tumorilorcreşterea tumorilor

Nivele ridicate de TRX în tumorile umane Nivele ridicate de TRX în tumorile umane determină rezistenţa la chimioterapiedetermină rezistenţa la chimioterapie

Antioxidanţi tiolici-Acidul lipoicAntioxidanţi tiolici-Acidul lipoic

Acidul lipoic=acid tiocticAcidul lipoic=acid tioctic

Are natură amfifilică şi este distribuit atât în Are natură amfifilică şi este distribuit atât în membrane cât şi în citosolmembrane cât şi în citosol

Este absorbit rapid din dietăEste absorbit rapid din dietă Are funcţii antioxidante: Are funcţii antioxidante:

1.1. Stinge ROS Stinge ROS

2.2. Regenerează antioxidanţi endogeni şi exogeni: Regenerează antioxidanţi endogeni şi exogeni: vit C, E şi GSHvit C, E şi GSH

3.3. Chelatarea metalelor redox (Cu (II), Fe(II), etc)Chelatarea metalelor redox (Cu (II), Fe(II), etc)

4.4. Repară proteinele oxidateRepară proteinele oxidate

Acidul lipoic:Acidul lipoic:

Previne distrugerea celulelor beta-pancreatice, Previne distrugerea celulelor beta-pancreatice, stimulează preluarea glucozei, protejază stimulează preluarea glucozei, protejază împotriva aterosclerozei şi cataractei şi împotriva aterosclerozei şi cataractei şi descreşte amploarea neuropatiei diabeticedescreşte amploarea neuropatiei diabetice

Are efecte radioprotective; la Cernobîl după Are efecte radioprotective; la Cernobîl după dezastrul nuclear, a redus efectele nocive în dezastrul nuclear, a redus efectele nocive în ficatul şi rinichii copiilor afectaţificatul şi rinichii copiilor afectaţi

Este eficient în tratamentul otrăvirii cu metale Este eficient în tratamentul otrăvirii cu metale grelegrele

CarotenoiziiCarotenoizii

Pigmenţi din plante şi microorganisme Pigmenţi din plante şi microorganisme Peste 600 în naturăPeste 600 în natură

Capacitatea antioxidantă a carotenoizilor se datoreşte abilităţii structurii cu duble legături conjugate să favorizeze delocalizarea electronilor neîmperecheaţi.

De aceea beta-carotenul

•anihilează oxigenul singlet

•Reacţionează cu radicalii peroxil, hidroxil şi superoxid

•La concentraţii suficient de mari, inhibă peroxidarea lipidelor

Mecanisme propuse pentru reacţia Mecanisme propuse pentru reacţia carotenilor cu radicalii liberi:carotenilor cu radicalii liberi:

Adiţia radicalicăAdiţia radicalică Extragerea hidrogenului din carotenoiziExtragerea hidrogenului din carotenoizi Reacţia de transfer de electroniReacţia de transfer de electroni Formarea unui aductFormarea unui aduct

Beta-carotenul poate participa la Beta-carotenul poate participa la peroxidarea lipidelor ca pro-oxidant:peroxidarea lipidelor ca pro-oxidant:

Testul alfa-tocoferol-beta-caroten (US National Cancer Testul alfa-tocoferol-beta-caroten (US National Cancer Institute)Institute)

In Finlanda, 29133 subiecţi bărbaţi fumători între 50-69 aniIn Finlanda, 29133 subiecţi bărbaţi fumători între 50-69 ani 20mg/zi beta-caroten timp de 5-8 ani20mg/zi beta-caroten timp de 5-8 ani A crescut cu 18% incidenţa cancerului pulmonar şi cu 8% A crescut cu 18% incidenţa cancerului pulmonar şi cu 8%

mortalitatea la lotul tratat comparativ cu cel martormortalitatea la lotul tratat comparativ cu cel martor Factorul cheie care permite trecerea de la funcţia de Factorul cheie care permite trecerea de la funcţia de

antioxidant la cea de pro-oxidant este presiunea parţială antioxidant la cea de pro-oxidant este presiunea parţială de oxigende oxigen

Radicalul caroten-peroxil determină oxidarea lipidelor nesaturate

La presiuni parţiale de oxigen sub 150 Torr, carotenii îşi manifestă proprietăţile antioxidante iar la presiuni mai mari devin pro-oxidanţi. La fel se întâmplă şi la concentraţii mari.

Acidul retinoic inhibă proliferarea celulară şi creşte diferenţierea celulară

Licopenul inhibă progresia ciclului celular în liniile celulare canceroase de sân, plămân şi prostată

Carotenii au rol anti-inflamator, inhibând producerea de IL-6 şi TNF-alfa

În celule sănătoase inhibă expresia de Bax şi o stimulează pe cea a Bcl-2

Beta-carotenul inhibă expresia Bcl-2 în celulele canceroase

Beta-carotenul are efect pro-apoptotic prin creşterea ROS şi a GSSG/GSH, corelat cu creşterea capacităţii de legare a NF-kB în celule de cancer de colon şi leucemice

FLAVONOIDELEFLAVONOIDELE

Compuşi polifenolici ce sunt prezenţi Compuşi polifenolici ce sunt prezenţi în dîn diieta umanăeta umană

Circa 4000 compuşi descrişi împărţiţi Circa 4000 compuşi descrişi împărţiţi în 13 claseîn 13 clase

Au o structură difenil propanică: 2 Au o structură difenil propanică: 2 cicluri aromatice legate prin 3 atomi cicluri aromatice legate prin 3 atomi de carbon implicaţi într-un de carbon implicaţi într-un heterociclu cu oxigenheterociclu cu oxigen

Roluri în sănătatea umană:Roluri în sănătatea umană:

Tratamentul şi prevenţia canceruluiTratamentul şi prevenţia cancerului Tratamentul şi prevenţia bolilor Tratamentul şi prevenţia bolilor

cardiovascularecardiovasculare Tratamentul şi prevenţia altor Tratamentul şi prevenţia altor

patologiipatologii

Compuşii fenolici:Compuşii fenolici:

Terminatori ai lanţurilor de radicali liberiTerminatori ai lanţurilor de radicali liberi Chelatează ionii metalici redoxChelatează ionii metalici redox activiactivi Interferă cu peroxizii lipidici, generând radicali Interferă cu peroxizii lipidici, generând radicali

fenoxil, care sunt relativ stabili şi nu propagă fenoxil, care sunt relativ stabili şi nu propagă reacţii radicalice în lanţ reacţii radicalice în lanţ

!!! Concentraţii mari, prezenţa metalelor redox active şi valori mari de pH, generează un efect pro-oxidant

Flavonoidele sunt scavengeri ideali pentru radicalii peroxil datorită potenţialului de reducere favorabil în raport cu radicalii alchil-peroxil.

Au capacitatea de a dona un proton şi un electron unui radical datorită inelului B catecol

Au efect antioxidant şi datorită prezenţei nesaturării 2,3 în conjugare cu gruparea oxo din poz 4 a inelului C

Grupările hidroxil din poziţiile din inele A şi B au rol în capacitatea flavonoidelor de a chelata metalele redox active şi de a împiedica reacţiile Fenton

Aportul regulat de flavonoide:Aportul regulat de flavonoide:

Corelat cu rate scăzute de cancer de Corelat cu rate scăzute de cancer de stomac, pancreas, plămân şi sânstomac, pancreas, plămân şi sân

Quercetina previne formarea Quercetina previne formarea trombilor şi blocarea arterelor, trombilor şi blocarea arterelor, reducând incidenţa infarctelor şi al reducând incidenţa infarctelor şi al accidentelor vasculare cerebraleaccidentelor vasculare cerebrale

SeleniuSeleniu Asociat GPx şi TRAsociat GPx şi TR Selenoenzimele joacă un rol în controlul diviziunii celulare, Selenoenzimele joacă un rol în controlul diviziunii celulare,

metabolismul oxigenului, procesele de detoxifiere, metabolismul oxigenului, procesele de detoxifiere, inducerea apoptozei în celulele canceroase şi funcţionarea inducerea apoptozei în celulele canceroase şi funcţionarea sistemului imunsistemului imun

Nivelele de Se şi GPx de la pacientele de cancer cervical Nivelele de Se şi GPx de la pacientele de cancer cervical sunt scăzutesunt scăzute

Un aport de 200 microg/zi nu a redus riscul de cancer de Un aport de 200 microg/zi nu a redus riscul de cancer de piele, dar a redus riscul de metastaze la cancerele de piele, dar a redus riscul de metastaze la cancerele de plămân, colon şi prostată (SUA)plămân, colon şi prostată (SUA)

Un aport de 50 microg/zi plus alfa-tocoferol şi beta-caroten Un aport de 50 microg/zi plus alfa-tocoferol şi beta-caroten a redus semnificativ rata mortalităţii de cancer de stomac a redus semnificativ rata mortalităţii de cancer de stomac (China)(China)

Seleniul:Seleniul:

Reduce lezarea ADN indusă de stres Reduce lezarea ADN indusă de stres oxidativ şi formarea de aducţi ADN-oxidativ şi formarea de aducţi ADN-carcinogen legaţi covalentcarcinogen legaţi covalent

Induce expresia p53Induce expresia p53 Administrarea de acid metilselenic a Administrarea de acid metilselenic a

dus la inhibiţia creşterii unor linii dus la inhibiţia creşterii unor linii celulare pre-maligne de cancer de celulare pre-maligne de cancer de sânsân

Stresul oxidativ şi mediul redox celularStresul oxidativ şi mediul redox celular

Fiecare celulă prezintă o concentraţie particulară de Fiecare celulă prezintă o concentraţie particulară de electroni păstrată la nivelul multor constituenţi celulari.electroni păstrată la nivelul multor constituenţi celulari.

Oscilaţiile stării redox a celulei determină diferenţierea Oscilaţiile stării redox a celulei determină diferenţierea celularăcelulară

În condiţii normale, starea redox celulară variază într-un În condiţii normale, starea redox celulară variază într-un domeniu foarte strâns, ca şi pH; în condiţii patologice, domeniu foarte strâns, ca şi pH; în condiţii patologice, starea redox poate căpăta valori mai mari sau mai mici faţă starea redox poate căpăta valori mai mari sau mai mici faţă de normalde normal

Capacitatea de tamponare redox este asigurată în primul Capacitatea de tamponare redox este asigurată în primul rând de GSH şi TRXrând de GSH şi TRX

Conc. intracelulară de GSH este de 500 ori mai mare decât Conc. intracelulară de GSH este de 500 ori mai mare decât cea extracelularăcea extracelulară

Raportul 2GSH/GSSGRaportul 2GSH/GSSG esteeste tradus întradus în proces proces de semnalizare redoxde semnalizare redox

REG este un micromediu oxidativ, în care raportul REG este un micromediu oxidativ, în care raportul este relativ scăzut iar formarea punţilor este relativ scăzut iar formarea punţilor disulfurice este un aspect important al plierii disulfurice este un aspect important al plierii proteinelorproteinelor

În condiţii de stres oxidativ se formează GSSG şi În condiţii de stres oxidativ se formează GSSG şi disulfuri proteice mixte; unii receptori, protein disulfuri proteice mixte; unii receptori, protein kinaze şi factori de transcripţie care au grupări kinaze şi factori de transcripţie care au grupări tiol critice pentru activitatea lor, pot reacţiona cu tiol critice pentru activitatea lor, pot reacţiona cu GSSG formând disulfuri mixte, ceea ce afectează GSSG formând disulfuri mixte, ceea ce afectează funcţia biologicăfuncţia biologică

GSSG poate acţiona ca o moleculă semnal GSSG poate acţiona ca o moleculă semnal nespecificănespecifică

• Nivele ridicate de GSH şi TRX sunt asigurate în celulă de glutation reductază şi tioredoxin reductază

• Mediul redox celular joacă un rol important în:

1. Traducerea de semnale

2. Activarea enzimelor

3. Sinteza ADN şi ARN

4. Proliferare celulară

5. Diferenţiere celulară

6. Apoptoză

În general:În general:

Moartea celularăMoartea celulară este produsă de un este produsă de un mediu celular mediu celular oxidativoxidativ

Proliferarea Proliferarea este produsă de un este produsă de un mediu celular mediu celular reducătorreducător

Ciclul celular este caracterizat de fluctuaţii în mediul redox extracelular, mediate în primul rând prin modificările intracelulare ale concentraţiei de GSH

În exteriorul celulei se găsesc molecule oxidante ca peroxidul de hidrogen, tioredoxina, care sunt transportate prin membrana plasmatică şi modifică mediul redox intracelular

Un mediu celular foarte reducător stimulează proliferarea celulară, o uşoară trecere spre un mediu mai oxidativ determină diferenţierea celulară

Cînd mediul intracelular devine mult mai oxidat, se produce moartea celulară: apoptoza şi necroza

Apoptoza este indusă de stimuli oxidativi moderaţi iar necroza de un mediu oxidativ intens.

În diferite tipuri de linii celulare concentraţii de 5-35 µM peroxid de hidrogen au generat apoptoză, iar necroza a fost indusă la 100 µM.

În celulele canceroase, balanţa redox este perturbată. Un nivel al potenţialului reducător ridicat în nucleu şi mitocondrii , realizat prin menţinerea unor concentraţii ridicate de GSH şi TRX facilitează eludarea apoptozei şi determină un potenţial proliferativ prin activarea semnalelor de supravieţuire celulară mediate de factorii de transcripţie nucleari redox-sensibili

Enzima de reparare a ADN APE/Ref-1 este o proteină cu funcţie duală care joacă un rol important în răspunsul transcripţional la stres oxidativ şi în repararea prin excizia bazelor a ADN.

Facilitează legarea la ADN a mai multor factori de transcripţie: AP-1, p53, NF-kB prin mecanisme redox dependente şi independente

Supraexpresia Ref 1 protejază celulele de stimuli apoptotici: stres oxidativ şi radiaţii

Scăderea expresiei Ref 1 este corelată cu apoptoza

Ref1 este implicat în diferite stadii ale carcinogenezei (iniţiere, promovare şi progresie) prin:

•Menţinerea balanţei redox intracelulare

•Activarea unui semnal de supravieţuirii

•Repararea leziunilor la nivel ADN

Nivele ridicate ale Ref-1:Nivele ridicate ale Ref-1:

Cancer de prostatăCancer de prostată Cancer cervicalCancer cervical Cancer ovarianCancer ovarian

Ref-1 prezintă activităţi Ref-1 prezintă activităţi enzimatice la nivel citoplasmatic şi enzimatice la nivel citoplasmatic şi nuclearnuclear