CRIOFRACTURAREA Criofracturarea este o metod folosit n tandem cu procedura de examinare n microscopie electronic. Metoda const n fracturarea unei probe biologice congelate. Detaliile expuse prin fracturare (planul de fractur) sunt accentuate prin depunerea unui strat subire de platin/carbon peste planul de fractur; depunerea stratului are loc sub vid. Se realizeaz o replic (copie perfect negativ), care poate fi examinat n microscopie electronic de transmisie. Imaginile furnizate de tehnica de criofracturare urmat de examinarea cu ajutorul microscopului electronic de transmisie au schimbat modul de nelegere a morfologiei funcionale a celulei, deoarece a permis accesul la zone inaccesibile doar prin tehnic de secionare. Este o metod special de vizualizare a feei interne a biomembranelor.

Metod Celulele sunt congelate n N2 lichid (-196C), indirect, ntr-un sistem bain-marie cu izopentan; piesa este imersat n izopentanul rcit indirect de azotul lichid (fig.2_1). Congelarea are loc n prezena unui agent de crioprotecie pentru a preveni distorsiunile (artefactele) determinate de formarea cristalelor de ghea. Ulterior blocul de ghea format este spart cu ajutorul unui cuit (fig. 2_2, 2_3). n cazul examinrii membranelor celulare, planul de fractur traverseaz adesea planul hidrofob al stratului bilipidic al plasmalemei. Feele de fractur rezultate sunt acoperite prin pulverizare sub vid cu un strat subire de platin-carbon. Stratul de carbon se face prin depunere vertical (fig 2_4). Depunerea platinei se face sub un anumit unghi astfel nct unele zone capteaz mai mult metal i determin un aspect de umbr sub incidena unui fascicul de electroni (fig. 2_5). Se obine o replic de platin-carbon care este curat i examinat cu ajutorul microscopului electronic de transmisie. Se obine o replic de platin-carbon care este curat i examinat cu ajutorul microscopului electronic de transmisie. Curarea se realizeaz la presiune atmosferic i temperatura camerei, cu ajutorul unei soluii de hipoclorit de sodiu.

Fig.2. Etapele tehnicii de criofracturare.

2_1: etapa de congelare; 2_2 sistemul de fracturare;

2_3 detaliu asupra fenomenului de fracturare a probei congelate; 2_4 depunerea stratului de platin (vaporizare sub vid, unghi

Detalii privind tehnica de lucru: 1. Congelarea rapid a pieselor - metodele clasice presupun o etap preliminar n care, nainte de congelare, esutul este fixat n

glutaraldehid dup care este imersat n glicerol pentru crioprotecie. Imersia n glicerol mpiedic formarea cristalelor de ghea n interiorul probelor; fixare este necesar nainte de tratamentul cu glicerol, deoarece acest reactiv (glicerolul) afecteaz ultrastructura membranelor celulare;

- pentru congelare, esutul este imersat rapid (plonjat) ntr-un agent de congelare (de exemplu, azot lichid sau izopentan rcit in bain marie cu azot lichid);

2. Fracturarea pieselor congelate - Fracturarea pieselor congelate se realizeaz de obicei sub vid, prin utilizarea unei lame de microtom

rcite n azot lichid; piesa congelat se amplaseaz pe un suport rcit, apoi se lovete cu lama de microtom rcit i ea n prealabil (fig. 3A). Pentru probele subiri putem apela la tehnica de fracturare prin tensiune de forfecare (fig. 3B). Fracturarea unui frotiu de celule care este prea subire pentru impactarea cu un cuit sau lam presupune o metod derivat din fracturarea prin tensiune de forfecare (fig. 3C)

- Pentru fracturare, se poate utiliza i un dispozitiv articulat care impacteaz piesa congelat, sprgnd-o.

- Dispozitivul de fracturare este diferit n funcie de scopul cercetrii i de consistena probei.

Fig.2. Tehnici de fracturare

3. Realizarea replicii - Realizare replicii se efectueaz n 2 etape: umbrirea i intensificarea. - Umbrirea se realizeaz prin depunerea oblic, sub vid, prin vaporizare, a unui strat de platin (care

este opac la electroni) - Imediat dup umbrire, se realizeaz intensificarea, prin depunerea vertical, sub vid, prin vaporizare,

a unui strat de carbon, strat care este transparent la electroni (electronii utilizai de microscopul electronic de transmisie TEM - pentru formarea imaginii)

- Caracteristicile topografice ale suprafeei congelate i fracturate sunt de asemenea convertite n variaii de grosime ale replicii (stratului) de platin depus.

4. Curarea replicii - Dup realizarea replicii, proba este adus la presiune atmosferic i temperatura camerei. Materialul

biologic este ndeprtat prin curare cu soluie de hipoclorit sau acid cromic. Se spal cu ap

distilat iar replicile sunt amplasate pe grile de examinare pentru microscopul electronic de transmisie TEM.

5. Rezultate, examinarea replicilor la TEM O mic parte din replic este amplasat pe o gril iar examinarea se face la TEM, la mriri diferite. n fig. 4A, imaginea este apreciat cu un microscop binocular simplu, pentru localizarea replicii. Fig. 4B i C prezint imaginile grilei cu replica depus, la microscopul electronic de transmisie (TEM) la mriri diferite.

Fig. 4. Examinarea replicii

EXEMPLE

Aspect al nucleului unei celule cu pori nucleari. Scala 1 micron

Celule trans-fracturate care prezint citoplasma (Cyt). Fractura a urmat apoi membranele celulare laterale (PM) pentru dou celule adiacente, expunnd astfel o jonciune strns (tj) care nconjoar polul latero-apical al celulelor n contact. O parte din jonciunea strns, delimitat de dreptunghiul alb este prezentat mrit, mai jos.

Deoarece linia de fractur trece prin spaiul extracelular, (ES), se observ numeroi cili (c).