Cataliza biochimică Interacțiunea enzimă-substrat › 2020 › 05 ›...

Enzimologie – Curs 6 – 2020

1

Cataliza biochimică

Interacțiunea enzimă-substrat

Studiile asupra structurii și a proprietăților cinetice ale enzimelor converg spre următoarea concluzie: enzimele au situsuri de legare bine definite pentru substratele lor. În decursul reacțiilor enzimatice se formează intermediari covalenți. Interacțiunile enzima-substrat implică grupări bazice, acide sau nucleofile. De exemplu, în cazul chimotripsinei clivarea legăturilor peptidice este acompaniată de formarea unei legături covalente de tip acil din partea unui rest de serină din situsul activ al enzimei. Reacția este susținută și de alte grupări din catena laterală a unor aminoacizi (resturile de aspartat și histidină sunt implicate în cataliză acido-bazică). Tioesterii acizilor grași sunt substrate enzimatice pentru o serie de transformări metabolice (por fi convertiți în energie în cadrul lanțului respirator din mitocondrie sau folosiți la sinteza triacil-glicerolilor). Reacția prin care o grupare de acid gras din Acil-SCoA este transferată pe o moleculă de glicerină poartă numele de reacție de transesterificare. În cazul reacției catalizată de mono acilglicerol transferaza în starea de tranziție se formează un intermediar (tetraedric) covalent între un rest de cisteină și atomul de C (din gruparea acil) a substratului.

Enzimele sunt proteine specifice, lucru care a fost sugerat de Emil Fischer încă din 1894. Acesta a postulat faptul că enzima și substratul sunt caracterizate prin forme geometrice complementare. Acest model este cunoscut în literatura sub numele de lacăt-cheie. Deși acest model explică specificitatea enzimelor pentru substrat, nu poate explica maniera în care acestea sunt stabilizate în momentul în care ating starea de tranziție. În 1958 Daniel Koshland a sugerat o modificare a modelului lacăt-cheie deoarece enzimele au structuri flexibile iar situsul activ este modificat ca urmare a interacțiunilor cu substratul. Astfel, substratul nu este captat de un situs catalitic rigid. Catena laterală a aminoacizilor din situsul catalitic se “mulează” într-o asemenea manieră încât să faciliteze o interacțiune eficientă cu substratul. În unele cazuri substratul își modifică ușor conformația după intrarea în situsul activ al enzimei (glicozidazei). Geometria situsului catalitic se modifică până în momentul în care substratul este complet legat, stadiul în care se atinge forma finală și încărcările necesare catalizei.

Multe din conceptele catalizei se bazează pe teoria starii de tranziție (principiile și aplicațiile acesteia).

Teoria stării de tranziție. Postulatul lui Hammond

Există câteva teorii (teoria coliziunilor etc) care descriu cinetica chimică. Teoria stării de tranziție este utilizată pentru stabilirea unor corelații între structură și reactivitate. În starea fundamentală sunt considerate entități fizice numai reactanții pe când în starea de tranziție apar numai speciile instabile (energia liberă cea mai mare). Astfel, starea de tranziție este caracterizată printr-un maxim în diagrama de reacție, în care se urmărește dependența energiei speciilor în decursul reacției catalizate. În starea de tranziție se formează legaturi chimice noi concomitent cu ruperea altor legături chimice. În cazul intermediarilor de reacție legăturile chimice sunt pe deplin formate și energiile acestora sunt mult mai mici comparativ cu energia corespunzătoare stărilor de tranziție.

Cea mai simplă modalitate de analiză a ratei de descompunere a unei specii este aceea care considera că starea fundamentală și starea de tranziție sunt în echilibru termodinamic, în așa fel încât concentrația poate fi calculată din diferențele de energie (dintre starea de tranziție și starea fundamentală, G‡).


2

[X‡] = [X] exp -G‡

RT

= [X‡] = [X] -d[X]

dt

kT

h exp -G

‡

RT

k1 = kT

h exp S

‡

R

T

exp -H‡

RT

În cazul unei reacții unimoleculare concentrația speciei în starea de tranziție, [X‡], și cea în stare fundamentală, [X], depind de diferența de energie, G‡, dintre cele două stări: Frecvența la care starea de tranziție se descompune este aceeași cu frecvența de vibrație, , la care se desface legătura. Frecvența se poate obține din egalarea energiei corespunzătoare unui oscilator cu aceea calculată din teoria cuantică (E = h = kT, unde k-constanta lui Boltzmann, h-constanta lui Planck).

Rata de descompunere a speciei X se poate determina astfel:

Constanta vitezei de reacție de ordinul I atribuită descompunerii speciei X este:

Ținând cont de componentele entalpică si entropică ale energiei de activare constanta vitezei de reacție se poate scrie:

Astfel, cu cât valoarea G‡ este mai mare cu atât constanta de viteza este mai mică. Explicația constă în faptul că numărul de molecule de reactant care posedă suficientă energie termică pentru a atinge starea de tranziție scade dramatic cu creșterea G‡. Majoritatea reacțiilor chimice necesită mai multe etape. Pentru o reacție care are două etape:

A I P unde I este intermediarul reacției

avem de-a face cu două stări de tranziție și două bariere de activare. Profilul diagramei la starea de tranziție este in strânsă legătură cu vitezele relative de reacție a celor două etape. Dacă energia de activare a primei etape este mai mare decât a celei de-a doua, atunci prima etapă este mai lentă decât cea de-a doua, și vice-versa. Într-o reacție chimică care implică mai multe etape, etapa cu energia stării de tranziție cea mai ridicată induce o atenuare a vitezei reacției globale și de aceea poartă numele de etapa determinantă de viteză.

Semnificația și aplicarea teoriei stării de tranziție Importanță teoriei stării de tranziție reiese din diferențele energetice (energia

Gibbs) care apar între starea de tranziție și starea fundamentală. Aceste diferențe sunt importante în special în cazul în care se compară diferența de reactivitate a unor substrate sau viteza unei reacții în anumite condiții (pH, tărie ionică).

Postulatul lui Hammond Postulatul lui Hammond prevede faptul că în situația în care pe parcursul unei

reacții există un “intermediar” instabil atunci starea de tranziție pentru reacție va avea o structura asemănătoare cu aceea a intermediarului. Aceasta fapt permite aproximarea structurii în starea de tranziție, fapt care permite prezicerea tipului de stabilizare necesar acestei stări. De exemplu, carboxanionii sunt intermediari in reacția catalizată de lizozimă. Dat fiind faptul că aceste specii sunt instabile se pot aproxima aceștia cu starea de tranziție. Postulatul lui Hammond se aplică în special în cazul reacțiilor de ordinul I.

k1 = kT

h exp -G

‡

RT


3

Energia de activare

Catalizatorii acționează într-o așa manieră încât micșorează energia liberă a stării de tranziție comparativ cu reacția necatalizată. Diferența dintre valorile G‡ pentru reacțiile catalizate Ea și necatalizate (Ea’) indică eficiența catalizatorului. Creșterea constantei vitezei de reacție (raportulului dintre viteza reacției catalizate și necatalizate) este dată de expresia e G‡/RT. De exemplu la 25 0C creșterea de zece ori (cu un ordin de mărime) a constantei vitezei de reacție necesită o valoare pentru G‡ de 5,71 KJ/Mol, valoare care este apropiată cu jumătate din energia liberă a unei legături de hidrogen. Analog, pentru o creștere a vitezei de reacție cu șase ordine de magnitudine este nevoie de o valoare a G‡ de 34 KJ/Mol, care constituie o fracțiune din energia liberă a unei legături covalente.

Stabilizarea stării de tranziție (cataliza acido-bazică, electrofilă sau nucleofilă)

Pentru a înțelege de ce enzimele sunt eficiente în actul catalitic este necesară explicarea vitezelor mici a reacțiilor necatalizate in soluție.

Un exemplu îl constituie chimotripsina sau lizozima, enzime care catalizează scindarea esterilor. În cazul reacției necatalizate atacul apei la ester conduce la o stare de

tranziție în care sarcina pozitivă este localizată pe atomul de oxigen din molecula de apă iar cea negativă pe oxigenul carbonilic. În cazul hidrolizei unui acetal starea de tranziție este caracterizată prin prezența unei sarcini pozitive pe atomul de carbon și a unui ion alcoxid.

În ambele situații starea de tranziție este nefavorabilă datorită sarcinilor pozitive și negative formate. Din acest motiv se impune stabilizarea acestor sarcini. Această stabilizare implică scăderea energiei stării de tranziție. În cazul sarcinii pozitive, prezentă în starea de tranziție a reacției esterului cu apa, stabilizarea poate fi obținută prin transferul unui proton (de la apă) la o bază în timpul reacției. Acesta constituie un caz de cataliza bazică. Analog, sarcina negativă care apare pe ionul alcoxidic în cazul hidrolizei acetalului poate fi stabilizată prin transferul protonului de la un acid (cataliza acidă). Mai mult, sarcina negativă poate fi stabilizată de ioni metalici (Zn2+, Mg2+) fenomen cunoscut sub denumirea de cataliza electrofilă. Sarcina pozitivă a carbocationului poate fi stabilizată și de un ion carboxilat.

Toate reacțiile mai sus menționate funcționează prin stabilizarea stării de tranziție fară a schimba mecanismul de reacție. Există însă și situații în care catalizatorii recurg la alte modalități de reacție. Cataliza nucleofilă este întâlnită in cazul transferului grupelor acil sau a reacțiilor hidrolitice. Astfel, reacția de hidroliză a anhidridei acetice este mai rapidă în prezenta piridinei datorită formării rapide a ionului de acetil-piridiniu (intermediar reactiv).


4

În enzime, cele mai frecvente grupări nucleofile care intervin în cataliza (nucleofilă) sunt:

a) gruparea hidroxil a serinei - întâlnită în serin proteaze, colinesteraze, esteraze, lipaze și fosfataze (acide și alcaline);

b) gruparea hidroxilică a tirozinei este un agent nucleofil în glutamin sintetază și în topoizomeraze;

c) gruparea tiolică a cisteinei - întâlnită în cazul tiol proteazelor (papaină, ficină și bromelaină) și gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza;

d) imidazolul din histidină funcționează de obicei în cataliza acido-bazică prin creșterea nucleofilicității grupărilor hidroxilice și tiolice mai sus menționate, dar există și situații când acționează ca nucleofil (în transferul grupărilor fosfat);

e) gruparea amino (lizinică) intervine în cataliza acetoacetat decarboxilazei, aldolazei sau transladolazei;

f) gruparea carboxilică (aspartat) este des întâlnită în ATP-aze (K+/Na+, Ca2+). Hidroliza peptidelor de către proteaze constituie un exemplu clasic de cataliză

nucleofilă. Peptidele, compuși relativ stabili, sunt convertiți la specii mult mai reactive (tio/ester acil-enzime), care sunt hidrolizate rapid.

Cataliza nucleofilă este un exemplu de cataliză covalentă în care substratul este modificat “provizoriu” prin formarea unei legături covalente cu catalizatorul fapt care conduce la un intermediar reactiv. Există și numeroase exemple de cataliza electrofilă care se bazează pe același principiu (modificări covalente). De exemplu în reacția piridoxal fosfatului se formează o baza Schiff, iar în cel al tiamin pirofosfatului electronii sunt stabilizați prin delocalizare.

Dacă în cazul reacțiilor catalizate în soluție constantele vitezelor de reacție sunt de ordinul 2, în cazul reacțiilor care implică complexul enzima-substrat acestea sunt de ordinul 1, existând grupe acide sau bazice care sunt parte integrantă a catalizatorului.

Unul din cei mai importanți factori în cataliza enzimatică este entropia. Reacțiile catalitice clasice în soluție sunt lente deoarece aducerea în vecinătate a catalizatorului și substratului presupune o scădere a entropiei. Reacțiile enzimatice presupun obținerea unui complex enzima-substrat, astfel încât în starea de tranziție nu are loc pierderea entropiei de translație sau rotație. Grupările implicate în cataliza enzimatică au o concentrație efectivă mult mai mare comparativ cu cele din reacțiile bimoleculare (în soluție). Entropia care se pierde este compensată de energia de legare a substratului la enzimă.

În soluție apoasă apa obstrucționează cataliza electrostatică. Energia de interacțiune electrostatică dintre două molecule încărcate aflate la distanta r într-un mediu cu constanta dielectrică D este data de expresia: E = e1e2/Dr

Dacă în vid valoarea energiei de interacțiune a unui proton cu un electron aflați la o distanta de 3,3 A este de circa –100 Kcal/Mol în mediul apos (D=79) această valoare scade la –1,3 Kcal/Mol.

Enzimele pot stabiliza stările de tranziție polare mai eficient decât apa. Proteina este un mediu heterogen în care constanta dielectrică D, poate varia. Acest fapt este o consecință a suprapunerii dintre resturile alchil nepolare și legăturile amidice polare. Calculele teoretice au demonstrat existența a cel puțin două sau trei tipuri de dipoli în enzimă. Acești dipoli au de obicei o orientare fixă direcționându-se spre substrat.


5

Enzimele utilizează părți din structura acestora sau leagă ionii pentru a “solvata” starea de tranziție.

În metalo-enzime ionii metalici joacă rol de catalizator electrofilic, stabilizând sarcina negativă care se formează. De exemplu, în cazul carboxi-peptidazei oxigenul carbonilic din gruparea amidică a substratului este coordinat cu ionul de zinc al enzimei. Coordinarea polarizează legătura amidică la atacul nucleofil și stabilizează intermediarul tetraedric. Formarea acestui tip de complex determină o creștere a vitezei de reacție cu peste patru ordine de magnitudine.

Studii cinetice din chimia anorganică au dovedit faptul că moleculele de apă care se leagă de ionii metalici sunt potențiali agenți nucleofili. De exemplu, anhidraza carbonică, o enzima care catalizează hidratarea CO2, are în interiorul situsului catalitic un ion de zinc care este coordinat de trei cicluri imidazolice (provenite de la trei resturi de histidină, Schema 1). Cel de-al patrulea ligand este o moleculă de apă (pKa =7). Specia reactivă este considerată a fi gruparea hidroxilică (provenită din ionizarea apei, Schema 2) legată de ionul de zinc.

Schema 1. Situsul activ al anhidrazei carbonice

Zn2+

Im

Im

Im

O

H

C

O

O

+ Zn2+Im

Im

Im

O

H

C

O

O

OH C

O

O

H2O

Zn2+

Im

Im

Im

O

H

+

H

-H

H

Schema 2. Generarea agentului nucleofil în situsul activ

al anhidrazei carbonice

R C

NHR'

O

RO-

Zn2+

R C

NHR'

O-

RO

Zn2+

His 64

Zn

N NH

N

N

N N

His 96

His 94

H

O H

N N

His 119

O

C

O

Glu 117

O

CO

Glu 106CH

O

Thr 199

H

CH3

O

C

NH

O

C

H2N

Gln 92

H

H H

cate

na

po

lip

ep

t id

i ca


6

Există și situații mai complexe în cataliza cu ioni metalici. De exemplu, cobaltul din vitamina B12 formează legături covalente cu atomii de carbon din substrat. De asemenea, metalele acționează ca transportori de electroni în reacțiile redox. Un exemplu îl constituie oxidarea reversibilă a ionului de fier din hemul citocromului c. Cataliza covalentă Cataliza electrofilă prin intermediul unei baze Schiff Un exemplu de activare a unui substrat este acela de formare a unei baze Schiff prin condensarea unei amine cu un compus carbonilic. Baza Schiff rezultată poate fi protonată la pH neutru. Sarcina pozitivă astfel formată poate asigura stabilizarea sarcinii negative de la atomul de carbon din poziția . După tautomerizarea la forma enaminică carbonul metilenic este activat ca un nucleofil.

C O

- H2O +HR'

"R

H2NR C NR

R'

"R

C NHR

R'

"R

C NHR

H3C

"R

-H

C NHR

H2C

"R

C NHR

H2C

"R

Acetoacetat decarboxilaza

Enzima catalizează decarboxilarea acetoacetatului la acetonă și dioxid de carbon. Reacția neenzimatică implică expulzarea ionului enolat la pH neutru.

C

O

H3C

CH2

+ CO2C

O

O

C

O

H3C

CH2

Reacția enzimatică are loc prin formarea intermediară a unei baze Schiff cu un rest de lizină. După decarboxilarea produsului de condensare imina protonată este rapid eliminată. Acest proces poate fi imitat în soluție prin folosirea anilinei drept catalizator.

CO

CH3

CH2

- CO2

CO

O

NH2EH

+

C

CH3

CH2

CO

O

N

H

E C

CH3

CH2

H

NE

C

CH3

CH3

N

H

E

H2OH

+NH2E+ + C

CH3

CH3

O

Evidența apariției acestui intermediar a fost demonstrată prin reducerea bazei Schiff cu borohidrură, enzima rezultată având un rest de izopropil-lizină.


7

CH3COCH2CO2NH2E C

CH3

CH3

N

H

E

BH4-

+ CH

CH3

CH3

NH2E

Aldolaza și transaldolaza

Condensarea aldolică și reacția de clivare inversă pot fi catalizate de aceste enzime ambele reacții decurgând prin intermediul unei baze Schiff. Reacția este similară cu cea a acetoacetat carboxilazei. Reacția de condensare ilustrează o altă funcție a bazei Schiff-activarea carbonului prin intermediul unei enamine.

C O

CH2

CH2 OHH2N E

H+

O P

C

CH2

CH OH

N

H

E

O P

H

H+

C

CH2

C

HO

H

N E

O P

H

C

OH

R

H+

C

CH2

CHO

N

H

E

O P

H

C OHH

R

H2O C

CH2

CHO

O

O P

H

C OHH

R

H2N E+

Cataliza electrofilă în cazul piridoxal fosfatului

Piridoxal-fosfatul (coenzimă) poate fi implicat în formarea unei baze Schiff. Nucleul de piridină stabilizează o sarcină negativă. Îndepartarea atomului de hidrogen din poziția conduce la un intermediar care poate reacționa in două moduri diferite: prin racemizare (atacul protonului la iminoacid) sau transaminare (atacul protonului la carbonul carbonilic din piridoxal conduce la o bază Schiff a unui -cetoacid cu piridoxamina). Hidroliza acestei baze conduce la -cetoacid cu piridoxamina.

C

O

O

CH2 - CO2C

CO2

N

HH2C

NH

O

H2C

C

CO2

N

HH2C

NH

O

H3C

CH

CO2

NH2

CHO

NH

O

+


8

-decarboxilarea În cazul în care aminoacidul este aspartat produsul intermediar este o bază Schiff

care facilitează decarboxilarea acetoacetatului (vezi pagina anterioară). Cataliza electrofilă-tiamin pirofosfatul

Tiamin pirofosfatul este o coenzimă care se leagă covalent la substrat pentru a stabiliza o sarcină negativă. Sarcina pozitivă de pe atomul de azot permite ionizarea atomului de carbon din poziția 2 prin stabilizare electrostatică. Carbonul ionizat este un potențial nucleofil care poate ataca compușii carbonilici pentru a forma legături carbon-carbon.

Transcetolaza este o enzimă care conține tiamin pirofosfatul și poate transfera printr-o reacție similară o grupa dihidroxietilică între 5-fosfatul de D-xiluloză și 5-fosfatul de D-riboză.

Cinetica stării staționare

Conceptul de stare staționare este larg utilizat pentru sistemele dinamice. Acesta se referă în general la situații în care o cantitate particulară este constantă (în stare staționară) deoarece rata de formare a acestuia este egală cu rata de distrugere. De exemplu, populația unei țări este în stare staționară atunci când rata natalității și a imigrației sunt egale cu rata mortalității și a emigrației. În mod analog, concentrația unui metabolit dintr-o celulă este în stare staționară când acest compus este produs cu o viteză egală cu viteza de degradare a acestuia. În cazul unei reacții dintre o enzimă și o cantitate mare de substrat există o etapă inițială (stare prestaționară) în care concentrațiile intermediarilor cresc până la stabilirea stării staționare a fiecăruia. Odată ce intermediarii ating starea staționară, viteza de reacție se schimbă încet în decursul procesului catalitic. Starea staționară este o aproximație deoarece substratul este consumat în decursul procesului enzimatic, dar poate oferi informații asupra vitezei de reacție într-un interval îngust de timp (atunci când concentrația substratului nu se modifică semnificativ).

Dacă pentru analiza mecanismelor chimice din cadrul catalizei enzimatice sunt adecvate determinările cinetice în starea prestaționară aplicarea cineticii stării staționare este importantă pentru înțelegerea metabolismului, deoarece permite măsurarea activității catalitice a enzimei în condițiile stării staționare din vivo (celulă).

Ecuația Michaelis-Menten. Teoria stării staționare

Pentru obținerea acestei ecuații se pleacă de la următoarele premize: concentrația enzimei este neglijabilă comparativ cu concentrația substratului (datorită eficienței

catalitice deosebite a enzimei), viteza de reacție inițială (bazată pe formarea primelor câtorva procente de produs sau pe consumul de substrat) schimbările de concentrație ale produsului sau substratului nu sunt semnificative. De aceea, modificările concentrației reactivilor sunt în general liniare cu desfășurarea reacției (în timp). S-a constat experimental faptul că v este direct proporțională cu concentrația enzimei,

[E]0. Oricum, viteza de reacție urmează o cinetică de “saturație” în raport cu concentrația substratului, [S]. La concentrații suficient de mici ale substratului, v crește liniar cu [S].


9

Odată cu creșterea lui [S] această relație de liniaritate dispare și v crește mai lent comparativ cu [S] (la o valoare de saturație a acesteia) atingând o valoare limită a vitezei vmax. Acest lucru poate fi exprimat cantitativ de ecuația Michaelis-Menten, una dintre ecuațiile frecvent utilizate în cinetica enzimatică:

unde: kcat [E]0 = vmax

Concentrația substratului la care v = vmax/2 este cunoscută sub numele de constanta Michaelis, KM. La concentrații foarte mici ale substratului ([S]KM) viteza este direct proporțională cu concentrația substratului:

Interpretarea fenomenelor cinetice pentru reactia enzimei cu un singur substrat

În 1913, L. Michaelis și M. L. Menten au dezvoltat teoriile cercetătorilor anteriori. Ei au propus următoarea schemă: Reacția catalitică poate fi divizată în două procese: enzima și substratul se combină într-o primă etapă pentru a da naștere la complexul enzimă-substrat, ES. Această etapă este rapidă și reversibilă și nu este însoțită de schimbări chimice (enzima și substratul interacționează prin intermediul forțelor fizice). Procesul chimic se desfășoară în a doua etapă cu o constantă catalitică de ordinul I, kcat. Ecuațiile care conduc la expresia Michaelis Menten sunt: De asemenea, concentrația totală a enzimei, [E]0, si cea a enzimei libere, [E], pot fi corelate prin ecuația: Din cele 3 ecuații, mai sus menționate, rezultă următoarea expresie:

si implicit relația: Ultima ecuație este de fapt ecuația Michaelis Menten unde constanta de disociere Ks este egala cu KM.

Există, desigur, și un complex enzimă-produs, EP, a cărei formare poate fi reversibilă. În analizele mai sus menționate s-a plecat de la premisa că disocierea acestui complex (EP) este atât de rapidă încât reacția inversă poate fi ignorată. Dat fiind faptul că vitezele de reacție sunt măsurate în momentul în care o cantitate mică de substrat este scindată (respectiv o cantitate mică de produs este formată) se poate neglija acumularea lui EP.


10

v = [E]0[S]k2

[S] + (k2 + k-1)/k1

(k2 + k-1)/k1 = Km

k2 = kcat; vmax= [E]0 kcat

= Km

vmax 1 v

1

[S] · +

1 vmax

= Km vmax v v

[S] · -

Variante ale ecuației Michaelis-Menten

Cinetica reacțiilor enzimatice cu un singur substrat se bazează pe teoria stării staționare elaborată de Haldane si Briggs (1925): în decursul reacției enzimatice concentrația speciei intermediare, ES, rămâne constantă. În aceste condiții rata de formare a complexului enzimă-substrat, ES, este egală cu rata de consum a acestuia.

d[ES]/dt = 0 = k1[E][S] - k2[ES] - k-1[ES]

În situația în care k2 este constanta vitezei de reacție a etapei determinante de viteză (etapă mai lentă, k2


11

având valoare negativă, viteză de reacție) se trasează o dreaptă. După întersecția acestor drepte, obținute prin reprezentare grafică, rezultă un punct având drept coordonate (Km, vmax).

Controlul alosteric al activității enzimatice

Un organism este capabil să regleze activitatea catalitică a enzimelor componente și ca atare acesta poate coordona diferite procese metabolice, de a răspunde la schimbările de mediu, de a crește sau diferenția, toate acestea într-o manieră ordonată. Există două modalități de reglare a activității enzimatice:

a) Controlul disponibilității enzimei. Cantitatea de enzimă dintr-o celulă depinde de rata de sinteză sau de degradare a acesteia. Fiecare dintre aceste rate este controlată direct de celulă și este subiectul schimbărilor dramatice care apar în decursul minutelor (în cazul bacteriilor) sau chiar a orelor (în organismele superioare);

b) Controlul activității enzimatice. Activitatea catalitică a enzimei poate fi direct controlată prin alterările structurale care influențează afinitatea enzimei față de substrat. Hemoglobina este o proteină intracelulară care este responsabilă pentru respirația

celulară. Hemoglobina mamiferelor este un tetramer (22). Legarea oxigenului la hemoglobină alterează structura tetramerului. Curba de legare a oxigenului la hemoglobină este sigmoidală, lucru care indică o interacțiune cooperantă între situsurile de legare (aflate la interfața subunității 1 cu subunitatea 2 și vice-versa). În cazul hemoglobinei legarea la un situs catalitic determină o creștere a afinității față de oxigen a subunităților rămase. Hemoglobina are două stări conformaționale: starea T (conformația deoxihemoglobinei) și starea R (conformația oxihemoglobinei). Conformațiile celor 4 subunități al hemoglobinei în starea T diferă de cele din starea R. Legarea oxigenului determină o serie de mișcări care au drept consecință trecerea dintr-o stare în alta pentru câteva secunde. Legarea oxigenului la hemoglobină este influențată de: prezența dioxidului de carbon (care favorizează starea T și ca atare eliberarea oxigenului), prezența în sânge a D-2,3-difosfogliceratului (se leagă puternic la deoxihemoglobina și slab la oxihemoglobina) sau pH.

Legarea cooperantă a oxigenului la hemoglobină este modelul clasic a multor proteine (incluzând și anumite enzime) care leagă molecule mai mici. În unele cazuri, legarea ligandului la un situs determină creșterea afinității la celelalte situsuri de legare ale aceleiași proteine (legarea oxigenului la hemoglobină), iar în alte situații o diminuare a afinității celorlalte situri de legare. Aceste efecte poartă numele de efecte alosterice (grec. allos=alt, stereos=solid, spațiu).

Există două modele care descriu modalitățile de cooperare dintre subunități la legarea ligandului:

1. modelul simetric de alosterism presupune următoarele: - proteina este un oligomer cu subunitățile orientate simetric; - oligomerul poate exista în cele 2 stări conformaționale (T si R), stări care se află

în echilibru; - ligandul se leagă la o subunitate aflată în ambele stări conformaționale (numai

schimbările conformaționale afectează afinitatea pentru ligand);


12

- simetria conformațională este păstrată în decursul schimbărilor conformaționale (nu sunt oligomeri care sa conțină subunități în ambele stări, T si R); Un dezavantaj al modelului simetric este acela al dificultății păstrării simetriei

oligomerului, care presupune faptul că trecerea de la starea T la R se face în toate subunitățile la care s-a legat ligandul (cooperare pozitivă).

2. Modelul secvențial presupune faptul că legarea ligandului induce schimbări conformaționale în subunitatea la care este legat, iar interacțiunile cooperative din subunitățile vecine sunt rezultatul acestor schimbări conformaționale. Afinitatea ligandului pentru subunități variază cu conformația acestora și poate fi mai mare sau mai mică (cooperare pozitivă sau negativă).

Schimbările alosterice pot cauza modificări majore ale activității enzimatice. Activitatea unor enzime poate fi controlată prin modificarea covalentă, în mod curent fosforilarea sau defosforilarea, a unor resturi din catena laterală a unor aminoacizi (Ser, Thr, Tyr) din lanțul polipeptidic.

Inhibiția feedback a ATCazei controlează sinteza pirimidinei

Aspartat transcarbamoilaza (ATCaza) catalizează formarea N-carbamoil aspartatului din fosfatul de carbamoil și aspartat:

Model secvențial Subunitățile sunt convertite secvențial din forma tensionată (T, roșu) în cea

relaxată (R, verde)

Model de alosterism simetric


13

Această reacție enzimatică intervine în prima etapă din biosinteza pirimidinelor. Dacă se reprezintă viteza de reacție în funcție de concentrația aspartatului se obține o curbă sigmoidală, lucru care indică o comportare alosterică a acestei enzime.

Factorii alosterici (nucleotididele) pot deplasa această curbă spre concentrății mai mici (ATPul) sau mai mari (CTPul). CTPul, un produs al căii de biosinteză a pirimidinei este un exemplu de inhibitor feedback, deoarece inhibă etapa inițială a biosintezei. Astfel, când nivelul concentrației CTPului este ridicat, CTP se leagă la ATCază reducând viteza de sinteză a N-carbamoil-aspartatului și invers.

Semnificația metabolică a activării cu ATP (a ATCazei) este atribuită tendinței acestei molecule de a controla viteza de sinteză a nucleotidelor purinice și pirimidinice. Ca urmare, dacă concentrația ATP-ului este mai mare decât a CTP-ului, ATCaza este activată, favorizând sinteza nucleotidelor pirimidinice până când concentrația acestora (ATP și CTP) se egalează. În cazul în care concentrația CTPului este mai mare decât a ATPului, inhibiția CTPazei (Schema 1) permite biosinteza nucleotidelor purinice fapt care conduce la o echilibrarea a concentrației CTPului cu aceea a ATPului.

Schema 1. Reprezentarea inhibiției “feed-back” a ATCazei de

către unul din produșii căii metabolice de biosinteză a pirimidinei

Cataliza biochimică Interacțiunea enzimă-substrat › 2020 › 05 ›...

Documents

Transcript of Cataliza biochimică Interacțiunea enzimă-substrat › 2020 › 05 ›...