CAPITOLUL 8TESTAREA CITOTOXICITĂŢII ACUTE DERMICE ŞI OCULARE

8.1. Introducere

Agenţiile de reglementare din SUA au în prezent ghiduri de testare a

substanţelor chimice şi materialelor cu înalt potenţial de expunere umană accidentală,

inadvertentă sau clinică. Aceste substanţe sunt destinate administrării cutanate şi

oculare ca medicamente sau agenţi biologici pentru oameni şi animale, sau pentru

aplicaţii chimice comerciale (industriale, ocupaţionale, ambientale şi domestice).

Necesităţile de evaluare a toxicităţii cutanate in vivo sunt controlate de

reglementările SUA şi UE. Astfel, elaborarea studiilor destinate evaluării

toxicităţiilor acute dermale şi oculare necesită modele animale pentru a garanta

siguranţa formulelor diferitelor substanţe înainte de apariţia lor pe piaţă pentru

consum uman.

Procedurile implicate în studiile in vivo pentru evaluarea toxicităţii cutanate şi

oculare sunt unice, iar metodele folosite pentru testarea toxicităţii in vivo a acestor

produse sunt discutate mai jos.

8.2. Testele citotoxicităţii acute cutanate

8.2.1. Descriere

Toate produsele pentru consum uman şi veterinar sunt reglementate pentru

evaluare în scopul testării toxicologice. Prin studiile de toxicitate dermală, iepurii

sunt standardul pentru evaluarea toxicitaţii (iritaţiei) locale. Cobaii sunt în general

menţionaţi în ghidurile de testare ca şi specie acceptată, dar este neobişnuită folosirea

lor pentru evaluarea toxicitaţii dermice. Aceştia au fost până recent specia preferată

pentru studiile de sensibilitate. Testul nodulului limfatic local (LLNA) efectuat pe

şoarecii CBA/Ca sau CBA/J reprezintă un model perfecţionat al testului pe cobai.

8.2.2. Iritaţia primară

Studile dermatologice sunt create pentru a oferii informaţii despre efectele

locale, în special iritaţii dermice şi coroziuni. Nevoia de a asigura siguranţa

consumatorului a generat un interes semnificativ, după sfârşitul celui de al 2-lea

război mondial şi dezvoltarea cercetării legate de războiul clinic. Astfel a luat naştere

testul Draize la mijlocul secolului XX, motivaţia fiind pericolul indus de unele

produse cosmetice (Auletta, 2004). Justificat ca o urgenţa pentru protecţia publică,

testul Draize a devenit o metodă aprobată de guvern pentru evaluarea siguranţei

produselor destinate contactului local. Testul ocular Draize este discutat in

subcapitolul 8.3.

Draize şi colaboratorii (1944) au publicat o evaluare cantitativă a iritaţiilor

dermice ca un ghid pentru siguranţa produsului. Ei au definit ca iritant local primar

substanţa care produce o reacţie dermică inflamatorie. Procesul inflamator aferent

iritaţiei dermice a fost caracterizat prin prezenţa edemului şi eritemului. Tabelul 8.1

evidenţiază gradarea reacţiilor primare a pielii de iepure, bazate pe observaţiile lui

Draize. Datorită riscului de durere şi lezare a pielii în urma aplicării cutanate a unor

produse, monitorizarea atentă a studiilor de toxicitate şi iritaţie cutanată este stabilită

de reglementările de protecţie a animalelor (Barile, 2004).

Tabelul 8.1. Gradarea reacţiilor pielii: iritaţia acută dermală

Iritaţia dermală Reacţia pielii ScorFormarea de eritem şi escară

Fără eritem 0Eritem foarte slab, de abia perciptibil

1

Eritem bine definit 2Eritem moderat spre sever 3Eritem sever spre formare de escară

4 (maxim)

Formare de edem Fără edem 0Edem foarte slab, de abia perciptibil

1

Edem bine definit 2Edem moderat (1 mm) 3Edem sever (dincolo de zona de expunere şi mai înalt de 1mm)

4

2

Actul de Protecţie a Animalelor reglementează îngrijirea şi folosirea majoritaţii

animalelor implicate în studiul testării toxicologice. Deşi şoarecii şi şobolanii nu sunt

protejaţi de acest act, majoritatea instituţiilor au adoptat standarde interne

asemănătoare pentru aceste specii. Actul indică faptul că testarea iritaţiei dermice este

un exemplu de procedură care determină probabil ceva mai mult decât o uşoară

durere de moment; în timp ce procedura de dozare nu este în general dureroasă,

reacţia la acel produs poate cauza durere (Basketter şi colab., 2005).

Iepurele este specia de referinţă pentru iritaţia dermică deoarece are o piele

relativ sensibilă în comparaţie cu pielea omului. De asemenea această specie este mai

uşor de manevrat comparativ cu specii mai mari, iar pielea de iepure are o

permeabilitate înaltă. Datorită sensibilitaţii crescute a iepurelui la agresiunea dermică,

reacţia se consideră în general a fi supraestimată faţă de iritaţia la om, aducându-se

astfel in discuţie relevanţa evaluării riscului la om. Multe reglementari curente

specifică şoarecii albinoşi ca fiind preferabili iepurilor, deşi aceştia din urmă înca mai

reprezintă standardul pentru evaluarea toxicitaţii (iritaţiei) locale. Cobaiul este de

obicei luat în considerare în testarea normelor ca şi o specie acceptabilă, dar este rar

folosită în evaluările iritaţiei toxice dermice.

8.2.2.1. Elaborarea studiului şi proceduri utilizate

Studiile iritaţiei dermice sunt concepute pentru a imita expunerea umană şi

sunt de obicei efectuate pe 1-3 iepuri albinoşi. Zona testării este pregătită prin

îndepărtarea blănii (de la 2 până la 3 cm2) pe spate sau pe abdomen. Iniţial un singur

animal este expus consecutiv (de la 3 min, la 1 h şi apoi la 4 h) produsului ce trebuie

testat (0,5 ml sau 0,5 g). Majoritatea medicamentelor şi materialelor biologice sunt

lăsate descoperite. Aplicaţiile pot fi acoperite dacă se aplică materialul sub un bandaj

(tratament arsură) sau pot fi acoperite cu îmbrăcăminte pentru a mima expunerea

ocupaţională la substanţe chimice. O acoperire semi-ocluzivă constă, de obicei, dintr-

un material poros asemănător tifonului ţinut pe loc cu bandă neiritantă. Dacă se

observă coroziunea dermică imediat după expunere, testul este terminat şi materialul

este catalogat ca fiind coroziv. Dacă nu se observă nicio coroziune, încă 2 animale

3

vor fi expuse materialului de probă pâna la 4 h şi iritaţia va fi catalogată conform

clasificării potenţialelor de iritaţie Draize, după cum este detaliat în tabelul 8.2. Suma

scorurilor medii de eritem şi edem este calculată şi listată ca indice primar de iritaţie

dermică (PDII).

Tabelul 8.2 Clasificarea potenţialului de iritaţie dermică

Clasificarea PDII Scor Non iritant 0,0 Iritant neglijabil >0,0 până la 0,5 Iritant uşor >0,5 până la 2,5 Iritant moderat > 2,5 până la 5,0 Iritant sever >5,0 până la 8,0

Alte detalii procedurale care să fie luate în considerare includ:(1) posibilitatea

de a alege mijlocul de administrare a solventului, (2) cantitatea de probă administrată,

(3) necesarul de echipament de contenţie a animalului şi (4) pregătirea zonelor de

piele intacte şi gradate (Robinson, Perkins, 2002). Detaliile sunt expuse în tabelul 8.3.

Tabelul 8.3 Alţi factori implicaţi în elaborarea studiilor iritaţiei dermice

Factor DescriereAdministrare prin solvent Solvent inert (soluţie salină), uleios doar pentru

aplicaţii particulare, pastă pentru solideVolumul probei Acoperire minimă şi uniformă a zoneiDispozitive de contenţie Doar în studii lungiPregătirea zonei de testare Intactă sau gratatăObservaţii post tratament Până la 4 ore; evaluare conform descrierii

anterioare

8.2.3. Sensibilitatea pielii

Evaluarea potenţialului de producere a sensibilitaţii este necesar pentru

majoritatea substanţelor chimice. De la aplicare până la penetrarea pielii, o substanţă

chimică poate provoca o reacţie iritativă, de obicei la zile sau săptămâni după

expuneri repetate. Acest tip de sensibilitate a pielii este cunoscut ca şi sensibilitate de

contact alergic sau dermatită. Răspunsul se dezvoltă după cel puţin 24 – 72 de ore şi

reacţia este caracterizată ca fiind reacţie imună mediată celular de tip IV

(hipersensibilitate de tip întârziat). Răspunsurile variază de la iritaţie uşoară rezultând

în eritem şi induraţie, până la dezvoltarea eczemelor, erupţiilor, şi manifestări imune

4

sistemice. Răspunsul la o substanţă chimică este dependent de doză, auto-limitant

(zile, săptămâni) şi de o intensitate variată. Mai mult, procesul necesită sensibilitate

iniţială, adaptare şi reactivări ulterioare (Kimber şi colab., 2001).

Din punct de vedere imunologic, o reacţie implică activarea celulelor T antigen

specifice şi începe cu o reacţie intradermică sau mucoasă (stadiul de sensibilizare).

Apoi celulele T CD4+ recunosc antigenele MHC-II (clasa II de histocompatibilitate

majoră) de pe celule prezentatoare de antigen (APCs; celulele Langerhans, de ex) şi

se diferenţiază în celule Th1. Faza de sensibilizare necesită contact local prelungit

(cel puţin 2 săptămâni). O reacţie ulterioară repetată determină celulele diferenţiate

Th1 (memorie) să elibereze citokine, stimulând mai departe atracţia monocitelor

fagocitare şi a granulocitelor. Eliberarea enzimelor lizozomale din fagocite determină

necroza tisulară locală. Hipersensibilitatea de contact rezultată din expunerea

prelungită la răşini şi bijuterii, de exemplu, este indusă de lipofilia unei substanţe

chimice din secreţiile uleioase ale pielii, ce acţionează astfel ca o haptenă. Deşi

majoritatea reacţiilor sunt auto-limitante, expunerea prelungită determină necroza

tisulară.

8.2.3.1. Modelul studiului şi proceduri utilizate

Invariabil, animalele destinate testării în studiile sensibilităţii dermice sunt

cobaii, datorită unei susceptibilităţi a speciei la sensibilizatorii chimici. În consecinţă,

cele mai comune metode de sensibilizare includ testul de maximizare a cobailor

(GMPT) al lui Magnusson şi Kligman precum şi testul Buehler (Buehler, 2004).

Studiile folosesc de la 10 până la 20 de animale dintr-un grup de tratament şi de la 5

până la 10 animale din grupul de control. Pentru GPMT, inducţia este începută

conform metodei adjuvante, de o serie de injecţii intradermice (substanţa de testat,

adjuvantul Freund şi substanţa test în adjuvant), urmată la o săptămână de o aplicare

topică şi de o provocare topică după încă 2 săptămâni.

În testul Buehler, trei aplicaţii topice administrate la 1 săptămână distanţă

constituie faza de inducţie, urmată de o provocare topică la 2 săptămâni. Apariţia

edemului sau a eritemului după doza de provocare, este mai intensă decât rezultatele

5

după doza de sensibilizare, constituind un indicativ de sensibilitate. Pentru ambele

studii au loc controale periodice cu un sensibilizator dermic cu acţiune blândă până la

moderată.

Testul LLNA este o alternativă validată ştiinţific de a evalua potenţialul

substanţelor care produc sensibilizare dermică. LLNA utilizează femela adult a

şoarecilor CBA în locul cobailor. Procedura se desfăşoară în decursul unei săptămâni

şi este mai puţin stresantă şi dureroasă. Testul se bazează pe evaluarea vizuală a

capacităţii unei substanţe chimice de a provoca reacţii alergice la nivelul pielii după

aplicaţii repetate de 20-30 de minute. La 3 zile după ultima aplicare, animalele

primesc injecţii intravenoase de 3H-thymidina sau I125. După 5 ore ganglionii

limfatici auriculari sunt excizaţi şi drenaţi şi radioactivitatea este standardizată

conform indexului de stimulare (SI). O valoare mai mare sau egală cu 3 este

considerată ca fiind indicator al sensibilităţii. Deşi validitatea probei a fost susţinută

de evaluatori independenţi (ICCVAM/NICEATM 2004; OECD Guideline 429,

2002), unele întrebări implică potenţialul de apariţie a rezultatelor fals pozitive

privind iritaţia şi slaba absorbţie a formulelor bazate pe apă (Auletta, 2004).

Ghidul revizuit OECD 404 mai sugerează faptul că datele referitoare la iritaţia

sau coroziunea pielii pot fi obţinute din alte studii animale. De exemplu, este posibil

să determinăm potenţialul iritativ sau lipsa lui prin revizuirea rezultatelor unui test de

toxicitate dermică. În plus, dacă un anumit produs este foarte toxic pentru calea

dermică, nu este necesar să se analizeze şi potenţialul său iritativ. Deşi este menţionat

ca fiind specific, există de asemenea posibilitatea obţinerii de informaţii despre

potenţialul iritativ al unei substanţe din rezultatele studiilor ce analizează

sensibilitatea dermatologică sau a studiilor efectuate în vederea confirmării siguranţei

folosirii unui produs dermatologic la om.

8.2.4. Reacţii fotoalergice şi fototoxice

Fototoxicitatea dermică a unei subsţante chimice se defineşte ca fiind răspunsul

provocat de expunerea la lumină, în special la radiaţii ultraviolete (UV), urmată de

expunerea dermică sau sistemică imediată la o substanţa chimică. Efectele biologice

6

ale razelor ultraviolete se petrec la o frecvenţă mai mică şi la o lungime de undă mai

mare comparativ cu radiaţiile ionizante. Astfel, efectele radiaţiilor UV sunt benigne şi

mai puţin penetrante.

Spre deosebire de radiaţiile ionizante, agresiunea dermică produsă de către

razele UV este mediată în principal de generarea speciilor reactive de oxigen (ROS)

şi de întreruperea producţiei de melanină. Cu toate acestea, ca şi în cazul radiaţiilor

ionizante, expunerea îndelungată sau intensă la razele UV induce mutaţii ADN:

inserţii de perechi de baze, deleţii, rupturi monocatenare de ADN şi legări încrucişate

proteine-ADN. Mecanismele de reparare a ADN-ului joacă un rol important în

corectarea erorilor induse de expunerea prelungită la razele UV şi în prevenirea altor

consecinţe ale expunerii excesive la razele UV (ca şi în cazul arsurii solare).

Producţia de melanină din melanocite creşte şi epiderma se îngroaşă în

încercarea de a preveni alte efecte dăunătoare. Capacitatea de protecţie a enzimelor

antioxidante, precum şi mijloacele de reparare a ADN-ului se diminuează odată cu

înaintarea în vârstă, favorizând astfel apariţia neoplasmului la nivelul pielii. În plus,

razele UV pot converti substanţele chimice în specii reactive de oxigen (ROS) care

provoacă toxicitate celulară locală.

Extinderea agresiunii solare depinde de tipul de radiaţie UV, de durata şi

intensitatea expunerii, de îmbrăcăminte, sezon, altitudine şi latitudine şi de cantitatea

de pigment melanic prezent in piele. De asemenea, efectele nocive ale razelor UV

sunt filtrate de sticlă, smog şi fum şi se amplifică la reflecţia în zăpadă sau nisip.

Folosirea fară discriminare a clorofluorocarburilor duce la o depleţie a proprietăţilor

de blocare a razelor UV ale ozonului de la nivelul stratosferei, permiţând astfel

penetrarea unei cantităţi mai mari de raze UV prin straturile atmosferice superioare

protectoare.

Tabelul 8.4 însumează efectele cronice ale luminii solare si reacţiile de

fotosensibilitate. Cheratoza actinică, descrisă şi ca leziune cheratotică precanceroasă,

rezultă după o expunere solară ce durează ani, în special la persoanele cu tenul mai

deschis la culoare. Se prezintă ca umflături superficiale de culoare roz, slab

delimitate, cu coji sau îngroşari încrustate la nivelul pielii.

7

Tabelul 8.4. Efectele cronice ale expunerii solare şi reacţiile de fotosensibilitate

Reacţia la expunere solară excesivă

Efecte clinice

Reacţii generale dermatologice

Dermatohelioză: îmbătrânirea pielii datorită expunerii solare cronice; elastoză: decolorarea galbenă a pielii însoţită de noduli mici; riduri, hiperpigmentare, atrofie, dermatită

Cheratoză actinică Leziuni cheratotice premaligne după mulţi ani de expunere la raze UV

Carcinom cu celule scuamoase/bazale

Mai des la indivizii cu piele deschisă şi expunere extensivă la raze UV în timpul adolescenţei

Melanom malign Leziune dermală canceroasă asociată cu expunere intensă, prelungită la UV

Reacţii fotosensibile Eritem şi leziuni multiforme eritemice; urticarie, dermatită, bule; zone îngroşate, solzuroase

Reacţiile fotosensibile implică dezvoltarea de răspunsuri neobişnuite la lumina

solară, câteodată exagerate în prezenţa anumitor substanţe chimice sau a

circumstanţelor precipitante. Eritemul (roşeaţa) şi dermatita (inflamaţia pielii sau a

membranelor mucoase) sunt răspunsuri acute la reacţiile fotoalergice induse de razele

UV. Ele sunt mediate de dilatarea şi congestia capilarelor superficiale şi de o reacţie

de hipersensibilitate mediată celular de tip IV. In plus, în variatele reacţii

eritematoase multiforme se observă macule, papule, noduli si leziuni ţintă (în forma

de ochi de bou).

Urticaria este o erupţie cutanată pruriginoasă caracterizată prin leziuni

trecătoare, de dimensiuni şi forme variate, cu margini eritematoase bine definite şi

centru palid. Apariţia urticariei este mediată de dilataţia capilară la nivelul dermului,

ca răspuns la eliberarea de amine vasoactive (histamine şi chinine) în urma expunerii

solare, în special după expunere anterioară la o substanţă chimică. Reacţiile de

fotosensibilitate mai severe conduc la formarea de bule pe piele sau membranele

mucoase, mai mari de 1 cm în diametru şi cu lichid seros clar. Deshidratarea, cojirea,

cicatrizarea, fibroza şi necroza se dezvoltă pe măsură ce zona de arsură se vindecă.

Printre factorii exogeni ce participă la dezvoltarea reacţiilor de fotosensibilitate

sunt ingestia sau aplicarea antibioticelor antibacteriene sau antifungice (sulfonamide;

tetracicline; respectiv griseofulvin) şi a diureticelor tiazidice. Contactul dermic cu

8

produse ce conţin gudron, acid salicilic, derivaţi din plante şi ingredienţi din ape de

colonie, parfumuri, cosmetice şi săpunuri sunt surse adiţionale ale reacţiilor.

8.2.4.1. Modelul studiului şi procedee de testare

Testele in vivo pentru fotosensibilitate şi fototoxicitate sunt efectuate pe cobai

sau iepuri. Substanţele testate sunt administrate oral sau parenteral pentru 10 până la

14 zile sau sunt aplicate topic. Faza de provocare începe 2-3 săptămâni mai târziu cu

o altă doză plus expunere la o lampa UV. Factorii care afectează rezultatele testului

de fotosensibilitate includ predilecţia substanţei chimice de a absorbi lumina, durata

expunerii la UV şi proximitatea sursei de lumină faţă de zona expusă. Ca şi în cazul

altor teste dermatologice, grupurile de control încorporează agenţi fotoalergenici atât

pozitivi cât şi negativi. Leziunile sunt catalogate după descrierea anterioară.

8.3. Teste de toxicitate oculară acută

Nicio altă problemă în testarea toxicologică nu a provocat mai multe

controverse sau proteste ca testul ocular Draize. Publicat în anii 1940 ca o analiză

cantitativă a efectelor substanţelor chimice la nivelul ochilor iepurilor, a fost urmat de

un articol similar elaborat de Friedenwald şi colaboratorii (1944), ce propuneau o

metodă cantitativă pentru evaluarea severităţii metodelor de testare oftalmologică. În

zilele noastre, cercetările avansate din toxicologia oftalmologică pun în discuţie

validitatea, precizia relevanţa şi utilitatea testului ocular Draize (Abraham şi colab.,

2003).

Testele preclinice de siguranţă a produselor efectuate pe iepuri sau pe alte

mamifere au ridicat de asemenea discuţii etice de protecţie a animalelor. Totuşi, testul

ocular Draize rămâne pâna acum singura procedură oficială reglementată folosită

pentru predicţia iritanţiilor oculari. Odată cu dezvoltarea procedurilor ce nu folosesc

animalele pentru înlocuirea testului Draize, datele generate de procedura Draize sunt

folosite ca standard pentru măsurarea performanţele metodelor alternative (vezi

capitolul 13).

9

8.3.1. Testarea iritaţiei şi coroziunii oculare

Testul Draize implică un protocol standardizat pentru instilarea agenţilor în

corneea şi conjunctiva animalelor de laborator, în special a iepurilor. O sumă pe scala

ordinală a elementelor de la nivelul extern al ochiului oferă un index al morbidităţii

oculare. Testul foloseşte un sistem de gradare ce descrie reacţiile produse în cornee,

conjunctivă şi iris. De la concepţie, testul a suferit câteva modificări, inclusiv adiţia

altor parametrii descriptivi, cum ar fi: grosimea pleoapelor, inducţia eritemului,

edemului, secreţiilor, opacităţii corneene, lezării vasculare şi a pannus-ului

(vascularizaţiei) corneei (Roberts, 2002).

În încercarea de a standardiza testarea oculară Ghidul OECD 405 recomandă

ca toate informaţiile existente despre o substanţă de testat să fie evaluate înaintea

începerii studiilor in vivo legate de iritaţia şi coroziunea oculară şi ca strategii de

testare ulterioare să fie luate în considerare pentru fiecare test nou sau revizuit.

Înainte de începerea testării pe animale, este sugerată o abordare a evaluării riscului

bazată pe cântărirea atentă a dovezilor. Mai mult, datorită faptului că testele in vivo

privind iritaţiile oculare şi coroziunile sunt reglementate la nivel federal, ghidurile

revizuite recomandă desfăşurarea secvenţială a testelor, câte un animal pe rând. Acest

lucru permire reevaluarea datelor, în timpul acumulării rezultatelor, pentru a evita

duplicarea testelor pe animale. În plus, clasificarea corozivă a unui material supus

testării exclude următoarele testări cu mai multe animale şi permite eutanasia

imediată a animalelor rănite sau aflate în suferinţă. Experimente adiţionale sunt

necesare doar dacă datele obţinute sunt insuficiente pentru a susţine clasificarea.

8.3.2. Obiecţii şi limitări ale testării iritaţiei şi coroziunii oculare

Câteva surse majore de variabilitate în testarea iritaţiei şi coroziunii oculare au

condus la concluzia că ochiul de iepure este un model nesatisfăcător pentru ochiul

uman. Testarea individuală a animalelor crează grupuri mici pentru multiple testări de

dozare, diminuând prin urmare comparaţiile statistice adecvate. Creşterea grupului ar

submina însă intenţia către reducerea testării pe animale şi a dezvoltarii alternativelor

in vitro ale metodei testului ocular Draize (Prinsen, 2006). De asemenea, definiţiile

10

gradării iritaţiei şi coroziunii oculare sunt relativ simplificate. Astfel, existenţa

sistemelor de gradare nu reflectă complexitatea răspunsului total in vivo. De

asemenea, folosirea algoritmilor pentru a simplifica datele in vivo nu este suficient

de precisă pentru comparaţia cu datele in vitro. Acestea şi alte consideraţii care se

adaugă la variabilitatea şi obiecţiile cu privire la utilizarea de testului ocular Draize

sunt definite în tabelul 8.5.

Tabelul 8.5. Surse de variabilitate şi obiecţii faţă de testarea iritaţiei şi coroziunii oculare Draize

Sursa Efecte clinice şi obiecţiiVariabilitate de laborator

Variaţii intra şi inter laboratoare observate în timpul evaluării subiective a substanţelor de testat; standardizarea criteriilor de vindecare pentru evaluarea severităţii leziunii; suprasimplificarea definiţiilor de gradare; existenţa sistemelor de gradare care nu reflectă complexităţiile răspunsurilor in vivo; lipsa colectării de date şi a interpretării eficiente a algoritmilor inadecvaţi

Variabilitate legată de animale

Variaţii în răspunsul individual al animalelor expuse aceleiaşi substanţe test; diferenţe semnificative în anatomia ochiului de iepure faţă de cel uman: prezenţa membranei nictitante şi o grosime corneeană medie mai mică; diferenţe în mecanismele lacrimale; sensibilitatea mărită a ochiului de iepure la iritanţi chimici; răspunsul senzorial la momentul instilaţiei

Standardizarea variabilităţii experimentale

Concentraţia substanţei test; alterarea răspunsului ocular în cazul folosirii anesteziei; procedurile de irigare pentru îndepărtatea excesului şi a particulelor; adoptarea volumului standard de doză (10μl) pentru îmbunătăţirea reproductibilităţii; grupuri mici de animale; durata expunerii; timpul de vindecare post expunere

Considerente etice

Minimizarea suferinţei, a durerii acute şi cronice; implementarea corectă a eutanasiei

8.4. Concluzii

Metodele de testare in vivo folosite în toxicologia dermică şi oculară au fost

utilizate timp de decenii pentru procurarea datelor în vederea formulării programelor

de estimare a riscului. Informaţiile generate de aceste teste sunt obstrucţionate de

limitările ştiinţifice şi obiecţiile etice, impuse de necesitatea protecţiei animalelor.

Dezvoltarea alternativelor in vitro pentru acest test cât şi pentru alte teste de toxicitate

(discutată în Partea a III-a) se bazează pe comparaţiile cu datele in vivo. Validarea

metodelor alternative depinde de certitudinea datelor in vivo. Dezvoltarea testelor

alternative in vitro va fi mai dificilă decât se credea iniţial, până când vor fi stabilite

problemele referitoare la metodele de testare dermică şi oculară pe animale.

11