09.10.2012

Noțiuni generale privind enzimele și microorganismele

Definiția și obiectul biotehnologiei alimentare

Biotehnologia = o știință integrată care utilizează cunoștiințe din biochimie, microbiologie și inginerie genetică.

Rolul biotehnologiei este covârșitor în industria alimentară, de fapt industria alimentară este o biotehnologie deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice și prin urmare conservarea lor până la consum în stare proaspătă (fructe, legume) sau până la industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implică controlul activității enzimelor proprii țesuturilor vegetale și animele sau a celor elaborate de microflora de contaminare.

Enzimele proprii țesuturilor vegetale și animale sunt esențiale în transformările pe care le produs în produsele agroalimentare:

maturarea fructelor și legumelor, a cerealelor și făinurilor sau a diferitelor produse alimentare pe bază de cereale germinate;

maturarea brânzeturilor; maturarea cărnii.

Enzimele pot avea însă și rol deteriorativ cu implicații în modificarea caracteristicilor senzoriale și a valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare până la prelucrarea termică a acestora. De asemenea rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având acțiune dăunătoare, altele având rol esențial în obținerea unor produse alimentare datorită acțiunilor fermentatice (ex: în cazul produselor lactate acide, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude, alimente fermentate din cereale și leguminoase).

Microorganismelor intervin și în fermantarea unor produselor vegetale (varză, murături, măsline, castraveți, etc.).

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene (în industria laptelui, berii, sucurilor de fructe, cărnii) și a culturilor starter ( în industria berii, vinului, laptelui, cărnii, panificației).

La toate acestea trebuie să avem în vedere obținerea de metaboliți secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi) prin folosirea de microorganisme precum și de biomasă alimentară și furajeră.

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot: accelera procesele biochimice; perfecționa procesele de producție; îmbunătății calitatea produselor alimentare; mări gradul de diversificare a producției alimentare.

1

Clasificarea generală a enzimelor

Comisia de enzime a uniunii internaționale de chimie pură și aplicată clasifică enzimele în 6 clase care sunt prezentate în cele ce urmează:

1. Oxidoreductazele catalizează reacțiile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul.

alcool etilic + NAD etanal + NADH + H*NAD = nicotin-amida-denucleotid NADH = NAD redus cu hidrogen

2. Transferazele catalizează transferul unei grupări chimice (alta decât H) de la un substrat la altul.

Acetil CoA + colină acetil-colină + CoA

3. Hidrolazele catalizează hidroliza legăturilor peptidice, glucozidice, esterilor din diferite substraturi prin adiția de apă.

β-galactozit (lactoza) + H O galactoză + glucoză

4. Liazele catalizează scindarea moleculelor pe alte căi decât hidroliza.

fructozo-difosfat glicerid-aldehid-difosfat + fosfo-dihidroxi-acetonă

5. Izomerazele catalizează izomerizarea optică, geometrică (catalizează rearanjări intramoleculare) și pot fi racemaze, cis-trans izomeraze, enzime care produc transformări aldoză-cetoză.

L-alanină D-alanină

6. Ligazele (sintetaze) catalizează formarea de diverse legături covalente între molecule cu utilizarea ATP.

glutamat + NH + ATP glutamină + ADP + P

Unități de măsură ale activității enzimelor

Determinarea activității enzimelor se realizează prin: măsurarea gradului de transformare a substratului; măsurarea concentratului produsului de reacție; măsurarea cineticii de reacție într-un anumit interval de timp.

Unitățile admise sunt:

2

1) Unitatea de activitate enzimatică (u) care reprezintă cantitatea de enzimă ce catalizează transformarea a 1 micromol substrat/minut în condiții standard (5ºC, pH și concentrație de substrat optime).

2) Catalul (KAT) reprezintă cantitatea de enzimă ce catalizează transformarea a 1 micromol substrat/secundă în condiții standard.

Multiplii catalului: kiloKATSubmultiplii: miliKAT; microKAT; picoKAT.3) Activitatea enzimatică molară reprezintă numărul de molecule de substrat

transformate de către o moleculă de enzimă în timp de 1 minut sau 1 secundă (raportul KAT/mol enzimă).

Preparate enzimatice

Preparatele enzimatice ca atare se obțin din următoarele surse: țesuturi animale: ficat, pancreas, mucoasă stomacală sau intestinală, inimă,

rinichi, creier; țesuturi vegetale: semințe, cereale germinate și negerminate, rădăcini, sevă,

latexuri, frunze, coajă; microorganismele: bacterii, drojdii, mucegaiuri.

Microorganismele sunt cea mai bună sursă de preparate enzimatice deoarece se pot obține în cantități mari (biomasă) prin cultivare în instalații speciale pe medii de cultură ieftine (ex: tărâță de grâu, extract de porumb, melasă, șroturi de soia sau floarea soarelui, zer).

Ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt față de cel al plantelor sau animalelor.

Producția de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin selectarea și utilizarea de tulpini mutante înalt performante (productive) și prin stabilirea condițiilor optime fizice și chimice pentru producerea de enzime.

Preparatele enzimatice obținute pot avea activități diferite cu predominanța altei activități.

Schema tehnologică generală de obținere a preparatelor enzimatice din diferite surse

3

Preparatul enzimatic de origine microbiană trebuie să fie :liber de toxine;antibiotice, deci să fie produs de microorganisme nepatogene, neproducătoare de toxine; fără activitate antibiotică; fără potențial alergen.

Sursele de enzimă de origine animală și vegetală prezintă următoarele avantaje/dezavantaje:

sunt sigure din punct de vedere al inocuității preparatelor enzimatice care se obțin;

asigură obținerea cu preponderență a unui anumit tip de enzimă (cu unele excepții);

preparatele enzimatice obținute sunt mai termosensibile.

4

Tehnologia de obținere a preparatelor enzimatice implică operațiile indicate în schema anterioară din care rezultă că preparatele enzimatice pot fi obținute sub formă de:

a) preparate enzimatice brute uscate;b) preparate enzimatice brute concentrate;c) preparate enzimatice purificate concentrate, respectiv și uscate.

Pentru producția de preparate enzimatice de origine microbiană se pot aplica două tehnici de bază:

1) Fermentația de suprafață în care se utilizează un mediu solid pe care se cultivă microorganismului (de regulă un mucegai filamentos). Această tehnică are avantajul că mediul de cultură va deveni un mediu bogat în activitate enzimatică.

2) Fermentația de profunzime în care mediul este lichid și se află într-un reactor unde toți parametrii fermentației sunt perfect controlate.

Această ultimă tehnică este superioară primei metode din punct de vedere tehnologic și biochimic.

La producția de preparate enzimatice de origine microbiană ne interesează: sursa de microorganism folosită care trebuie selecționată după anumite

criterii; inocuitatea microorganismului producător de enzime (aceste trebuie să fie

recunoscut ca sigur din punct de vedere al inocuității).Printre speciile de microorganisme care se folosesc menționăm următoarele:

o Aspergilius Niger;o Aspergilius Orizae;o Mucor Michei;o Sacharomyces Cereviziae;o Endothia Parasitica;o Penicillium Emersoni;o Cluyveromyces Lactis;o Bacilus Amilalichefaciens;o Bacilus Stearothermophilus;o Actinoplanes Missouriens;o Klebsiela Planicola.

La sfârșitul fermentației microorganismul trebuie distrus cu condiția păstrării intacte a activității enzimatice.

productivitatea sușei care trebuie dă fie maximă în condițiile de fermentație industrială se preferă o sușă care nu modifică pre mult vâscozitatea mediului de cultură în cursul dezvoltării celulare;

stabilitatea genetică în sensul păstrării caracteristicii industriale inițiale în timpul conservării și preparării caracteristicilor de producție se poate utiliza și ingineria genetică în vederea obținerii unor enzime cu o anumită activitate enzimatică și anume cât mai ridicată, astfel gena care codifică producție de chimozină animală a fost clonată din trei microorganisme diferite, și anume: Aspergilius Niger, Kleyveromyces Fragilis și E. Coli.

5

16.10.2012

Aspecte biochimice ale fermentației principale

În cursul fermentației microorganismul utilizat se va dezvolta și va produce enzime, cele două procese putând fi simultane sau câteodată separate.

Se pot întâlni trei tipuri de situații: tipul I – creșterea și producția de enzime sunt asociate; tipul II – producția de enzime continuă chiar și după faza de creștere; tipul III – există o fază de latență între producția de enzime și creșterea

microorganismelor în mediul de cultură.Cele trei tipuri sunt prezentate în graficele următoare:

Acestea reprezintă evoluția diferitelor tipuri de enzime a concentrației de celule în cursul fermentației microbiene.

Aspecte biologice ale fermentației principale

Celulele microbiene utilizează foarte mult oxigen pentru producția de biomasă sau enzime, și anume 3-10 tone de oxigen pentru un fermentator de 100 m , precum și substanțe nutritive în mediul de fermentație pentru dezvoltare (creștere de la 1 la 10 în 5 până la 10 zile de dezvoltare). Rezultatul este producția de biomasă de bioxid de carbon și căldură, iar secreția de metaboliți și enzime extracelulare este de 0.1 până la 40g/l în funcție de caz.

Microorganismele din cultură pot produce și enzime intracelulare, ceea ce necesită un procedeu specific de extracție a acestora.

Materiile prime pentru mediul de fermentare sunt constituite din: substrat carbonat, cum ar fi amidonul, maltodextrinele, celuloza, pulpa de

sfeclă, glucoza, zaharoza; substrat azotat, cum ar fi hidrolizatele proteice, proteinele sau extractele de

drojdie ca surse organice; surse de minerale pentru a se asigura un minim necesar de Mg, Ca, Fe, K,

Mn, Zn, precum și de P și S.Alegerea materiilor prime este foarte importantă pentru reușita fermentației

industriale. Pentru producția de enzime alimentare un element determinat va fi 6

ușurința cu care se va putea controla gradul de puritate al unui lot de materii prime. În anumite cazuri un pretratament (termic sau enzimatic) va permite controlul purității materiilor prime utilizate. În afară de materiile prime este necesar și oxigenul pentru producția industrială de enzime mai ales când această producție are loc în condiții aerobe.

În privința aportului de oxigen trebuie să se țină seama că:- solubilitatea oxigenului în apă la 25ºC și la presiunea atmosferică este de 0.041 g/l și că această solubilitate va scădea dacă temperatura va crește;- alimentarea cu oxigen a fermentatorului va depinde de puterea agitatorului reactorului și de tipul acestuia;- transferul de oxigen este cu atât mai dificil cu cât fermentatorul are dimensiuni mai mari și cu cât vâscozitatea mediului este mai mare.

Aerarea fermentatorului este făcută în limitele 200- 6000 m /h, în ceea ce privește tipurile de culturi submerse se poate întâlni unul din cazurile prezente în continuare.

1) Procedeul nealimentat. În acest caz ingredientele mediului de fermentare sunt pregătite în fermentator la pH-ul și temperatura dorite înainte de a se introduce inoculul. După introducerea de inocul fermentarea principală începe și finalizarea ei se urmărește prin prelevare de probe în mod steril care arată:

creșterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea mediului); concentrația în enzimă (activitate enzimatică a mediului); consumul de glucide; nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta diferiți senzori care arată: pH-ul care se poate regla prin adaos de baze sau acizi; temperatura care se poate regla prin debitul de circulație al apei reci în

mantaua fermentatorului sau în serpentina din interiorul fermentatorului; nivelul de spumă care se poate combate cu un antispumant aflat într-un

rezervor atașat fermentatorului; presiunea care se reglează prin supape ce se deschid la presiuni de 1-3 bar; coeficientul respirator QR care se măsoară prin cantitatea de CO produsă

față de cantitatea de oxigen consumată; nivelul de oxigen consumat pornind de la analiza efluenților.

2) Procedeul alimentat. În acest caz procedeul se începe cu un volum de 10-30% de substrat în care se introduce inoculul, apoi fermentatorul se alimentează cu restul de mediu, iar oprirea fermentației se face după un anumit timp fixat experimental.

Acest procedeu se aplică în cazul în care sinteza enzimelor ar fi reprimată de concentrațiile ridicate într-unul din nutrienții mediului de cultură sau în cazul în care creșterea microorganismelor, în funcție de concentrație în una din componentele mediului, ar provoca creșterea vâscozității care trebuie să fie reglată în timp.

Alimentarea fermentatorului poate fi repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje (evacuări) programate, dar întotdeauna trebuie lăsat în fermentator un volum de aproximativ 30% care servește în acest caz drept cultură de producție.

7

3) Procedeul continuu. Acesta necesită alimentarea continuă a fermentatorului cu mediu și folosirea unei culturi concentrate de microorganisme.

În acest caz bioreactorul de dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare, în figură se arată schița unei astfel de instalații format dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la care există posibilitatea de a recircula biomasa.

Avantajele unui astfel de procedeu sunt următoarele:- se poate detoxifica mediul de cultură prin eliminarea produsului de inhibare;- celulele reciclate devin perfuzate;- cantitatea de mediu de cultură care se întoarce în bioreactor este controlată de mediu de cultură care se introduce în bioreactor este controlată de cantitatea de permeat care traversează membrana de ultrafiltrare;- celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la concentrații relativ mari (aprox. 300g/l substanță uscată în cazul drojdiilor);- aceste concentrații mari de celule se constituie ca o barieră eficace față de contaminarea exterioară;- retenatul poate fi evacuat și el periodic, fiind constituit din biomasă care conține enzime intracelulare după care este trecut la prelucrarea ulterioară (extracție);- permeatul de ultrafiltrare care conține enzime nu mai are celule microbiene și poate fi deci stocat sau dirijat direct la o operație în aval de purificare sau concentrare.

8

Dezavantajele acestui procedeu de obținere a biomasei și enzimelor sunt următoarele:

- membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea cu vapori de apă și la igienizare cu substanțe chimice;- costurile energetice sunt destul de ridicate;- mediul de cultură poate fi colmatant pentru membrana de utilizare și de ultrafiltrare;- chiar la densitați mari de celule la sfârșitul ciclului de dezvoltare este posibilă o oarecare liză a celulelor, ceea ce face necesară o purjare a bioreactorului prin unitatea de ultrafiltrare, fapt care conduce la micșorarea vârstei medii a celulelor ce rămân în sistem.

O variantă a procedeului continuu de obținere a biomasei enzimelor constă în folosirea bioreactorului cu membrană.

Extracția

La procedeul discontinuu (nealimentat) și cel alimentat, după terminarea fermentației, se separă partea solidă, insolubilă (celule și produse insolubile) de partea lichidă care conține enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală sau microfiltrare, soluția sterilă obținută este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele.

În cazul în care enzimele sunt destinate a intra în compoziția unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizează cu polioli (sorbitol, glicerol) și/sau cu săruri (clorură de sodiu, sulfat de Mg), respectiv se adaugă bacteriostatici alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).

În cazul în care enzimele intră în compoziția unui preparat comercial pulbere, ultrafiltratul se suplimentează cu un suport și se usucă prin atomizare (suplimentarea se face cu amidon, dextrine, iar înainte de atomizare se mai poate face o filtrare sterilă).

Pentru a obține și enzimele intracelulare, biomasa din fermentator separată de partea lichidă este supusă lizei.

Liza poate fi realizată chiar de enzimele proprii microorganismelor ce alcătuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozibul din albușul de ou, fie prin preparate enzimatice complexe de natură bacteriană care conțin chitizină, mananază, glucanază, proteaze, câteodată în combinație cu adaos de metabisulfit se pot folosi și ultrasunetele cu frecvențe mai mari de 20mHz pentru liza celulelor și deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare.

Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul, maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se controlează granulometria, umiditatea (mai mică de 6%), suportul nu trebuie să fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloașe.

23.10.2012

9

Enzime imobilizate

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncțional) înseamnă legarea sau fixarea acestuia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiții:să fie insolubil în apă;să asigure păstrarea proprietăților catalitice ale enzimei;să asigure acțiunea enzimei la un pH și la o temperatură optimă.

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele:- creșterea stabilității enzimei, ca și proteină și ca o activitate enzimatică;- se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar și din punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;- enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în timpul catalizei enzimatice;- se poate modula micromediul în care acționează enzima imobilizată (concentrație substrat, încărcătura suportului cu enzimă, grupările hidrofile);- refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeași cantitate de enzimă se poate transforma o cantitate mai mare de substrat;- se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu putându-se automatiza procesul, ceea ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;- are loc o creștere a vitezei de lucru prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat și al concentrației acestuia;- se poate stopa reacția enzimatică la momentul dorit și se evită trecerea enzimei în produsul transformat;- costurile globale de producție sunt mai mici în comparație cu procedeele la care se folosesc enzime libere.

La imobilizare în funcție de enzimă și de catalizator se poate vorbi de: η de fixare, care reprezintă cantitatea efectivă de enzimă imobilizată în

raport cu cantitatea de enzimă introdusă în procesul de imobilizare

η=

η de activitate, care reprezintă activitatea reziduală a enzimei imobilizate

η =

Metode de imobilizare a enzimelor

10

Aceste metode se clasifică în metode fizice de imobilizare și metode chimice.

1) Metode fizice – în acest caz enzima se leagă de un suport prin intermediul legăturilor slabe sau relativ puternice (legături van der Waals, legături de hidrogen, interacțiuni proteină-proteină, legături ionice). Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi prin:

absorbție pe suporturi organice: amidon, colagen, polistiren, rășini organice; absorbție pe suporturi minerale: alumină, argilă (bentonită), ceramică,

hidroxiapatită, sticlă poroasă.Absorbția se realizează prin contactul dintre o soluție apoasă de enzimă cu

suportul solid și va fi influențată de: pH; tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei; puterea ionică; calitatea enzimei; temperatura și durata de contact a enzimei cu suportul.

Practic imobilizarea se face prin amestecul dintre soluția de enzimă și suport într-un reactor cu agitator sau prin trecerea soluției de enzimă într-o coloană în care suportul este menținut sub forma unui pat.

Absorbția este influențată de: raportul dintre suprafața și volumul suportului, mărimea particulelor; raportul dintre grupările hidrofile și hidrofobe.

Avantajele și dezavantajele imobilizării enzimelor prin absorbție:Avantaje:

simplitate în execuție (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva minute, enzima care rămâne în soluție fiind eliminată prin drenare);

absența reacțiilor chimice (numai dacă nu se formează punți metalice).Dezavantaje:

11

stabilizare redusă; riscul de desorbție a enzimei de către: fluxul de substrat, variație lejeră de

pH, forța ionică și temperatura.

Avantajele și dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune:Avantaje:

reacțiile de polimerizare/gelifiere sunt deja cunoscute; reacțiile dintre suport și enzimă sunt limitate (enzima este inclusă în geluri

naturale); se poate aplica la toate enzimele (chiar și la amestec de enzime); se pot folosi suporturi cu forme diferite: filme, fibre, bile; riscul de „evadare” al enzimei este redus prin reticulare suportului după

imobilizare.Dezavantaje:

anumite polimerizări necesită agenți denaturați sau radicalici; se pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la

enzime); riscul de evadare al enzimei prin micropori; proprietățile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfcătoare.

2) Metode chimice. În acest caz imobilizarea se face prin intermediul legăturilor covalente de suporturi insolubile care posedă grupări reactive sau care pot fi activate prin diferite reacții chimice.

Se poate realiza imobilizarea și prin copolimerizarea enzimelor cu un monomer activ și prin legarea încrucișată sau reticulară, intră și intermoleculară, de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncțional.

La legarea prin legături covalente imobilizarea poate fi făcută cu un grup de fixare pe un suport insolubil, dar trebuie să se țină seamă de gruparea funcțională care poate reacționa cu protein-enzima și de caracteristicile fizico-chimice ale suportului.

Avantajele și dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături covalente:

Avantaje: stabilitate mărită datorită faptului că legăturile covalente sunt cele mai

puternice dintre toate legăturile menționate anterior; varietatea mare a suporturilor: sticlă, ceramică, celuloză, polimeri sintetici; posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezența unui substrat pentru a se

evita inactivarea (protecția situsului activ).Dezavantaje:

trebuie realizate reacții chimice adesea complexe; etapa de activare a suportului este lungă; randamentul de fixare este mai mic de 100%; există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate); este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil; investiția este mare.

12

Suporturi de imobilizare comerciale

Suporturile comerciale cel mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt:

polizaharide:o agaroză;o cululoză și derivați;o alginați;o caragenani;o dextrani;

poliacrilamide sunt utilizate sub formă de bile; polistiren:

o bile și tuburi; silicea și sticlă poroasă.

06.11.2012

Enzime mai importante pentru industria alimentară

Progresele enzimologiei în ultimele două decenii sunt strâns legate de cuceririle în domeniul chimiei preparative analitice și fizice a proteinelor. În același timp o influență incontestabilă asupra dezvoltării enzimologiei au avut unele discipline mai îndepărtate (de ex: cinetica chimică, termodinamica, statistica matematică, teoria catalizei omogene și heterogene, genetica și biochimia microorganismelor). În concepția actuală sub denumirea de enzimă se înțelege o proteină cu proprietăți catalitice care are în structura sa așa-numitul centru activ și în unele cazuri o grupare prostetică (este o componentă a proteinelor și stă de obicei pe lângă aminoacizi).

Efectul catalitic este condiționat de capacitatea proteinei de a activa specific alte substanțe. Această definiție care este incompletă și susceptibilă de a fi discutată se bazează pe faptul că toate enzimele separate până în prezent sau cunoscute și neseparate încă în stare pură, cristalizate posedă proprietățile caracteristice proteinelor, și anume:

sunt termostabile; sunt ușor denaturate de agenți fizici și chimici; pot fi precipitate de reactivi specifici pentru precipitarea proteinelor, în

majoritatea cazurilor acțiunea catalitică a enzimelor se manifestă numai în prezența unor substanțe speciale denumite cofactori.În prezent cercetătorii deosebesc 3 grupe de cofactori:I. Cofermenți specifici sau coenzimele = substanțe organice cu masă

moleculară mică, termostabile și care dializează ușor din soluțiile enzimei.Coenzimele se caracterizează prin însușirea lor de a reacționa reversibil cu

proteina care intră în compoziția enzimei, denumită apoenzimă sau apoferment.II. Grupările prostetice = substanțe combinate mult mai strâns cu

apoenzima care disociază greu și în general rămân fixate pe o singură apoenzimă.13

III. Activatorii denumiți uneori și cofactori anorganici = substanțe nespecifice (diferite metale, agenți reducători) care mediază trecerea enzimei dintr-o stare catalitică în alta.

Enzimele care prezintă o importanță pentru industria alimentară aparțin claselor prezentate în cele ce urmează: Oxidoreductazele – pot interveni pozitiv în:

o procese metabolice anaerobe sau aerobe, ex: glicoliza și diferiți fermentații, ciclul acizilor tricarboxilici, catena de respirație celulară, procese care se desfășoară în diferite materii prime alimentare (intervin oxidoreductazele proprii țesuturilor respective);

o procese fermentative de obținere a unor produse alimentare care se realizează cu ajutorul unor microorganisme;

o procesul de albire (decolorare a făinurilor de grâu);o protejarea față de deteriorarea îmbrumării de tip Maillard;o distrugerea apei oxigenate reziduale din produsele alimentare care s-a

folosit în scopuri de conservare.– pot interveni negativ în:

îmbunarea neenzimatică; degradarea acidului ascorbic; deteriorarea oxidativă a unor produse alimentare.

Oxidoreductazele cu importanța pentru industria alimentară aparțin uneia din subclasele prezentate în continuare:

1) Oxidoreductaze FAD (flavin-adenin-dinucleotid)Aceste oxidoreductaze au ca reprezentant important glucozoxidaza care se

obține din Aspergilius Niger, Penicillium Amaga Sapiens, Penicillium Vitale.Preparatele brute de glucozoxidază conțin și mutarotază, catalază, lactonază

și se utilizează la oxidarea glucozei în acid gluconic, reacție importantă la fabricarea albușului de ou praf unde trebuie să existe glucoză liberă, care s-ar constitui ca partener de reacție în îmbrumarea Maillard în timpul depozitării albușului praf.

Transformarea glucozei în acid gluconic are loc conform reacțiilor prezentate:

14

Reacții care intervin în transformarea glucozei în acid gluconic

Oxidoreductaze NAD dependente (dehidrogenaze aerobe), aceste intervin în procesul de fabricare a oțetului din vin de către bacteriile acetice care transformă alcoolul etilic în aldehidă acetică și apoi în acid acetic.

NAD = nicotin-amidă-dinucleotidAceste enzime intervin în procesul de fabricare a oțetului, iar reacțiile

conform cărora se desfășoară reacțiile următoare:

Oxidazele sunt enzime care catalizează reacțiile dintre diferitele substraturi cu oxigen molecular sau cu peroxizi, în funcție de mecanismele de acțiune ele putând fi clasificate astfel:

oxigenaze: o dioxigenaze (lipoxigenaza),o monoxigenaza;

oxidaze: o citocromoxidaza, o cuproxidaza, o polifenoloxidaza, o tirozinaza, o ascorbatoxidaza;

hidroperoxidazele: o catalaza, o peroxidaza.

În cele ce urmează se prezintă unele oxidaze mai importante, fie ca enzime proprii țesuturilor vegetale/ animale, fie ca preparate enzimatice adăugate.

Lipoxigenaza este o dioxigenază cunoscută și sub denumirea de carotenoxidază. Lipoxigenaza catalizează oxidarea acizilor grași polinesaturați care conțin legături cis-trans 1,4 pentadienice cu ajutorul oxigenului.

Sub acțiunea lipoxigenazei fie ea directă sau industrială influențează culoarea produselor alimentare cât și textura, aroma sau diminuarea valorii nutritive.

La țesuturile vegetale vii lipoxigenaza îndeplinește o serie de funcțiuni specifice:

modificări de culoare:o albirea făinii de grâu prin distrugerea carotenului (acțiune benefică);o albirea produselor făinoase (acțiune benefică);

15

o participarea la pierderea culorii dorite de verde prin distrugerea clorofilei în produse vegetale congelate (acțiune nedorită);

o distrugerea xantofilei și a altor carotenoizi în nutrețurile animale (acțiune nedorită);

o distrugerea coloranților vegetali adăugați în produsele alimentare (acțiune nedorită);

o distrugerea pigmenților pielii la unele produse de pește;o modificarea superficială a culorii la mere;

modificări de aromă:o producerea de substanțe volatile dorite la fructe și vegetale proaspete

(tomate, banane, castraveți);o producerea de substanțe de aromă nedorite la produse vegetale

congelate;o producerea de substanțe de aromă nedorite la produsele bogate în

proteine (semințe, leguminoase);o participarea la râncezirea cărnii (ex: postaglandin-sintetază sau

lipoxigenază); modificări de textură:

o producere de efecte favorabile privind proprietățile reologice ale făinii de grâu a aluatului prin controlul balanței sulf-sulf/SH (sulfhidril), prin controlul legării hidrofobice a lipidelor de proteinele glutenice;

modificări nutriționale:o distrugerea vitaminei A și a provitaminei A;o distrugerea acizilor grași esențiali polinesaturați;o interacțiunea produselor de degradare cu aminoacizi esențiali din

proteine, ceea ce face să scadă valoarea nutrițională a proteinelor și funcționalitatea lor;

funcțiuni in vivo ale lipoxigenazei:o participarea la biosinteza etilenei prin producerea de oxigen activ

necesar transformării metioninei în etilenă;o transformarea carotenoidelor în factori care afectează dezvoltarea

plantei (inhibitori ai dezvoltării);o transformarea acizilor grași polinesaturați (acid arahidonic) la

animale în hidroacizi;o distrugerea anaerobă a peroxizilor în cazul țesuturilor vătămate.

Lipoxigenaza se găsește în mazăre, fasole, ridichi, cartofi și în soia, de unde se și extrage.

Lipoxigenaza din soia este de două feluri, și anume una activată de ionul de Ca și alta inhibată de acesta.

În biologia animală lipoxigenaza intervine în principal în leucocite unde catalizează oxidarea acidului arahidonic într-o familie de compuși denumiți leucotriene, care au un rol important în manifestări alergice.

16

Polifenoloxidazele

Sunt clasificate în: catecoloxidaze catalizează reacțiile 1 și 2 menționate mai jos, realizând

în principal hidroxilarea monofenolilor în ortodifenoli (crezolaze) și oxidarea ortodifenolilor în ortochinone (catecolaze), în ambele reacții se consumă oxigen, și anume 1 mol de oxigen pentru 1 mol monofenol cu obținere a 1 mol de ortochinonă;

lacaza oxidează ortodifenolii ca și paradifenolii cu formare de chinone corespunzătoare (reacția 3), în acest caz se consumă 1 mol de oxigen pentru 1 mol difenol și se obține 1 mol ortochinonă, rezultă că lacazele se deosebesc de catecolaze prin faptul că oxidează și paradifenolii.

Reacțiile catalizate de polifenoloxidaze17

Polifenoloxidazele cu activitate catecolazică și crezolazică sunt prezente în organitele țesuturilor vegetale, cum ar fi mitocondriile, peroxizomii, unde sunt asociate cu membrana organitului, dar se găsesc și în fracțiunea solubilă a celulei vegetale.

În produsele vegetale tinere (fructe tinere, legume tinere) polifenol-oxidazele sunt în cea mai mare parte sub formă legată, în timp ce la cele maturate polifenoloxidazele se găsesc în cea mai mare parte în stare liberă (în fracțiunea solubilă a celulei).

Polifenoloxidazele au pH optim între 4-7, iar optimul de temperatură este între 15-40ºC.

Lacazele au o distribuție mai redusă în regnul vegetal în comparație cu polifenoloxidazele.

Mulți fungi conțin lacaze care sunt glicoproteine, sub unitatea de bază fiind un singur lanț polipeptidic.

Conținutul în carbohidrați este de 10-45%, conțin 4 atomi de Cu, iar pH-ul optim al lacazelor este cuprins între 4-7.3 în funcție de substrat, rezultă că polifenoloxidazele și lacazele au rol deteriorativ deoarece produc îmbrumarea enzimatică a produselor vegetale proaspăt tăiate în contact cu aerul, respectiv a unor țesuturi animale (creveți, moluște).

Legumele și fructele cele mai afectate sunt cartofii, ciupercile, vinetele, merele, perele, caisele, bananele.

Prevenirea îmbrumării enzimatice se poate face prin următoarele metode:1) Fizice:

temperatura sub 0ºC (-18ºC); căldura care inactivează polifenoloxidazele la temperaturi mai mari

de 70ºC; protecția față de oxigen prin ambalare sub vid și ambalare sub

atmosferă inertă; scufundare în sirop de zahăr;

2) Chimice: adaos de acid ascorbic 0.1-0.3% (se dizolvă în siropul de acoperire al

fructelor); adaos de NaCl 1-2% la pH 5.5 care se utilizează pentru protecția

suprafeței merelor depielate prin înmuiere timp de maxim 1 minut; adaos de acid citric soluție 1%; folosire de dioxid de sulf și derivați ai acestora (soluție 0.4-0.5%).

13.11.2012Ascorbatoxidaza

Aceasta este o enzimă care conține Cu și catalizează oxidarea acidului ascorbic.

Acid ascorbic + ½ O acid dehidroascorbic + H OOxidarea enzimatică a acidului ascorbic este importantă în cazul fabricării

sucurilor de citrice.

18

În fructele intacte balanța dintre oxidaze și reductaze determină nivelul de acid ascorbic prezent în fructele citrice. La extracția sucurilor din citrice reductazele sunt distruse, iar oxidazele rămase distrug acidul ascorbic. Este deci necesar să se limiteze acțiunea ascorbatoxidazei prin:

menținerea fructelor la temperatură scăzută pentru o perioadă scurtă în timpul divizării lor;

dezaerarea sucului obținut; pasteurizarea sucului pentru inactivarea enzimei.Acidul ascorbic și enzimele de oxidare și reducere sunt benefice pentru

panificarea făinurilor albe deoarece produc întărirea glutenului prin formări de legături S-S.

Ascorbat + O acid dehidroascorbic + H OAcid dehidroascorbic + gluten (SH) gluten + S-S + gluten

Peroxidazele

Acestea catalizează reacțiile de descompunere a apei oxigenate numai în prezența unui acceptor de oxigen (A) sau un donor de hidrogen (A H ) după următoarele reacții:

H O + A AO + H OH O + A H H O + A

In vivo prezența peroxidazei este foarte importantă deoarece acumularea de H O prin formarea ei în reacții de oxido-reducere aerobe s-ar constitui ca un oxidant puternic pentru celule, inclusiv pentru unele substanțe cum ar fi: aminoacizii esențiali, metionina și triptofanul.

Difenolii sub influența peroxidazei și a H O sunt oxidați la chinone. Această reacție are loc în produsele vegetale care conțin difenoli (fructe, legume).

Peroxidazele se găsesc în numeroase produse vegetale (napi, guli, cartofi, smochine, ridichi), în microorganisme și în unele țesuturi de origine animală (leucocite, ficat, salivă, lapte).

Peroxidazele pot inteveni pozitiv în industria alimentară în următoarele cazuri:

a) Formarea metil-cetonelor, plecând de la acizi grași cu lanț scurt, metil-cetone care participă la aroma unor brânzeturi cu mucegai la suprafață.

b) Prelungirea duratei de conservare a laptelui proaspăt muls împreună cu tiocianatul și H O (este sistemul lactat-peroxidază-tiocianat-H O ). Acest

19

sistem inhibă temporar streptococii mezofili prin cei 3 factori care acționează concomitent:

concentrația mare de lactat-peroxidază care este sintetizată de glanda mamară;

tiocianatul care provine din furaje; H O produsă de streptococi în condiții de anaerobioză parțială.

Dacă sistemul menționat nu este inactivat prin încălzirea laptelui la 82ºC, acidularea produsă de streptococi este foarte redusă.

c) Ca indicator al eficienței tratamentul termic de pasteurizare, blanșare (peroxidazele proprii țesuturilor animale și vegetale).

d) În determinarea cantitativă a glucozei (în combinație cu glucozoxidaza) din țesuturi biologice.Peroxidazele pot avea și influență negativă în degradarea fructelor și

legumelor cu implicare în modificarea gustului și mirosului (mazăre, fasole) în procesele de îmbrumare enzimatică.

Peroxidazele pot avea de asemenea următoarele acțiuni negative:o distrugerea vitaminei C;o albirea carotenoidelor în absența acizilor grași polinesaturați;o decolorarea antocianilor;o degradarea acizilor grași nesaturați cu formare de substanțe volatile

responsabile de aroma de oxidat a produselor vegetale și animale care conțin peroxidaze.

Catalazele

Sunt larg răspândite în regnul vegetal și animal inclusiv în microorganisme. Surse comerciale de catalază sunt ficatul de bovină, Aspergilus Niger (prin biosinteză) și Micrococus Isodeiykticus (enzima se pune în libertate prin liza peretelui celular cu enzima numită muramidază).

Prezența catalazei în lapte permite diagnosticarea laptelui mamitic, catalazele au rolul de a descompune H O și de a furniza oxigen molecular necesar unor procese metabolice.

H O se formează în organisme sub acțiunea unei flavin-enzime și a radiațiilor cosmice. Descompunerea H O are loc după reacția:

H O H O + ½ OCatalaza este utilizată tehnologic la distrugerea apei oxigenate reziduale

când aceasta este folosită pentru sterilizarea la rece a laptelui de fermă, inclusiv a laptelui destinat fabricării brânzeturilor.

În primul caz se adaugă 1 ml H O 33%/l în laptele recoltat la fermă și 1 ml/l în laptele sosit la fabrica de prelucrare. Operație care este urmată de o încălzire la 50ºC timp de 30 minute și răcire la 35ºC când se adaugă catalaza.

În cel de-al doilea caz se pot folosi două variante:

20

a) Varianta discontinuă – în care caz în laptele crud se adaugă 0.02% H O (100%), laptele trebuie să fie încălzit la temperatura de coagulare de 30-33ºC. După repaus de 20 minute în lapte se adaugă catalaza.

b) Varianta flash – în lapte se adaugă 0.01% H O (100%), laptele este apoi încălzit la 52ºC și după aceea este răcit. În laptele răcit se adaugă catalaza (20 ml/l) prin distrugerea H O reziduală.

Hidrolaze

Acestea sunt enzime care scindează legăturile O-O, C-N, C-S, C-C, P-N, au rol covârșitor ca preparate enzimatice adăugate, respectiv în activitatea unor țesuturi animale și vegetale.

Hidrolazele sunt clasa principală de enzime care catalizează reacțiile de hidroliză ale diferitelor molecule.

Exemple: lipaze; esteraze; fosfolipaze.

Importanța lor tehnologică constă în: Hidroliza controlată a lipidelor din unele alimente în curs de finisare,

maturare, cum ar fi brânzeturile, salamurile crude în care acizii grași eliberați pot participa la aroma produsului respectiv sau se vor constitui ca substraturi pentru formarea altor compuși de aromă prin oxidarea acizilor grași saturați sau ca substraturi pentru degradarea aldehidică controlată cu formarea compușilor de aromă de tipul carbonililor (aldehide și cetone), în acest caz se oxidează acizii grași nesaturați pentru a obține un efect benefic;

Degradarea lipidelor (lipoliză) necontrolată din produse alimentare bogate în grăsimi (lapte și produse lactate, carne și produse din carne), produse vegetale bogate în grăsimi (nuci, arahide, semințe oleaginoase). În acest caz lipoliza conduce la acumularea de acizi grași liberi (creșterea acidității) care contribuie la gustul de rânced, dar care constituie și ca substraturi pentru oxidarea aldehidică necontrolată în care caz gustul și mirosul de rânced devin pronunțate.

O serie de preparate enzimatice se folosesc în principal la maturarea unor brânzeturi. Aceste preparate enzimatice pot fi:

lipaza pancreatică de vacă; lipaza gastrică; esterazele pregastrice; esteraza microbiană din:

o Mucor Miehei, o Penicillium Caseicolum, o Pseudomonas Fluorescens, o Pseudomonas Fragilis, o Aspergilus Niger, o Aspergilus Oryzae.

21

În ceea ce privește modul de acțiune al diferitelor enzime se menționează următoarele aspecte:

lipazele acționează în principal asupra trigliceridelor având afinitate pentru acizii grași cu lanț lung din structura trigliceridelor, lipazele având în structura lor o parte hidrofilă și una lipofilă; pot acționa și la interfața ulei-apă, deci asupra emulsiilor de tip U/A care se formează în tractul intestinal sau in vitro (maioneze, dressinguri);

esterazele acționează în principal asupra gliceridelor care au acizi grași cu lanț scurt în structura lor;

fosfolipazele denumite generic și lecitinaze pot fi:o fosfolipaza A1 – care elimină specific acidul gras din poziția extremă

α a fosfolipidelor, o fosfolipaza A2 – care elimină acidul gras din poziția centrală β a

fosfolipidelor, o fosfolipaza B – care este un amestec de fosfolipaza A1 și A2, elimină

2 acizi grași din molecula de fosfolipidă corespunzător fosfolipazelor A1 și A2,

o fosfolipaza C (lecitinaza C sau glicerofosfataza) – care hidrolizează legătura ester care unește glicerolul cu acidul fosforic din molecula de fosfolipidă,

o fosfolipaza D (lecitinaza D sau colinfosfataza) – care hidrolizează legătura ester dintre acidul fosforic și baza azotată (colină sau etanolamină) din fosfolipidă.

Aceste fosfolipaze sunt activate de ionul de Ca și de sărurile care mențin fosfolipidele în stare de emulsie.

Pentru a minimaliza acțiunea necontrolată a enzimelor lipolitice este necesar să se ia următoarele măsuri:să se reducă conținutul de apă liberă din materiile prime sau din produsele alimentare, acolo unde este posibil, pentru a micșora activitatea apei, deci pentru a micșora viteza reacțiilor enzimatice de lipoliză (cazul produselor alimentare uscate și parțial deshidratate, cum ar fi laptele praf, ouăle praf, semințele oleaginoase, brânzeturile, salamurile crude);să se păstreze materiile prime și produsele alimentare la temperaturi cât mai scăzute (refrigerare, congelare) pentru a se reduce viteza reacțiilor enzimatice sau să se inactiveze enzimele lipolitice prin tratament termic;să se reducă timpul de depozitare al unor materii prime, produse alimentare (carne, slănină, pește, unt);să se elimine factorii care conduc la dezvoltarea microflorei puternic lipolitice (drojdii, mucegaiuri).

20.11.2012Enzime oligozidazice și poliglucozidazice

β-glucozidaza (emulsima) – scindează legătura β-glucozidică din β-

glucozizii răspândiți în regnul vegetal, cum ar fi: amigdalina, prunasina, naringina, dar și celobioza și gențiobioza.

22

β-glucozidaza este produsă de următoarele microorganisme: Alcalingens fecalis; Aspergilius Niger; Tricoderma viridi; Sacharomices lactis.

Determinarea enzimatică a naringinei

β – glucozidaza se poate folosi pentru dezamărârea sucurilor de grepfrut deoarece hidrolizează naringina la rutinoză și naringerină, respectiv la glucoză și naringerină.

α – D galactozidaza – este o enzimă produsă de Bacilus stearo-termiphilus, Penicillium duponti, Absidia grisela, Aspergilius awamori. Acțiunea asupra rafinozei (trizaharid format din galactoză, glucoză și fructoză) o desface pe aceasta în galactoză și zaharoză.

Acest preparat enzimatic (adică α – D galactozidaza) poate fi utilizat în: industria zahărului, pentru recuperarea zahărului din melasă; industria derivatelor proteice de origine vegetală în vederea eliminării

zaharurilor implicate în flatulență.β – galactozidaza (lactoză) – este o enzimă care poate hidroliza lactoza la

glucoză și galactoză. Se obține ca preparat enzimatic din Aspergilius Niger și

23

Aspergilius Polyzae, precum și din Kluyveromices fragilis și Kluyveromices lactis.

Industrial se poate utiliza pentru: delactozarea laptelui concentrat sau a laptelui praf; obținerea siropului de glucoză + galactoză din lactoza din zer.Invertaza (β – fructozidaza) – este enzima care hidrolizează zaharoza.

Zaharoză + H O D glucoză + D fructozăSurse importante de invertază sunt: Sacharomices cerevisae, Sacharomices

carlbergensis, Kluyveromices fragilis.Invertaza se utilizează practic pentru obținerea de zahăr invertit, precum și

pentru împiedicarea cristalizării zaharozei în unele produse de bombonerie și ciocolaterie.

Amilazele

Sunt enzime implicate în degradarea amidonului care este format din amilază și amilopectină.

O primă clasificare a enzimelor este făcută după locul de stoc al amidonului:1 – endoamilazele în această grupă intră α – amilaza, care atacă lanțul de amilază și amilopectină la întâmplare în puncte din interiorul lanțului polimeric.

Endoamilazele scindează legături α (1-4) și dau naștere la diferite dextrine și anume eritodextrine cu masă moleculară ridicată.2 – exoamilazele atacă extremitatea nereducătoare a lanțului poliglucidic și eliberează maltoza prin ruperea legăturii penultime α 1,4 [β – amilaza] sau eliberează molecula de glucoză prin hidroliza ultimei legături glucozidice α 1,4 , α 1,6.3 – α 1,6 glucozidazele aceste enzime includ izoamilaza și pululanaza (enzima R), dextrina limită. Aceste enzime hidrolizează legături α 1,6 glucozidice, punctul de ramificare din structura amidonului și glicogenului.

O altă clasificare are legătură cu tipul legăturii hidrolizate:1 – Enzime care hidrolizează legături α 1,4 glucozidice:

a) α – amilaza, care este capabilă să rupă unic și la întâmplare legături α 1,4 glucozidice din amidonul gelatinizat. Rezultatul acțiunii lor este distrugerea structurii macromoleculare a amidonului, consecința fiind lichefierea acestuia. α amilazele pot de origine:

animală (amilaza din salivă, pancreatita); vegetală (amilaza din malț și alte cereale germinate); bacteriană (amilaze normale din Bacillus subtili, amilaze

termorezistente din Bacillus licheniformis); fungică (amilaze termostabile cu acțiune maltogenică,

Aspergilius Niger, Aspergilius orizae).b) β – amilaza (amilaza zaharigenică), care este de origine vegetală și

hidrolizează regulat legături α 1,4 glucozidice ale amidonului.

2 – Enzime care hidrolizează legături α 1,6 glucozidice:

24

Din această categorie fac parte:a) pululanaza este o endoenzimă de origine microbiană și care

hidrolizează legături α 1,6 din amilopectină și mai dificil din glicogen.b) izoamilaza este o endoenzimă de origine bacteriană, care hidrolizează

legături α 1,6 atât din amilopectină, cât și din glicogen.Microorganismele producătoare de pululanază sunt: Klebsiela aerogene și

specii din Bacillus, iar cele producătoare de izoamilază sunt Pseudomonas și Citophaga.3 – Enzime care atacă legăturile α 1,4, cât și legăturile α 1,6 glucozidice:

În această categorie este amiloglucozidaza (este o enzimă glucoamilază) de origine bacteriană și fungică ( Aspergilius Niger, Rhizobus).

Pentru a hidroliza amidonul în practică se utilizează 3 tipuri de enzime:1 – α amilaza bacteriană, care lichefiază amidonul în prealabil gelatinizat, α amilaza bacteriană acționează la pH 6.5 și 85ºC.2 – amiloglucozidaza fungică, care acționează la pH 3.5 – 6.5 și la 35 - 65ºC, rezultatul final fiind siropul de glucoză care eventual poate fi transferat în sirop de glucoză – fructoză cu glucozo – izomerază, care acționează la pH 7 și la temperatura de 50 - 60ºC.3 – β amilaza și pululanaza, care acționează la pH 6 și 45ºC și transferă amidonul lichefiat în sirop de maltoză.

SURSA % din amidonAMILAZĂ AMILOPECTINĂ

cerealegrâu 25 75porumb 12 78porumb ceros - 100orez 17 83orez ceros 3 97orz 27 73porumb amilo 70 30

tuberculicartofi 23 77cartofi dulci 20 80manioc 17 83

Nr. glucoză/moleculă 730 2300Compoziția amidonului în amilază și amilopectină

Enzime de lichefiere termostabile se extrag din Bacillus Amiloliquefaciens, care are optim de temperatură la 85 - 90ºC și Bacillus Liqueniformis, care poate acționa la 105 - 108ºC pentru perioade scurte.

Cu aceste enzime se poate lichefia și dextriniza amidonul într-un proces continuu. Pentru a preveni retrogradarea amidonului zaharificarea trebuie efectuată rapid după lichefiere și aceasta necesită răcirea soluției de amidon până la temperatura de zaharificare.

25

Gradul de zaharificare definit ca procentul de dextroză anhidridă formată în raport cu totalul de carbohidrați (substanța uscată) este realizat de amiloglucozidaza (exoenzimă) din Aspergilius Niger. Deoarece amiloglucozidaza nu hidrolizează, izomaltoza se utilizează pentru deramificarea enzimei pululanază obținută din Bacillus Acidopululidicus, care hidrolizează legătura α 1,6 din amilopectină.

Având în vedere că atât amiloglucozidaza, cât și pululanaza au același pH și aceeași temperatură de acționare, folosirea lor împreună prezintă următoarele avantaje:

este necesară o cantitate de amiloglucozidază cu 30% mai mică; se poate folosi un substrat cu concentrația mai mică și deci costurile de

concentrare (evaporare) vor fi mai reduse; pululanaza poate fi utilizată împreună cu β – amilaza pentru producția

siropului de maltoză.Puterea de îndulcire a siropului de glucoză poate fi mărită prin transformarea

parțială a glucozei în fructoză cu o izomerază imobilizată (din Bacillus Coagulans). Siropul obținut conține minimum 42% fructoză.

Etapele de degradare a amidonului pentru a obține diferite siropuri:

27.11.2012Celulaze și hemicelulaze

26

Celulozale sunt enzime care acționează asupra celulozei și, respectiv, asupra hemicelulozei (glucani, pentozani, galactomanani). Enzimele care acționează asupra celulozei sunt: C1 – celulaza care degradează celuloza cristalină (celuloza microgranulară, hârtia de filtru, fibrele de bumbac); Cx – β – celulaza care poate fi o endo – β – gluconază, care acționează asupra celulozei modificate și amorfe, o exo – β – gluconază care acționează ca și amiloglucozidază.

– β – glucozidaza – celobioza care degradează rapid celuloza și mai lent celohexoza.

Schema generală de degradare a celulozei

Utilizările celulazelor ca preparate enzimatice sunt următoarele: prin hidroliza celulozei din diferite vegetale până la glucoză care la

rândul său este folosită ca sursă de celulază pentru diferite procese de biosinteză, obținerea de acizi grași, producția de alcool etilic, producția de biomasă;

împreună cu hemicelulozele și enzimele pectolitice, celulazele se mai utilizează pentru creșterea gradului de extracție a sucurilor (sucuri de fructe, must de struguri) și pentru limpezirea sucurilor, berii.

Enzimele pectolitice

Acționează asupra substanțelor pectice care sunt substanțe gelifiante și care se găsesc în numeroase produse vegetale în principal în mere și citrice.

Substanțele pectice formate din polimeri de acid galacturonic și au masă moleculară cuprinsă între 30 000 – 300 000.

Pectina din produsele de origine vegetală se găsește în general sub formă de protopectină insolubilă datorită legării încrucișate a acizilor pectinici cu ionul Ca sau Mg .

După metoxilare pectinele pot fi: puternic metoxilate la care peste 70% din grupările carboxilice ale

acizilor pectinici sunt esterificate. Aceste pectine gelifică rapid, ele sunt favorizate în mediul acid și în prezența unei concentrații mari de zahăr;

slab metoxilate cu gradul de esterificare ≤ 50%, aceste pectine gelifică în prezența ionului de Ca la pH aproape de neutralitate și în prezența unei cantități reduse de zahăr.

27

Odată cu maturarea fructelor și legumelor ce conțin protopectină insolubilă, aceasta este hidrolizată sub acțiunea enzimelor pectolitice după cum descriem în figura de mai jos:

Degradarea protopectinei sub influența enzimelor pectolitice

Enzimele pectolitice se pot clasifica în:1 – saponifiante sau pectinesteraze;2 – depolimerizante sau pectinglucozidaze.

1 – Enzimele saponificate hidrolizează esterul metilic al acidului galacturonic din structura acizilor pectinici (acizi polimetilgalacturonici). Aceste enzime sunt notate PME (pectinmetilesteraze) sau PE (pectinesteraze).

Pectinesterazele se găsesc în produsele vegetale (tomate, pepeni, mere, pere) și sunt activate la pH 5.5 până la 7.5 și pot fi produse de mucegaiuri (pH optim 4-5) sau de bacterii (pH optim 7.5-8).

2 – Enzimele depolimerizate sunt pectinglucozidazele care la rândul lor se clasifică după următoarele criterii:

a) după tipul de scindare a lanțului polimetilgalacturonic sau poligalacturonic în prezența sau absența apei:

când scindarea se face în prezența apei avem de-a face cu o scindare hidrolitică;

iar când scindarea se face în absența apei avem de-a face cu o scindare transeliminativă.

b) după locul unde acționează: la interiorul lanțului polimetilgalacturonic sau poligalacturonic

(endo); la extremități (exo).

c) după stratul atacat care poate fi: acidul pectinic (polimetilgalacturonic); acidul pectic (un acid poligalacturonic mai scurt).

Enzimele pectolitice se utilizează în principal în industria sucurilor de fructe și legumele și la obținerea musturilor de struguri, și anume pentru:

tratamentul pulpei mărunțite în scopul: o creșterii randamentului în suc (îmbunătățirea gradului de extracție);o îmbunătățirii gradului de extracție de obținere a substanțelor de

culoare și aromă; tratamentul sucului în vederea:

o micșorării vâscozității și deci în vederea facilitării concentrării;o limpezirii sucului și respectiv pentru creșterea vitezei de filtrare;o evitării formării de precipitate la depozitarea sucurilor limpezi și

pulpoase.

28

Utilizarea enzimelor pectolitice la fabricarea sucurilor

Peptidhidrolazele

Aceste enzime hidrolizează legătura peptidică din protide oligopeptide conducând la eliberarea de peptide cu masă moleculară mică și chiar la eliberarea de peptide cu masă moleculară mică și chiar la aminoacizi în funcție de locul în care acționează în structura polimerilor.

După locul de acțiune peptidhidrolazele pot fi: Exopeptidhidrolaze sau peptidaze care acționează asupra legăturilor

peptidice la extremitățile polimerilor proteici cu eliminare de aminoacizi (aceste enzime pot activa atât asupra polimerilor nehidrolizați cât și asupra produșilor de degradare a endopeptidhidrolazelor.

Exopeptidhidrolaze sau proteinaze care acționează asupra legăturilor peptidice din interiorul polimerilor proteici conducând la produși cu masă moleculară mai mică.

Peptidhidrolaze de origine vegetală importante pentru industria alimentară

29

Peptidhidrolaze de origine vegetală utilizate în industria alimentară sunt așa-numite proteinaze alcaline sau tiolice. Ele se utilizează în special în industria cărnii pentru frăgezire și unele dintre ele și în industria berii sau a vinului.

1. Bromelina – se găsește în sucul de ananas, are un optim de acțiune la pH 6.3 și 55ºC, are o acțiune bună asupra fibrelor de colagen și una slabă asupra celor elastice. Acțiunea asupra fibrelor musculare este nesemnificativă.

2. Papaina – reprezintă preparatul brut care este componentul latexului fructelor de carica papaya. Latexul respectiv în contact cu aerul se coagulează după care se usucă sub vid, se macină și se cerne. Preparatul brut din papaya conține 3 fracțiuni:

papaina propriu-zisă 10%; chimiopapaina 40%; lizozim- sau papainpeptidaza 20%.

3. Ficina – se obține din latexul fructului de smochin, preparatul crud (brut) de ficină conține și 2 peptidaze, are pH optim cuprins între 6-8 și temperatura 63ºC. Acționează bine asupra fibrelor musculare și foarte bine asupra fibrelor elastice.

4.12.2012Peptidhidrolazele de origine animală și microbiană cu acțiune coagulantă

Chimozina este o endopeptidază carboxilică cunoscută sub denumirea de cheag, renină, presură, labferment. Se obține din stomacul glandular de vițel, miel, ied, unde se află sub formă de prochimozină.

Pepsina este o endoproteinază care este obținută din mucoasa roșie a stomacului glandular de la mamifere (porc), de unde se extrage cu HCl când are loc și transformarea formei inactive (pepsinogen) în formă activă (pepsină). Se folosește în principal la coagularea laptelui având o activitate proteolitică mai intensă decât a chimozinei.

Au fost obținute și enzime coagulante prin tehnica clonării. Preparatele enzimatice de origine microbiană sunt în general inferioare calitativ celor de origine animală deoarece:produc o cantitate mai mare de azot neproteic, ceea ce conduce la micșorarea randamentului în produsul finit (brânză) și la producerea de peptide amare ce se rețin în brânză;coagulul obținut este mai „moale” și se prelucrează mai greu având tendința de „prăfuire”, ceea ce conduce la scăderea randamentului în produsul finit;preparatele enzimatice de origine microbiană sunt și mai puțin reținute în coagul și deci intervin mai puțin în maturarea brânzeturilor.

Endopeptidaze cu acțiune puternic proteolitică

30

Endopeptidhidrolazele (proteinazele) cu acțiune principală proteolitică sunt proteinaze serinice din care cea mai importantă este tripsina.

Tripsina = este produsă în pancreas sub formă de tripsinogen (forma inactivă) care se transformă în tripsină activă în intestinul subțire sub acțiunea enterochinazei sau pe cale autolitică sub acțiunea unei cantități reduse de tripsină când are loc eliberarea unui hexapeptid.

Dintre enzimele proteolitice proprii țesutului muscular care intervin în maturarea naturală a cărnii se menționează:

1) Catepsinele: A; B (endopeptidaze); C (exopeptidaze); D.

2) Calpainele;3) Sistemul multifuncțional (proteosomul).

La maturarea cărnii nu sunt utilizate aceste enzime deoarece preparatele enzimatice respective ar fi foarte scumpe. Așa cum s-a menționat se utilizează preparate enzimatice proteolitice de origine vegetală.

La maturarea brânzeturilor se pot folosi preparate enzimatice obținute din: Aspergilius Niger (serinproteinaze); Bacillus subtilis (proteinază neutră); Aspergilius Oryzae (proteinază neutră); Penicillium Camembert și Penicillium Casecoliticum (proteinaze).

Izomeraze

Izomerazele sunt enzime care catalizează rearanjarea moleculară în substraturile asupra cărora acționează. Din punct de vedere al industriei alimentare ne interesează glucozoizomeraza, obținută din diferite genuri de Streptomices (S. Olivaceus, Olivocromogenes, Rubiginosus, Violaceoniger) sau diferite specii de Actinoplanes (A. Miscouriens), Bacillus (B. Coagulans) sau Nocardia, Artrobacter, Pseudomonas.

Glucozoizomeraza este relativ termostabilă (67ºC) și se poate folosi ca enzimă liberă sau imobilizată pentru producerea siropului de glucozo-fructoză.

Microorganisme utilizate în industria alimentară

Considerații generale31

Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară pentru obținerea de celule, de biomasă, de metaboliți primari, secundari și enzime.

Obținerea de celule (culturi starter – culturi pure)Celulele la rândul lor sunt folosite sub formă de culturi (maiele) de

producție pentru fermentarea produselor lactate acide sau a brânzeturilor, iar sub formă de culturi starter concentrate sunt folosite la fabricarea produselor din carne (salamuri și cârnați cruzi), produse tradiționale vegetale, produse lactate acide și a pâinii. În acest caz produsele se consumă fie împreună cu celulele respective, fie după îndepărtarea celulelor, cum este cazul băuturilor de tipul berii, vinului, cidrului.

Obținerea de biomasăBiomasa poate fi utilizată ca și ingredient de fermentare (drojdia de

panificație) sau de îmbogățire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru păsări, pește, porcine.

În tabel se prezintă principalele substraturi pentru obținerea de biomasă la nivel internațional:

SUBSTRATULMICROORGANISMELE

ȘI DENUMIREA COMERCIALĂ A

BIOMASEI

LOCUL DE PRODUCŢIEFOLOSIREA PRINCIPALĂ

Melasăzaharoză

Sacharomyces cerevisiae(drojdie de panificație) pretutindeni

Ingredient de fermentare în

panificațieZer (lactoză) Kluyveromices fragilis

(nutrex)Penicilium cyclopium

Amber – laboratories, SUA, Heurty SA Franța Aliment/furaj

Glucoză Fusarium graminearum(microproteină)

Rank hovis Mc Dougal res. Ltd, high wycombe,

H.KAliment/furaj

Sirop sulfitic(pentoze)

Candida utilisPhaecelomyces varioti

(proteina pekilo)

Celuloze attisholz, Elveția, Rusia, Lake

state, Rihnelander, Paper corp Rihnelander,

Wisconsin SUA, Finnis anaekoshi Finlanda, GA

seriachius oy mantta, Finlanda

Furaj

N – alcani Candida SP, Iodderomyces streptococus

Rusia Furaj

Candida paraffinica Curtea de Argeș, Ro. FurajCeluloză Chaetonium cellullo

lyticumEnvircom. Ltd

Vancouver, BC CanadaFuraj

Metanol Provesta corp, philips

32

Drojdie (provesten) petroleum Co, Oklahoma, SUA

Furaj

Methylophilus – pseudomonas clara

(probian)

Imperial chemical industries billingham – Anglia, hoechst – uhde Frankfurt – Germania

Furaj

Etanol Candida utilis(torutein)

Pure culture products (Amoco) hutchinson

Minnesota – SUA Aliment/furaj

CO Spirulina maxima, chlorella, chlorella

Sosa texaco SA Mexico City, Taiwan chlorella

manufacture, CO. Ldt – Taipei, Taiwan

Aliment/furaj

Biomasele obținute cu drojdii, bacterii, mucegaiuri diferă între ele atât prin compoziția chimică globală (proteine, lipide, glucide), cât și prin conținutul în vitamine.

Conținutul în vitamine al unor microorganisme:

VITAMINA Mg/100 g substanță uscatăDROJDI BACTERII MUCEGAIURI

tiamină 3.5 1.5 1.5riboflavină 5.0 5.5 3.0

Acid nicotinic 42.0 23.0 25.0Acid pantotenic 15.0 10.0 2.0

piridoxină 3 0.5 0.5Acid folic 2 0.9 0.5inozitol 390.0 - -

Acid paraminobenzoic

2.5 - -

Metaboliții primari

Aceștia sunt:a) alcool etilic, polioli (manitol, xilitol, sorbitol)b) conservanți (acidul acetic, acidul lactic, acidul propionic), alcool etilic,

antioxidanți și sinergetici (acid ascorbic, acid citric, acid galic, acid tartric)c) agenți de îngroșare (gume, xantanul, dextranul, manitol, glicerol)d) potențiatori de aromă (glutamatul)e) acidulanți (acid acetic, acid citric, acid tartric, acid gluconic, acid

fumaric, acid malic)f) aminoacizi (lizina, triptofanul, fenilalanina)g) vitamine (riboflavina, vitamina C, vitamina D); gazele (CO )

33