PowerPoint Presentation

TRANSFORMAREA GENETICA A TRESTIEI DE ZAHAR MEDIATA DE Agrobacterium tumefaciens: OBTINEREA DE PLANTE TRANSGENICE, EXPRESIA PROTEINELOR CU VALOARE AGRONOMICA SI INDUSTRIALARealizat de:Burueana Cristina LilianaIlie GeaninaIlie Oana

CuprinsIntroducereTulpina bacteriana si plasmideleTransformarea genetica a trestiei de zaharRezultate si discutiiConcluziiBibliografieTrestia de zahar cultura importanta pentru multe tari din intraga lumeInvestitia in incercarile de inmultire - cea mai buna abordare pentru maximizarea productiei de trestie de zahar. Inmultirea trestiei de zahar poate beneficia foarte mult de utilizarea metodelor neconventionale

Ingineria genetica poate scurta nu numai perioada de timp si reduce costurile pentru a produce o linie de productie imbunatatita de trestie de zaharDe asemenea, in genomul de trestie de zahar noi trasaturi agronomice importante ce sunt absente in mod natural in germoplasma acestei specii, cum ar fi: rezistenta la daunatori si erbicide. In cateva culturi, rezistenta la atacul fungic a fost sporita prin exprimarea proteinelor anti-fungice din plantele transgeniceIntroducere

Prin inginerie genetica, creste calitatea plantei ca materie bruta pentru productia de zahar sau /si a altor sub-produse. In plus, capacitatea inalta de producere de biomasa si cerintele agronomice scazute, face trestia de zahar un candidat excelent pentru a fi utilizata ca bioreactor in sinteza de noi produse pentru aplicatii medicale si industriale. Ca aplicatie interesanta, a fost aprobata expresarea levan-zaharazei de la Acetobacter diazotrophicus (LsdA) in plantele transgenice. Aceasta enzima actioneaza asupra sucrozei, rezultand cantitati mari de 1- Kestoza o fructo-oligo-zaharida (FOS) ce este utilizata in scop comercial pentru alimentatia sanatoasa atat a oamenilor cat si a animalelor.

Agrobacterium tumefaciens, a fost utilizat pe scara larga, ca mijloc pentru transformarea genetica a plantelor dicotiledonate, ulterior el fiind folosit si la monocotiledonate.Avantajele transformarii genetice mediata de Agrobacterium:- numarul mai mic de copii transgenice;- mai putine probleme in instabilitatea genelor.

Pentru obtinerea unei culturi aseptice de trestie de zahar s-au folosit explantele Ja60-5 si B4362 in mediul de cultura MS (Murashige i Skoog).

Compozitia mediilor de cultura pentru transformarea genetica a trestiei de zahar, mediata de Agrobacterium cu ajutorul tulpinilor Ja60-5 SI B4362Materiale si metode

Pentru testele de transformare genetica, au fost luate sectiuni de ax de la cultivatele de trestie de zahar cultivate pe camp, mai vechi de 6 luni, si sterilizate prin imersarea intr-o solutie de 1,5% NaClO (acid hipo-cloros), timp de 20 de minute.Sensibilitatea explantelor meristematice Ja60-5 si B4362 obtinute in vitro si crescute in camp, la diferite concentratii de PPT si hygromicina, a fost determinata pe timpul diferitelor faze de cultura.

S-a utilizat tulpina At2260 de Agrobacterium tumefaciens .Bacteria a fost crescuta pe mediu de cultura YEB, suplimentat cu rifampicina (50 mg/L), carbenicilina (50mg/L), ampicilina (100mg/L), streptomycina (100mg/L) si spectinomycina (100mg/L).Pentru stabilirea protocolului transformarii directe a fost utilizata plasmida pGT GUSBAR ce poarta genele A uid si bar .

Plasmidele suplimentare au fost construite pentru expresia levan-zaharazei de la Acetobacter dazotrophicus (LsdA) (pHES82 si pHES83) si co-expresia gluconazei si Ap24 (pHGA58) sau chitinaza si gluconaza (pHGA59).Plasmidele au fost introduse in A. tumefaciens prin protocolul transformarii directe.`Tulpina bacteriana si plasmideleTransformarea genetica a trestiei de zahar

Efectul antioxiantilor (Ao) din trestia de zahar asupra viabilitatii celulare a meristemului si cresterii Agrobacterium, au fost studiate la diferite intervale de incubare. Conditiile optime ale culturii de calus, s-a stabilit in prezenta compusilor acidul ascorbic (15 mg/l), cisteina (40 mg/l) si azotatul de argint (2mg/l).A. tumefaciens care adaposteste plasmida binara pGT GUSBAR a fost crescut pe mediu YEB. Celulele au fost colectate prin centrifugare si resuspendate in volumul initial de P+5, mediu suplimentat cu antioxidanti (LP+5Ao).

Diagrama descrierii procedurii care permite transformarea genetica a doua soiuri de trestie de zahar cultivate in scop comercial

Calusurile PPT- rezistente au fost taiate si subcultivate in fiecare luna pe mediu P+5 Sel timp de 3 luni. Rezistenta la PPT a calusurilor mici a fost confirmata de catre metoda cu clorofenol rosu. Calusurile capabile sa creasca in mediul care contine PPT produce un halo galben dupa 24 de ore de incubare. Regenerarea a fost efecuata pe mediu P+ conform procedurii standard.

Studiile asupra plantelor transgenice cultivate in sera au fost realizate prin cresterea acestora in ghivece. Aplicarea erbicidului BASTA in 2,5 g/L solutie a fost realizata prin pulverizare timp de 60 de zile dupa plantare. Rezistenta a fost evaluata din punct de vedere calitativ. Plante care nu au avut de suferit la nivel foliar, datorita toxicitatii au fost cele cultivate in camp. La final, s-a realizat analiza Southern blot descrisa de Sambrook i Fritsh (1989), folosind ca sonda un fragment de ADN de 1,2 kb care este marcat cu 32 P cu un sistem de primo-Gene (Promega).Rezultate obtinute:analiza explantelor meristematice de trestie de zahar izolate in vitro sau cultivate in teren este de obicei insotita de necroza tisulara destul de mare;aceste simptome sunt indepartate in timpul interactiunii tesut - A. tumefaciens mai ales in explantele cultivate in teren;in scopul reducerii necrozei, explantele de Ja60-5 i B4362 au fost tratate cu o combinatie de compusi antioxidanti;viabilitatea celulara a fost evaluata cu metoda de colorare albastru de Evans; meristemele trestiei de zahar au raspuns pozitiv la acest tratament cu o reducere semnificanta a necrozei si moartea calusului. Amestecul de antioxidanti acid ascorbic, cisteina, si azotat de argint nu au afectat nici cresterea Agrobacterium nici calitatea calusului trestiei de zahar.Rezultate si discutii

A fost studiat efectul inhibitor al PPT asupra esuturilor meristematice n diferite faze de cultur.Att meristemelor de la plantele cultivate in vitro, ct i celor provenite de la plantele cultivate pe teren, le-a fost stopat creterea i apoi au murit, la adugarea unei cantiti de 4 mg/l PPT.

S-a demonstrat c cea mai bun concentraie de PPT pentru selecie este de 4 mg/l i c este foarte important utilizarea acestui agent selectiv doar 10 zile de co-cultur.

Tabelul 1. Influena seleciei cu PPT asupra eficienei de transformare a activitii GUS n Ja60-5 i B4362 cultivate n momente diferite cu un agent de selecieAplicarea seleciei cu PPT imediat dup co-cultivare, a determinat o reducere a activitii GUS n a aptea zi, de 29-5 puncte (locuri, spoturi) pentru Ja60-5, respectiv 40-14 puncte pentru B4362, din cauza reducerii activitii celulare;Pe de alt parte, ncorporarea PPT n mediul de cultur la a 14-a zi dup co-cultivare a avut ca rezultat o mbuntire a activitii GUS de la 3 la 26 puncte pentru Ja60-5, respectiv de la 7 la 49 puncte pentru B4362 ;Aceste rezultate, pot fi explicate prin prezena ntr-o proporie foarte mare, de celule transformate n explant.

Cele mai multe colonii de celule recuperate dup prima lun de selecie cu PPT au proliferat atunci cnd au fost subcultivate pe un mediu selectiv proaspt. Plantele au fost regenerate cu uurin atunci cnd esuturile rezistente au fost transferate pe un mediu de regenerare fr PPT. Un numr mare dintre aceste plante au fost rezistente la erbicidul BASTA n condiii de ser. Analiza de Southern blot pe plantele rezistente la erbicidul BASTA a confirmat integrarea transgenic.

Tabelul 3. Eficiena de transformare n B4362 a trestiei de zahr cu dou combinaii de gene antifungiceProtocolul anterior a fost utilizat pentru a obine plante transgenice de B4362, transformate cu construciile genetice pHCA58 i pHCG59;Calusurile rezistente la PPT derivate din infecie, au dat natere la plante n mediul de regenerare;Numrul de calusuri rezistente i numrul total de plante regenerate folosind pHCG59 a fost mai mare n comparaie cu cele la care s-a folosit pHCA58. Toate plantele obinute utiliznd plasmida pHCA58 (151 plante) i plasmida pHCG59 (227 plante) au fost adaptate pentru condiiile de ser, iar la nlimea de 50 cm au fost transferate n condiii de cmp;n plus, 12 plante netransformate au fost folosite ca martori.

Higromicina a fost raportat ca un agent selectiv eficient pentru speciile de monocotiledonate; A fost necesar o concentraie de 120 mg/l de antibiotic pentru a inhiba dezvoltarea meristematic a trestiei de zahr, n timpul formrii de calus;Transformarea a avut loc folosindu-se plasmidele pliES82 i pliES83:Celulele transformate formeaz calusuri separate clar de esutul necrozat.n etapa de regenerare higromicina, n cantitate de 30 mg/l a fost suficient pentru a distruge esutul netransformat.Plantele rezistente la higromicin au fost transferate n sere i transgenele au fost detectate prin PCR. Plasmidele pliES82 i pliES83 au fost concepute pentru expresia enzimei i localizarea n apoplast i vacuol, respectiv cu scopul de a converti trestia de zahr ntr-o surs de fructooligozaharide. ConcluziiDificultile n transferul de gene mediat de A. tumefaciens la monocotiledonate este legat de rata de supravieuire slab a celulelor int;

Prin utilizarea unui pretratament antinecrotic asupra explantelor meristematice au fost realizate randamente bune de transformare cu o tulpin obinuit de A. tumefaciens, un vector binar genetic convenional, i fr utilizarea inductorilor chimici (acetosiringone).BibliografieAriel D. Arencibia PhD, 2000 - Plant Genetic Engineering Towards the Third Millennium, Editura Elsevier, Amsterdam, Lausanne, New York, Oxford, Shannon, Singapore, TokyoVa multumim pentru atentie!