Biotehnologia compuilor steroidici

Biotehnologia vitaminelor

Vitaminele XE "Vitamine" sunt substane fiziologic active necesare organismului n cantiti foarte mici. Carena lor genereaz avitaminoz, boal ce se manifest prin tulburri caracteristice.Vitaminele acioneaz n organism n calitate de coenzime drept reactani a unor procese chimice ale metabolismului. Ele nu pot fi sintetizate de organismul animal ci numai de plante i de anumite microorganisme.

Vitaminele se clasific n funcie de solubilitate n dou grupe:

Vitamine liposolubile: vitaminele A, D, E, K.

Vitamine hidrosolubile: vitaminele complexului B, vitamina C.

Vitaminele hidrosolubile obinute prin biosintez sunt: vitamina B2 i B12, iar procedee mixte de sintez i biosintez sunt aplicate la obinerea vitaminei C.

Avantajele economice oferite de biosintez fac ca aceasta s fie tot mai mult utilizat pentru obinerea vitaminelor hidrosolubile.

Un mare numr de vitamine din grupa B sunt sintetizate de microorganisme i sunt factori eseniali de cretere ai acestora. Acestea se pot acumula endo i exocelular. Determinarea lor n biomas i n lichidul de cultur, la dezvoltarea microorganismului Propionibacterium technicum pe un mediu sintetic suplimentat cu tiamina i acid pantotenic, indic valori apreciabile (tabelul 7).

Tabelul 7 Biosinteza vitaminelor B cu P. technicum pe mediu sintetic

VitaminaConinutul de vitamine dup dezvoltarea bacteriilor

/g biomas uscat/l mediu cultur

Tiamina (B1)13562

Riboflavina (B2)210420

Piridoxina (B6)5125

Ciancobalamina (B12)2300

Acid pantotenic25227

Acid nicotinic (PP)524522

Acid folic3573

Cultivnd Propionibacterium technicum pe mediu de cultur organic se obin valori mai sczute de vitamine din grupa B (tabelul 8).

Tabelul 8. Biosinteza vitaminelor B de ctre Propionibacterium technicum pe mediu organic.

VitamineConinutul de vitamine iniial n mediu, /lConinutul de vitamine dup dezvoltarea bacteriilor

/l de biomas uscat/g lichid de cultur

TiaminaNedeterminat11,853

RiboflavinaIdem50Nedeterminat

Acid pantotenic874,330,5

Piridoxina168,4Nedeterminat124

Acid nicotinic804140627

Vitamina B1201800

Prezena vitaminelor complexului B n subprodusele industriei fermentative a condus la valorificarea acestora sub form de reziduu total (borhotul evaporat la sec), reziduu solubil (filtratul borhotului evaporat la sec), sau biomas filtrat.

Aceste rezidii sub form de pulbere, sirop de 45-50% substan uscat sau chiar forma neprelucrat se folosesc drept concentrat vitaminic n zootehnie, avicultur i biotehnologii (tabelul 9).

Tabelul 9. Coninutul n vitamine al unor subproduse de biotehnologie n / g substan uscat.

VitaminaRezidiu uscat

borhot EtOH

cerealeRezidiu solubil

uscat borhot

EtOH cerealeMiceliu

penicilinMiceliu uscat

penicilin

Tiamina (B1)3-46-93-7-

Riboflavina (B2)7-1015-2020-487-29

Acid pantotenic12-1529-3688-212592-805

Acid nicotinic70-90104-160107-180232-333

Piridoxina (B6) 4-68-1021-2582-114

Biotina (H) 0,2-0,30,3-0,70,6-1,50,6-0,8

Coninutul n vitamine al unor subproduse de biotehnologie se exprim n /g substan uscat.

Cele mai mari cantiti de vitamine se gsesc n drojdii. Folosirea extractului de porumb, a malului, a melasei n formarea mediului de cultur, favorizeaz obinerea vitaminelor complexului B. Stimularea producerii vitaminelor se poate face prin adugarea n mediul de cultur a unor componente din grupul complexului B: tiamin, acid pantotenic, acid nicotinic sau biotin, sau a unor precursori. Astfel, prin introducerea -alaninei crete coninutul de acid pantotenic, iar introducerea componentelor piridinice i tiazolice ale tiaminei mrete coninutul n tiamin de la 20-40 /g la 650 /g (tabelul 10).

Tabelul 10. Coninutul n vitamine B al drojdiilor industriale (/g substan uscat)

VitaminaDrojdie de panificaieDrojdie de bereDrojdie furajer

Tiamina16-4068-1805-53

Riboflavina 25-8021-8026-70

Acid pantotenic150-33042-20040-180

Acid nicotinic240-700281-1000153-600

Piridoxina 25-6523-10035

Acid folic19-8019-304-31

Biotina 0,8-2,40,8-1,10,5-3,6

Acid

p-aminobenzoic24-1759-10217-62

Inozitol 43202700-50002700-3600

Folosind drojdii industriale nu se poate obine n condiii economic avantajoase o anumit vitamin B, se poate obine ns ntreg complexul B.

Autolizatul de drojdie se concentreaz pn la sec sau pasta de drojdie de panificaie se suspend n ap distilat obinndu-se un concentrat de vitamine B, care dup prelucrare (uscare, drajefiere) se comercializeaz sub denumirea de Complex B.

i alte vitamine se pot obine cu ajutorul mucegaiurilor i bacteriilor. Vitamina C apare n cantiti mari n mediile de cultur ale microorganismului Aspergillus niger i Bacillus prodigiosus; biotina n biosinteza acidului fumaric cu Rhizopus, riboflavina i acidul pantotenic la fermentaia anaerob cu Bacillus polymyxa sau aerob cu Aerobacter aerogenes.

Vitamina B2 (Riboflavina) XE "Vitamina B2"

Vitamina B2 este un factor indispensabil tuturor organismelor animale. Este o component a coenzimei flavoproteinelor existente n toate celulele, care catalizeaz transferul de hidrogen dintre sistemul enzimatic al coenzimelor I i V (donoare de hidrogen) i sistemul enzimatic al citocromilor (acceptor de hidrogen).

Vitamina B2 se gsete n cantiti mari n lapte, brnz, ficat, rinichi, albuul de ou i legume verzi.

A fost identificat prima oar de ctre Blyth (1879) n lapte, a fost izolat n stare pur n 1933 de ctre Ellinger i Koschara din lapte i de Kuhn, Szent-Gyorgy i Wagner-Jauregg din lapte i ou.

Vitamina B2 este o pulbere cristalin de culoare galben-portocaliu, cu punct de topire 292oC, termostabil i foarte sensibil la radiaii ultraviolete i vizibile.

Vitamina B2, riboflavina sau 6,7-dimetil-9(1- d-ribidil)-izoaloxazina este primul component izolat i identificat al complexului B cu urmtoarea structur:

Aceast structur stabilit prin reacii de degradare a fost confirmat prin sintez total de ctre Karrer i Kuhn.

Pentru biosinteza vitaminei B2 se pot utiliza ciuperci, drojdii, precum i unele specii de Clostridium sau Lactobacillus (tabelul 11).Tabelul 11. Microorganisme utilizate n biosinteza vitaminei B2

Microorganisme utilizateProductivitate

Eremothecium ashbyi> 2.000/ ml

Ashbya gossypii>2.000/ ml

Candida flareri700-800/ ml

Clostridium accetobutilicum80-100/ ml

Pentru biosinteza vitaminei B2 se folosesc cel mai mult Eremothecium ashbyi i Ashbya gossypi care au productivitate mare i nu sunt sensibile la cantiti mici de ioni de fier. Cultivarea lor la scar industrial este rentabil, dei au o durat relativ mare a procesului de fermentaie. Studiile efectuate cu privire la mecanismul de biosintez au relevat rolul de precursor al purinelor (xantina) hipoxantina, mresc randamentul cu 40% la introducerea n mediul de cultur). Studiile de biosintez ntreprinse cu medii de cultur n care s-au introdus anumite componente considerate drept precursori coninnd carbon marcat (C14) au demonstrat c atomii din poziiile 4a i 9a a moleculei de riboflavin provin din glicin, cel din poziia 4 provine din CO2, iar cel din poziia 2 provine din formiat. Catena lateral este grefat pe derivatul diamino-pirimidinic, iar ciclul pirazinic i benzenic au drept precursor acetona sau diacetilul rezultai la reducerea acetil-coenzimei A i care la rndul su se formeaz din acid piruvic prin decarboxilare oxidativ (schema 26).Schema 26

Tehnologia obinerii vitaminei B2Obinerea prin biosintez a vitaminei B2 se realizeaz pe o linie tehnologic asemntoare produselor de biosintez i include urmtoarele etape: sterilizarea aerului i a mediului de cultur, fermentaia, separarea vitaminei din biomas i purificarea ei.

Procesul de biosintez a vitaminei B2 este foarte sensibil la toi factorii ce intervin n timpul unui ciclu de fermentaie. Microorganismele productoare de riboflavin sunt foarte sensibile i dau uor mutaii existnd permanent pericolul infeciilor. Din aceste motive sterilizarea mediului de cultur ridic probleme deosebite.

Cele mai bune rezultate n fermentaie se obin atunci cnd sterilizarea componentelor mediilor de cultur se face separat la 140oC timp de trei minute.

Etapa de fermentaie se poate realiza prin procedeul de fermentaie de suprafa sau fermentaie n profunzime.

Procedeul culturii n profunzime este utilizat curent n industrie, ofer randamente mari, economie de spaii i manoper, iar produsul obinut este omogen i de calitate.

Factorii care condiioneaz procesul de biosintez sunt: natura microorganismului, calitatea i cantitatea inoculului, compoziia mediului, pH-ul, temperatura, aeraia, regimul de agitare, materialul de construcie a fermentatorului i forma acestuia.

Biosinteza industrial utilizeaz ca surse de carbon: glucoza, zaharoza i maltoza. Utilizarea melaselor conduce la randamente sczute. Se folosesc concentraii de 2-4%, iar adaosul de mal 1% are efect favorabil asupra fermentaiei.

Sursele de azot aminic folosite sunt: peptona (extract de carne), fina de pete, extractul de drojdie, miceliul de peniciline i tetracicline, colagenul, cleiul de oase, fina de soia, extractul de porumb, cazeina. Aminoacizii coninui n aceste surse de azot mresc viteza de cretere a biomasei (acidul glutamic, aspartic, asparagina) n prima etap a biosintezei i genereaz riboflavina n a doua etap (treonina, serina, tirozina).

Dintre vitamine, inozitolul, biotina i tiamina sunt factori eseniali pentru dezvoltarea biomasei.

Se folosesc precursori purinici n concentraii de 1,5-2x10-3 molar ca i guanin, xantin, hipoxantin, etc. Acetia mresc activitatea mediului cu 25-40%.

Se asigur necesarul de fosfor, magneziu, zinc prin adugare de sruri anorganice. Se lucreaz la un pH optim 6,5-7 i la temperaturi de 28-30oC.

Procesul de fermentaie se desfoar n patru faze.

n prima faz, care dureaz 20-25 de ore are loc un consum accentuat de zahr i o scdere de pH a crui valoare, dac nu e corectat, ajunge la 5-5,5. n aceast faz nu se elaboreaz vitamina B2, dar are loc o acumulare de mas microbian.

n faza a doua, coninutul de zahr se reduce n continuare, pH-ul scade, iar n biomas se formeaz spori ce declaneaz formarea de riboflavin. Durata acestei faze este aproximativ tot 20-25 de ore.

n faza a treia, care dureaz aproximativ 100 de ore, zahrul este metabolizat n ntregime, pH-ul ncepe s creasc continuu i se corecteaz cu acizi pentru meninerea valorii optime. n acest stadiu numit faz de producie, se formeaz cantitatea cea mai mare de vitamin B2. Riboflavina apare la nceput ca metabolit intracelular, apoi se repartizeaz ntre miceliu i mediul apos, iar n final este deplasat preferenial n soluia apoas.

n faza a patra a fermentaiei, acumularea de riboflavin nceteaz i ncepe un proces accentuat de autoliz a miceliului, caracterizat prin creterea brusc de pH. Aceast etap trebuie evitat, deoarece ncepe i degradarea produsului biosintetizat.

Dinamica principalilor parametri n biosinteza industrial a riboflavinei este tipic pentru un metabolism endocelular.

Pentru industria farmaceutic, produsul biosintetizat trebuie separat din mediul de cultur. Dup coagulare prin acidulare i nclzire la 70oC, biomasa se filtreaz pe filtru pres la 20oC, iar filtratul trece la separare.

Separarea vitaminei B2 din soluia nativ se poate face prin mai multe procedee:

1. reducerea chimic la dihidroriboflavin i reoxidare, conform schemei (schema 27):

Schema 272. reducere i reoxidare biologic;

3. extracie cu solveni organici;

4. separare cu schimbtori de ioni.

Primele dou procedee sunt aplicate n industrie. Metodele de extracie cu solveni organici i separarea cu schimbtori de ioni sunt dezavantajoase din punct de vedere economic.

Reducerea cea mai frecvent folosit n separare este cea chimic. Se utilizeaz ditionitul de sodiu care este solubil n mediu alcalin i se descompune rapid n mediu neutru sau slab acid. n faz apoas, la un pH 5-5,5, n raport molar 1,5:1 fat de riboflavin, se comport ca un reductor energic.

Dihidroderivatul este foarte puin solubil n ap, precipit i se filtreaz. Se usuc la aer la 40-50oC, cnd o mare parte se oxideaz. Perfectarea oxidrii se face cu H2O2 n soluie apoas concentrat. Purificarea se face prin recristalizare din ap (figura 24).

Figura 24. Instalaia de separare a vitaminei B2

1- aparat de reducere, 2- vas msur soluie hidrosulfit, 3- centrifug, 4- usctor, 5- turn de oxidare, 6- aparat pentru perfectarea oxidrii, 7- vas msur HCl, 8- vas msur H2O2, 9- filtru nuce, 10- aparat recristalizare, 11- vas msur ap (pentru diluare), 12- vas msur soluie NaOH (pentru ajustarea pH-ului la 6), 13- rezervor.

Cea mai mare parte din vitamina B2 obinut prin biosintez se folosete n industria alimentar, n prepararea concentratelor alimentare (lapte condensat, sucuri concentrate), n prepararea unor produse farmaceutice (de obicei intr n compoziia unor amestecuri de vitamin B cu aciune revitalizant folosite n surmenaj i convalescen).

Deficitul vitaminic este mai frecvent atunci cnd alimentaia este mai srac sau la alcoolicii cronici. Simptomele principale n acest caz sunt: stomatit, dermatit seboreic, anemie,etc.

Vitamina B12 (Cianocobalamina) XE "Vitamina B12"

Cobalaminele sau cobamidele sunt vitamine din complexul B cunoscute sub denumirea de vitamina B12. Ele au structura asemntoare hemoglobinei, format dintr-un macrociclu porfirinic centrat pe un atom de cobalt, de care se leag o grupare de tip adenozinic i o grupare cian pentru cianocobalamin XE "cianocobalamin" sau hidroxi pentru hidroxicobalamin XE "hidroxicobalamin" . Ciancobalamina i hidroxicobalamina sunt cele dou forme stabile folosite ca medicament.

Vitamina B12 a fost izolat n stare pur n 1948 de Folkers Smith i Parker din ficat i de Rickes din culturile diferitelor tulpini.

Este o substan cristalin de culoare roie, puin solubil n ap, etanol i insolubil n general n toi solvenii nepolari: benzen, eter, etc.

Structura vitaminei B12 a fost stabilit printr-un efort comun al cercettorilor din domeniul chimiei organice i analizei fizico-chimice. Un aport deosebit l-a adus difracia cu raze X efectuat de Crowfoot-Hodgkin n 1955.

Vitamina B12 deriv de la un sistem macrociclic numit corin care conine patru atomi de azot inclui n cele patru nuclee pirolice (notate A,B,C,D).

Derivaii acestui sistem macrociclic se numesc corinoide. Ele sunt derivai ai unui acid heptacarboxilic numit acid cobirinic XE "acid cobirinic" .

n vitamina B12 ase din carboxilii acidului cobirinic sunt amidificai ca grupe CONH2, iar al aptelea este amidificat cu grupa -NH2 din D(-) 1-amino-2-propanol. Grupa OH din acest alcool este esterificat cu acidul fosforic care se leag i de N-glicozida 5,6-dimetil-benzimidazolului. Al doilea atom de azot al inelului imidazolic este coordinat de ionul de Co3+, tricovalent, cu un numr de coordinaie ase. Ionul de Co3+ din centrul ciclului corinic se leag de o grupare -CN, de un atom de azot din nucleul pirolic (nucleul D), iar a treia sarcin este satisfcut de restul de ester fosforic din poriunea nucleotidic I a moleculei.

Deci molecula vitaminei B12 este format din dou poriuni: I partea nucleotidic coninnd restul 5,6-dimetil-benzimidazol, riboz i acid fosforic i poriunea II ce conine sistemul macrociclic i ionul de cobalt.

Sursele principale de vitamin B12 sunt:

endogene - vitamina B12 se sintetizeaz de ctre bacteriile intestinale ale rumegtoarelor;

exogene - prin aport alimentar de proteine animale. Vitamina B12 se gsete n ficatul animalelor, n nmolul activ al staiilor de epurare i n culturi microbiene.

Din ficatul animalelor separarea se face prin tratare cu cianur alcalin sau acid clorhidric, dup care concentratul este supus aciunii fermenilor digestivi sau a pepsinei i adsorbie pe crbune activ. De pe crbune vitamina B12 se elueaz cu alcooli alifatici i din soluia alcoolic se extrage cu solveni organici, se reextrage cu ap i se purific prin cromatografie.

Utilizarea nmolului activ de la staiile de epurare a apelor reziduale este o surs pentru obinerea vitaminei B12 furajere.

Culturile microbiene constituie principala surs economic de obinere la scar industrial a vitaminei B12.

Din produsele naturale au fost izolate mai multe substane cu structur puin diferit de cea a cianocobalaminei.

Astfel, n locul 5,6-dimetilbenzimidazolului, factorul A conine un rest de 2-metiladenin, provitamina B12 conine un rest de adenin, factorul G un rest de -hipoxantin, factorul H un rest de 2-metilhipoxantin. Factorul B nu are 5,6-dimetilbenzimidazol, n factorul V1a (sau acidul cobirinic) apare doar macrociclul substituit, dar ca acid liber n poziia 17, factorul WR este un complex al vitaminei cu o protein.

Din seria analogilor de semisintez amintim B12r - conine cobalt bivalent; B12s - are cobalt monovalent (se obine prin reducerea vitaminei B12 n mediu acid sau bazic); aquacobalamina XE "aquacobalamina" -conine n locul grupei CN o molecul H2O; hidroxicobalamina - conine n locul grupei CN o grupare OH. Aquacobalamina se obine din surse naturale n absena ionilor CN, de asemenea se obine prin reducerea sau fotoliza vitaminei B12 (B12a are drept ligand central apa, B12b - grupa hidroxil, B12 c- ionul nitrit,etc.).

Cunoaterea mecanismului de biosintez a vitaminei B12 prezint o importan foarte mare pentru stabilirea condiiilor optime de realizare a procesului de fermentaie. n mecanismul de biosintez a vitaminei B12 se disting dou etape fundamentale:

a. formarea ciclului corinic;

b. ncorporarea restului nucleotidic.

Procesul simplificat al mecanismului de biosintez este prezentat n schema 28.Vitamina B12 este produsul de metabolizare al unor actinomicete: Streptomyces grizeus, S. olivaceus, S. aureofaciens sau a unor bacterii: Bacillus megaterium, Propionibacterium freudenreichii, P. shermani, P.technicum.Schema 28Tehnologia obinerii vitaminei B12Fabricarea industrial a vitaminei B12 prin biosintez cuprinde urmtoarele faze: sterilizarea aerului i mediului de cultur, fermentaia, separarea, purificarea i cristalizarea vitaminei B12.

Se utilizeaz n practic S olivaceus, P. shermanii, P. freudenreichii i P. technicum. Procesul de biosintez este influenat de temperatur, pH, compoziia mediului de cultur, gradul de aerare, precursori i modul de sterilizare a mediului de cultur.

Se utilizeaz un mediu de cultur bogat n aminoacizi eseniali, sruri de cobalt, dimetilbenzimidazol, zaharuri. Biosinteza are loc la 30oC, n condiii de aerare minim i la pH 6,8-7 i dureaz aproximativ 70-120 de ore, pn la epuizarea surselor de carbon.

Se lucreaz cu glucoz sau zaharoz (sursa de carbon i energie), extract de porumb sau fin de soia n cantiti mari (sursa de azot), autolizat de drojdii sau hidrolizat de cazein. Creterea biomasei este stimulat de biotin i de anumii aminoacizi: glicin, serin, valin, acid aspartic. Introducerea clorurii de cobalt se face de la nceputul procesului, iar benzimidazolul se introduce dup 50-60 de ore.

n faza de inocul i prefermentare are loc creterea biomasei i formarea acidului aminolevulinic. n absena ionilor Co2+ se formeaz n mediul de cultur porfirine, iar la concentraii suficiente de Co2+, acidul aminolevulinic nu mai trece n mediu, ci se transform n acid cobirinic n interiorul celulelor.

Cobalamina este coninut n biomas. Dup coagularea termic, cu electrolit sau bazic, se filtreaz amestecul de fermentaie i se obine un prim concentrat din biomas. n biomasa uscat de P. shermanii, concentraia vitaminei ajunge la 1500 /g n condiiile fermentrii aerobe i 2500 /g n fermentaii anaerobe. Biomasa filtrat se trateaz la 90-95oC cu acid azotos, cnd se pune n libertate aquacobalamina i hidroxicobalamina din complecii proteici ce le conin.

Vitamina eliberat se transform, sub aciunea acidului azotos obinut n vasul 1 dintr-o soluie de azotit de sodiu 0,5% i acid clorhidric adugat din dozatorul 2, n nitrozocobalamin, mai stabil. Se filtreaz pe un filtru pres 3, se spal pe filtru cu ap cald (85-95oC). Dup reunirea filtratului cu apa de splare se salefiaz n vasul 4 cu NaCl i se filtreaz din nou, apoi se trimite la extracie (figura 25).

Pentru izolarea vitaminei B12 se folosete cel mai mult metoda extraciei selective. Din faza apoas se extrage aqua i hidroxicobalamina cu un amestec butanol:fenol = 1:1. Extractul organic ce conine vitamina B12 se trateaz cu ap (raport 20:1) cnd vitamina se reextrage din solvent n ap. Soluia apoas obinut dup separarea fazelor, se trateaz cu NaCN la pH 7,5-8 cnd are loc obinerea ciancobalaminei care se supune purificrii.

Purificarea const n extracie cu solvent organic i cromatografiere. Se extrage cu amestec de crezol-CCl4 din soluia rezultat de la cianurare, apoi se adaug un amestec de butanol-CCl4 pentru modificarea polaritii extractului i se reextrage cu ap distilat. Se obine un concentrat de peste 10.000 /ml. Acesta se concentreaz sub vid, cnd cristalizeaz amestecul de vitamine brute, sau se aplic o cromatografie preparativ pe coloane de Al2O3 parial activat, silicagel activat. Eluarea se face cu aceton, amestec aceton-fenol sau aceton-ap.

La rece cristalizeaz ciancobalamina. O purificare suplimentar se poate face prin recristalizare din ap deionizat. Concentrarea succesiv de la 25 /ml la sfritul biosintezei la 5.000-10.000 /ml dup cromatografie, face ca o bun parte din operaii s se execute la nivel de laborator. arjele industriale de vitamina B12 sunt de 5-50 g.

Izolarea i purificarea vitaminei B12 este ilustrat n urmtoarea schem a operaiilor (schema 29):

Schema 29

Figura 25. Extracia n ap a vitaminei B12 din masa bacterian

1-reactor, 2-dozator HCl, 3-filtru pres, 4-vas de salefiere

Vitamina B12 este un factor indispensabil creterii organismelor tinere i un medicament foarte bun n tratamentul anemiei pernicioase.

Este esenial pentru replicarea ADN-ului. Ea intervine n creterea i maturarea celular, fenomen evident mai ales la nivelul hematiilor i a altor celule cu proliferare intens.

Avitaminoza B12 se manifest prin anemie megaloblastic i prin leziuni neurologice caracteristice.

EMBED ChemWindow.Document

EMBED ChemWindow.Document

EMBED ChemWindow.Document

EMBED ChemWindow.Document

EMBED ChemWindow.Document

EMBED ChemWindow.Document

PAGE 9

_1145183535.bin

_1145183668.bin

_1145195170.bin

_1145525671.vsdNitrozarepH=4,5

Filtrare

Salefiere

M.B.

H2O

HCl

NaNO2

H2O splare

NaCl soluie

Filtrare

Precipitat

Extracie

C6H5OH:butanol=1:1

Solvent organic

H2O(20:1)

Soluie apoas B12

CianurarepH=7,5

NH3

NaCN

ExtraciepH=7

Crezol:CCl41:1

CH3COOH

Strat apos cu NaCN

Prelucrare cu FeSO4

Extracie

H2O

Butanol:CCl4

Solvent organic epuizat

CromatografieAl2O3

Soluie

apoas B12

Evaporare

Filtrare

Uscare

VITAMINA B12

_1145195214.bin

_1145183959.bin

_1145183628.bin

_1145043331.dwg

_1145043644.dwg

_1141657949.bin