UNIVERSITATEA DIN BUCUREŞTI

Facultatea de Chimie

BIOSENSORI-

INSTRUMENTE ANALITICE UTILIZATE ÎN

LABORATORUL MEDICAL

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

Conducător ştiinţific,

Profesor Dr. Vasile Magearu

Doctorand,

Elena Rodica Ionescu

Bucureşti, 2007

CUPRINS

INTRODUCERE............................................................................................................................ 3

3. S3. SENSORENSOR AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA PROTEAZELORPROTEAZELOR..................................................73.5. Rezultate şi discuţii............................................................................................................ 7

3.5.1. Caracterizarea electrochimicǎ a electrodului modificat cu poly(pirol-alchilamonium)-Gox....................................................................................................................................... 73.5.3. Performanţele analitice ale biosensorului pentru determinarea tripsinei......................8

4. D4. DETECTAREAETECTAREA AMPEROMETRICĂAMPEROMETRICĂ AA CCADN-ADN-ULUIULUI DERIVATDERIVAT DINDIN VIRUSULVIRUSUL NNILEILE W WESTEST FOLOSINDFOLOSIND ELECTROZIELECTROZI MODIFICAŢIMODIFICAŢI CUCU FILMULFILMUL DEDE POLIPIROLPOLIPIROL.........................................................................9

4.1. Introducere........................................................................................................................ 94.2.1. Oligonucleodele WNV.............................................................................................. 10

4.4. Prepararea sensorului ADN............................................................................................ 104.5. Rezultate şi discuţii.......................................................................................................... 10

4.5.1. Elababorarea electrochimică şi caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS).................104.5.3. Curba de calibrare amperomtrică pentru determinarea concentraţiilor de cADN WNV............................................................................................................................................ 11

4.6. Concluzii......................................................................................................................... 115. S5. SENSORENSOR ELECTROENZIMATICELECTROENZIMATIC POLIPIROLPOLIPIROL--INTERCALATORINTERCALATOR PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA CCADN ADN DERIVATDERIVAT DINDIN VIRUSULVIRUSUL NNILEILE W WESTEST............................................................................................................. 12

5.1. Introducere...................................................................................................................... 125. 4. Rezultate şi discuţii........................................................................................................ 125.5. Concluzii......................................................................................................................... 13

6. I6. IMUNOSENSORMUNOSENSOR AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA ANTIANTI--NNILEILE WWESTEST VIRUSVIRUS I IGGG G FOLOSINDFOLOSIND UNUN COPOLIMERCOPOLIMER FOTOACTIVFOTOACTIV......................................................................................................... 14

6.1. Introducere...................................................................................................................... 146.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un film polimeric...............................................146.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul de copolimeric............................................14

6.4. Rezultate şi discuţii.......................................................................................................... 156.4.3. Construcţia imunosensorului şi detecţia anticorpilor WNV.......................................15

6.5. Concluzii......................................................................................................................... 157. I7. IMUNOSENSORULMUNOSENSORUL AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA ANTIANTI-N-NILEILE W WESTEST VIRUSVIRUS I IGGG G FOLOSINDFOLOSIND INCAPSULAREAINCAPSULAREA PHAGILORPHAGILOR INTRINTR--UNUN FILMFILM DEDE POLIPIROLPOLIPIROL((ALCHILALCHIL--AMONIUMAMONIUM)................16

7.1 Introducere....................................................................................................................... 167.4. Prepararea imonosensorului-WNV având la bazǎ phagi incapsulaţi într-un film de polipirol.................................................................................................................................. 167.5. Rezultate şi discuţii.......................................................................................................... 17

7.5.1. Elaborarea electrozilor modificaţi cu polimer si phagi..............................................177.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-phagi WNV.....................................................187.5.3. Performanţele imunosensorului pentru detectarea anticorpilor-WNV.......................18

7.6. Concluzii......................................................................................................................... 198. C8. CONSTRUIREAONSTRUIREA IMUNOSENSORILORIMUNOSENSORILOR AMPEROMETRICIAMPEROMETRICI PENTRUPENTRU DETERMINAREADETERMINAREA ANTICORPILORANTICORPILOR ANTIANTI--HOLERǍHOLERǍ BAZAŢIBAZAŢI PEPE ELECTROGENERAREAELECTROGENERAREA FILMELORFILMELOR PERMEABILEPERMEABILE DEDE POLIPIROLPOLIPIROL--BIOTINILATBIOTINILAT

................................................................................................................................................... 198.1. Introducere...................................................................................................................... 198.5. Prepararea imunosensorului............................................................................................ 208.7. Rezultate şi discuţii.......................................................................................................... 20

8.7.1. Caracterizarea electrochimică a filmului de copolimer format din poli(pirol-biotină) şi poli(pirol-lactobionamidă).................................................................................................. 208.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului pentru anticorpul-CT.....................................21

8.8 Concluzii.......................................................................................................................... 229. C9. COMPARAREAOMPARAREA AA TREITREI CONFIGURAŢIICONFIGURAŢII DEDE IMUNOSENSORIIMUNOSENSORI ENZIMATICIENZIMATICI PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA ANTICORPULUIANTICORPULUI ANTIANTI--TOXINATOXINA HOLEREIHOLEREI......................................................................................... 22

9.1. Introducere...................................................................................................................... 229.4. Prepararea imunosensorilor amperometrici....................................................................239.5. Tranducerea amperometrică a imunoreacţiei..................................................................239.6. Rezultate şi discuţii.......................................................................................................... 23

9.6.1. Răspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind imunosensorul-HRP............249.6.2. Performanţele analitice ale imunosensorilor-HRP, Gox-B, şi PPO-B........................249.6.3. Răspunsul de curent amperometric la anti-CT folosind Gox-B şi PPO-B ca markeri enzimatici în construcţia de imunosensori...........................................................................25

9.7. Concluzii......................................................................................................................... 2510. Î10. ÎMBUNATATIRIMBUNATATIRI ADUSEADUSE ÎNÎN REŢINEREAREŢINEREA ENZIMELORENZIMELOR DEDE FILMULFILMUL DEDE POLIPOLI((PIROLPIROL--ALGINATALGINAT) ) ÎNÎN ELABORAREAELABORAREA BIOSENSORILORBIOSENSORILOR..................................................................................................... 26

10.1. Introducere.................................................................................................................... 2610.4. Rezultate şi discuţii........................................................................................................ 26

10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat şi polipirol-alginat pentru testele electrochimice2610.4.2. Studii de permeabilitate..........................................................................................2710.4.4. Biosensori amperometrici bazaţi pe filmele de alginat şi polipirol-alginat...............28

10.5. Concluzii........................................................................................................................ 2811. B11. BIOSENSORIIOSENSORI AMPEROMETRICIAMPEROMETRICI BAZAŢIBAZAŢI PEPE GELURIGELURI DEDE ALGINATALGINAT ŞIŞI POLIPIROLPOLIPIROL--ALGINATALGINAT CONŢINÂNDCONŢINÂND CELULECELULE ALGALEALGALE DEDE CCHLORELLAHLORELLA VULGARISVULGARIS.............................................................28

11.1. Introducere.................................................................................................................... 2811.5. Prepararea biosensorului algal.....................................................................................2911.7. Rezultate şi discuţii........................................................................................................ 29

11.7.1. Compararea electrochimicǎ a stabilitǎţii gelurilor de alginat şi poli-pirol alginat ce conţin celule algale............................................................................................................. 2911.7.3. Performanţele analitice ale biosensorilor celule algale-alginat şi celule algale-pilipirol-alginat................................................................................................................... 30

11.7. Concluzii........................................................................................................................ 31

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA................................................................................................... 33

* Numerotarea tabelelor, figurilor si cea a indicatiilor bibliografice este cea din teza de doctorat

INTRODUCERE

Bacteriile, virusurile şi alte micro-

organisme sunt larg rǎspandite în naturǎ şi

mediul înconjurǎtor. Bacteriile patogene se

gǎsesc în pǎmânt, în ape, în tractul intestinal al

animalelor sau în apele contaminate cu deşeuri

fecale. O persoanǎ poartǎ în medie mai mult de

150 de tipuri de bacterii care pot exista atât în

interiorul cât şi la exteriorul corpului uman.

Majoritatea microorganismelor desfǎşoarǎ

activitǎţi esenţiale în naturǎ, fiind în numǎr mare

benefice dezvoltǎrii plantelor şi animalelor.

Depistarea rapidǎ şi specificǎ a micro-

organismelor (bacterii, virusuri) este astfel

esenţialǎ în diagnosticarea, tratarea şi prevenirea

eficientǎ a unei infecţii umane. În acestǎ direcţie,

metodele de laborator convenţionale deşi sunt

eficiente necesitǎ câteva ore pânǎ la obţinerea

rezultatelor şi un personal calificat în

microbiologie.

În mod curent pentru identificarea

microoganismelor sunt folosite testele imuno-

logice ca imunofluorescenţa, aglutinarea pe placǎ

şi testele enzimatice ELISA ce au la baza

monitorizarea reacţiiei anticorp-antigen [65].

Aceste teste prezintǎ o sensibilitate şi o

specificitate moderatǎ, necesitând câteva ore de

prepare şi cel puţin 106 microorganisme pentru

identificare. Dacǎ acest numǎr de microoganisme

nu este prezent în proba de analizat, trebuie mai

întâi ca microoganismele sǎ fie cultivate într-un

mediu de agar sau întru-un mediu bogat în

nutrienţi pentru cel puţin 2 sau 3 zile pentru a

atinge nivelul necesar dozajului imunologic.

Alte technici relativ rapide (câteva ore)

folosite în laboratorul medical pentru identi-

ficarea microorganismelor, sunt technicile bazate

pe utilizarea probelor de acizi nucleici (ADN sau

ARN), care recunosc specific probele

complemantare de acizi nucleici, precum şi

technica de amplificare în lanţ a acizilor nucleici

– PCR- bazatǎ pe o amplificare rapidǎ a ADN-

ului sau ARN-ului microbial pentru identificare.

Deşi PCR-ul este foarte specific, metoda prezintǎ

mai multe dezavantaje: prezenţa unui person

calificat, un mediu de lucru foarte curat,

necesitatea izolǎrii si caracterizǎrii genelor unice

- 4 -

ale microoganismului analizat, iar uneori etape

suplimentare de lucru pentru eliminarea

substanţelor inhibitorii.

Marea parte a inconvenienţelor întâm-

pinate în realizarea metodelor clasice de

identificare a microorganimelor sunt eliminate

prin introducerea biosensorilor. Astfel, în ultimii

ani, se observǎ un interes deosebit acordat

dezvoltarii technologiei biosensorilor ce este

bazat pe cerinţa din ce in ce mai ridicatǎ în

detectarea rapidǎ şi specificǎ într-un timp scurt a

unui numǎr sporit de analiţi, vitali sǎnǎtǎţii

omului. Prin introducerea biosensorilor în

diagnosticarea patogenilor microbieni şi a

toxinelor biologice se îmbunǎtǎţeşte considerabil

sensibilitatea şi selectivitatea testelor biochimice.

Ca urmare, biosensorii intervin în diagnosticarea

clinicǎ (de exemplu determinarea glucozei din

sânge), în controlul alimentaţiei publice, în

bioprocesele de control, şi în testarea calitǎţii

mediului.

Lucrarea de doctorat prezintǎ construirea

reuşitǎ a mai multor tipuri de biosensori bazaţi pe

utilizarea de filme variate de polipirol ce

faciliteazǎ capturarea biomoleculelor şi permit

dozarea specificǎ şi reproducilǎ a enzimelor,

viruşilor şi bacteriilor cu ajutorul metodelor

electrochimice (amperometrie, voltametrie). Ca

şi construcţie, lucrarea este structuratǎ în douǎ

pǎrţi principale care se referǎ la date din literaturǎ

-PARTEA TEORETICĂ- primele douǎ capitole

şi contribuţii originale – PARTEA

EXPERIMENTALĂ – prezentate pe parcursul a

9 capitole.

În primul capitol sunt tratate aspecte

generale legate de structura virusurilor,

bacteriilor şi bacteriophagilor cu descrierea în

particular a virusului Nile West şi a bacteriei

Vibrio cholera ce sunt studiaţi (identificaţi

electrochimic) în teza de doctorat precum şi

metodele fizico-chimice şi enzimatice de

identificare a acestora curent folosite în

laboratoarele de analize medicale.

În capitolulul 2 se prezintǎ aspectele

generale privind construirea biosensorilor

(imuno-sensori şi sensori ADN) bazaţi pe

utilizarea de electrozi modificaţi cu diferite filme

polimerice bazate pe derivaţi ai pirolului. De

asemenea se trateazǎ succint biochimia generalǎ

a anticorpilor, acizilor nucleici şi a markerilor

enzimatici ce ajutǎ la întelegerea principiului de

funcţionare al biosensorilor fabricaţi în lucrarea

de doctorat.

În capitolul 3 se descrie construirea unui

biosensor amperometric folosit în determinarea

de concentraţii scǎzute de proteaze (tripsinǎ). La

început este prezentat principiul de construcţie al

sensorului enzimatic, urmatǎ de discutarea

evoluţiei amperometrice în timp, ca urmare a

acţiunii tripsinei asupra unui strat uscat de

gelatinǎ. Biosensorul are la bazǎ digestia unui

strat uscat de gelatinǎ depozitat la suprafaţa unui

electrod de platinǎ.

În capitolul 4 este prezentatǎ elaborarea

unui biosensor amperometric folosit în

determinarea fragmetelor scurte “prezintetizate”

de ADN din virusul Nile West. Biosensorul este

bazat pe cuplarea covalentǎ a unei probe-ADN-

aminate de un film de polipirol electrogenerat la

suprafaţa unui electrod de platinǎ. Prin cuplarea

ulterioarǎ cu ADN-ul target se realizeazǎ

procesul de hibridizare monitorizat prin

intermediul unei probe-ADN biotinilate via

interacţiei cu avidinǎ.

- 5 -

Capitol 5 descrie un concept original de

sensor-ADN, bazat pe identificarea unui ADN

derivat din virusul Nile West prin intermediul

unui compus “intercalant” grefat covalent de un

film de polipirol ce permite ulterior integrarea sa

specificǎ în duplexul ADN dupǎ cum aratǎ

experienţele de voltametrie ciclicǎ şi

amperometrie.

În capitolul 6 se descrie construirea unui

imunosensor amperometric pentru determinarea

anticorpilor IgG specifici pentru virusul Nile

West prin intermediul bacteriophagilor(antigene)

- ce poartǎ un epitop specific pentru virus-

fotoimobilizati într-un film copolimeric constituit

din unitǎţi de pirol-benzofenonǎ şi pirol-

rutenium. Prezenţa phagilor grefaţi precum şi

influenţa unui raport optim între cei doi

monomeri utilizaţi este confirmatǎ prin studii de

voltametrie ciclicǎ.

În capitolul 7 se prezintǎ fabricarea unui

immunosensor amperometric pentru

determinarea anticorpilor IgG specifici virusul

Nile West prin intermediul bacteriphagilor

incapsulaţi într-un film de polipirol amfifilic.

Optimizarea sistemului de dozare amperometricǎ

(cantitatea de phagi depozitatǎ, modul de electro-

polimerizare) este realizatǎ prin voltametria

ciclicǎ.

În capitolul 8 se descrie modul de

fabricare şi de funcţionare a unui imunosensor

amperometric original pentru detectarea

anticorpilor de holerǎ având la bazǎ utilizarea

unui copolimer de polipirol-biotinǎ şi polipirol-

lactobionamidǎ pentru imobilizarea antigenelor

holerei biotinalate prin intermediul interacţiei cu

unitǎţile de avidinǎ şi în combinaţie cu un marker

enzimatic ca peroxidaza. Capitolul prezintǎ de

asemenea studii de estimare a permeabilitǎţii

filmului copolimeric biotinilat care este direct

corelatǎ cu posibilitatea de detecţie a

imunoreacţiei prin amperometrie.

În capitolul 9 se comparǎ performanţele

analitice obţinute pentru trei configuraţii de

imunosensori amperometrici ce utilizeazǎ gluco-

oxidaza, tirozinaza şi peroxidaza drept markeri

enzimatici pentru detectarea amperometricǎ a

anticopilor de holera. În prima parte a studiului

se prezintǎ modul de prepare şi principiul de

funcţionare al celor trei imunosensori iar în

partea a doua se prezintǎ în detaliu performanţele

fiecǎrui biosensor, unde sistemul ce utilizeazǎ

peroxidaza se remǎrca ca fiind cel mai sensibil.

În capitolul 10 este prezentatǎ sinteza

unui nou derivat de pirol, monomerul de pirol-

alginat care în urma procesului de

electropolimerizarea a condus la formarea unui

matrix polipirol-gel, ce prezintǎ un grad ridicat

de reţinere a enzimelor, cu sporirea stabilitǎţii la

efectul distructiv al anionilor de fosfat ceea ce nu

este posibil cu gelul de alginat standard. Prezenţa

lanţurilor electropolimerizate a fost clar ilustratǎ

prin scǎderea permeabilitǎţii comparativ cu gelul

natural de alginat în prezenţa speciei permeante -

hidrochinona. În partea a doua a studiului au fost

analizate performanţele analitice ale filmelor de

alginat modificat şi nemodificat cu grupǎri

pirolice conţinând molecule de gluco-oxidaza

pentru determinarea glucozei.

În capitolul final (11) sunt raportate

fabricarea reuşitǎ şi performanţele analitice ale

biosensorilor bazaţi pe incapsularea celulelor

algale de Chlorella vulgaris în gelul de alginat

natural şi într-un matrix nou sintetizat de pirol-

alginat. Cele douǎ configuraţii de biosensori sunt

- 6 -

comparate în ceea ce priveşte curentul

amperometric obţinut în prezenţa substratului de

p-nitrofenil fosfat pentru dozarea activitǎţii

fosfatazei alcaline algale. Stabilitatea superioarǎ

a gelului de polipirol-alginat este evidenţiatǎ în

comparaţie cu cea caracteristicǎ alginatului

natural ceea ce recomandǎ gelul de polipirol-

alginat ca un suport netoxic şi eficient pentru

construirea de biosensori.

2. Aspecte generale în construirea

biosensorilor

Biosensorii sunt instrumente analitice ce

integrează o componentă biologică (receptorul

biochimic) de o suprafaţă solidă (transducer) ce

facilitează intercaţiile biospecifice reversibile cu

analitul şi converteşte semnalul biologic într-un

semnal electric măsurabil. Componenta biologică

este reprezentată fie de enzime, receptori, celule,

ţesuturi, organele, peptide, anticorpi, acizi

nucleici etc., asigurând recunoaşterea moleculară

(Figura 2.1). Biosensorii ce utilizează anticorpii

sau fragmente de anticorpi drept material

biologic sunt cunoscuţi sub numele de

imunosensori. Comparativ cu metodele analitice

convenţionale, biosensorii sunt caracterizaţi drept

structuri intergrate pentru diverşi componenţi.

Biosensorii combină înalta specificitate analitică

cu procesarea electronică modernă făcând

posibilă obţinerea unei sensibilităţii remarcabile.

Proba

Analit

Semnal(curent, luminǎ, frecvenţǎ)

Proba

Analit

Semnal(curent, luminǎ, frecvenţǎ)

Proba

Analit

Semnal(curent, luminǎ, frecvenţǎ)

Figura 2.1. Schema generală a unui biosensor.

De asemenea, biosensorii ADN bazaţi pe

recunoaşterea acizilor nucleici, cunosc o

dezvoltare rapidă datorită simplicităţii şi

costurilor reduse necesare pentru testarea bolilor

infecţioase şi genetice. Spre deosebire de enzime

sau anticorpi, straturile de recunoaştere a acidului

nucleic pot fii sintetizate şi regenerate pentru mai

multe utilizări.

Biosensorii sunt utilizaţi intensiv ca

intrumente de diagnosticare clinică [48],

predominant în aşa numitul point-of care testing.

Astăzi, biosensorul cu cel mai ridicat succes

comercial in vitro este biosensorul de glucoză

sub formă de dispozitiv portabile ce au

posibilitatea de schimbare a cartrig-ului de

reactivi.

REZULTATE ORIGINALE

3. S3. SENSORENSOR AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU

DETECTAREADETECTAREA PROTEAZELORPROTEAZELOR

În acest capitol se prezentǎ o metodǎ

originalǎ de cuantificare a tripsinei în domeniul

picomolar, bazatǎ pe elaborarea unui biosensor

ce are la bazǎ detecţia amperometricǎ a

curentului înregistrat de un electrod de platinǎ

- 7 -

modificat cu molecule de gluco-oxidaza

incapsulate iîntr-un film de poli(pirol-

alchilamonium) (Figura 3.1.) şi ulterior acoperit

cu un strat de gelatinǎ ce este supus digestiei

proteolitice.

Figura 3.1. Structura monomerului de pirol-

alchilamonium.

3.5. Rezultate şi discuţii

3.5.1. Caracterizarea electrochimicǎ a

electrodului modificat cu poly(pirol-

alchilamonium)-Gox.

Deoarece Gox catalizează oxidarea

aerobică a glucozei cu producerea concomitentă a

H2O2, au fost investigate performaţele analitice

ale electrodului enzimatic pentru determinarea

glucozei. Detecţia amperometrică a glucozei a

fost realizată în soluţie de tampon fosfat salin

(0.1 M PBS, pH = 7) prin potenţiostarea

electrozilor modificaţi la 0.6 V pentru a facilita

oxidarea enzimatică a H2O2 generat la suprafaţa

electrodului de platină. Curba de calibrare

obţinută a fost liniară cu variaţiile concentraţiei

de glucoză, iar nivelul de saturaţie în glucoza -

platoul- se atinge la concentraţia de 22 mM.

Sensibilitatea biosensorului (definită ca partea

liniară iniţiala din curba de calibrare) şi

densitatea maximă a curentului la saturaţie au

fost de 23 mA x M-1 x cm-2, respectiv de 102 mA

x cm-2. Pentru a cuantifica efectul gelatinei asupra

performaţelor analitice ale biosensorului, a fost

investigat răspunsul amperometric al sensorului

la injecţia a 2 mM glucoză. Aceată concentraţie

de glucoză a fost aleasă ca făcând parte din

reginea lineară a curbei de calibrare, iar răspunsul

biosensorului a fost direct proporţional cu

concentraţia substratului [54].

Cum s-a presupus, formarea stratului de

gelatină crează împiedicări sterice puternice

îngreunând difuzia glucozei către stratul de

polimer-Gox şi drept urmare se obţin un curent

diminuat de 5% din valoarea sa iniţială (Figura

3.3b), cazul unui electrod nemodificat cu gelatină

(Figura 3.3a). Astfel, dozarea activităţii

proteolitice a fost efectuată prin intermediul

creşterii curentului amperometric datorită

degradarii stratului de gelatină în urma digestiei

proteolitice.

Figura 3.3. Evoluţia răspunsului biosensorului la injecţia glucozei (2mM) ca urmare a degradării stratului gelatinic de către tripsină (300 g/ml) pe o perioadă determinată de timp. (a) Înainte modificării cu gelatină; (b) după gelatinare; şi la diferite intervale de timp de la imersarea electrodului gelatinat în soluţii de tripsină: (c) 40 s; (d) 60 s; (e) 80 s; (f) 230 s; (g) 5 min; (h) 10 min; (j) 30 min. Biosensorul a fost potenţiostat la 0.6 V în soluţia 0.1M PBS (pH 7) supusă agiţiei magnetice.

3.5.3. Performanţele analitice ale

biosensorului pentru determinarea tripsinei

Pentru ilustrarea sensibilităţii crescute a

biosensorilor de gelatină-Gox pentru digestia

proteolitică (triptică), s-a examinat efectul

diferitelor concentraţii de tripsină (0,001 până la

- 8 -

300 µg/ml) preparate în 0.1 M PBS asupra

sensibilităţii biosensorului. Figura 3.4. prezintă

creşterea dramatică a curentului amperometric în

momentul injectării a 2 mM glucoză pentru

concentraţii cuprinse între 0.1 până la 300 µg/ml.

Se observă modificări de curent minore pentru

concentraţii cuprinse între 1 şi 100 ng, ceea ce

sugerează că prezenta metodă nu poate fii

utilizată pentru determinarea de concentraţii de

tripsină mai scăzute de 1ng/ml tripsină.

Figure 3.4. Creşterea intensităţii curentului amperometric pentru sensorii de gelatina-Gox în prezenţa glucozei (2mM) pentru diferite concentraţii de tripsină după 1 minut de digestie enzimatică. Creşterea este raportată sub forma de raport a curentului obţinut de biosensor şi cel obţinut iniţial în absenţa gelatinei.

Dozarea tripsinei a fost investigată prin

incubarea electrozilor gelatinaţi 10 minute în

soluţia de tripsină. Pentru fiecare concentraţie de

tripsină au fost preparaţi trei biosensori

individuali gelatină-Gox iar curentul

amperometric medie a fost înregistrat. S-a

observat o creştere liniară a curentului cu

logaritmul concentraţiilor de tripsină în domeniul

de 1 până la 250 ng/ml (Figura 3.6).

Figura 3.6. Curba de calibrare a tripsinei ilustrează creşterea curentului biosensorilor de gelatina-Gox în momentul injectării a 2 mM glucoza pentru diferite concentraţii de tripsină şi după un timp de degradare a gelatinei de 10 minute. Condiţiile experimentale au fost identice cu cele din Figura 3.4.

Limita de detecţie de 1 ng/ml sau 42 pM

este remarcabilă, fiind mult mai superioară

comparativ cu alţi biosensori 25 nM şi 40 ng/ml

[117,118]. În plus, aceşti biosensori prezintă un

timp de răspuns de 20 şi 60 minute, în timp ce

electrozii de gelatină-Gox răspund rapid, după 1

minut pentru 300 µg/ml tripsină sau în 10 minute

pentru 1 ng/ml tripsină.

3. 6. Concluzii

În acest capitol se prezintă o metodă

amperometrică originală şi cu potenţial de

aplicabilitate în domeniul medical ca urmare a

posibilităţii de dozare rapide (10 minute) a unor

concentraţii foarte scăzute de tripsină de până la

1ng/ml. Acestă metodă foloseşte în prima etapă

suprimarea răspunsului biosensorului de către un

strat uscat de gelatină ce acoperă un electrod de

platină modificat cu un film de polipirol-alchil

amonium conţinând molecule de gluco-oxidaza

incapsulate în reţeaua polimerică, iar în etapa

secundară se monitorizează evoluţia curentului

- 9 -

amperometric catalitic apărut în prezenţa

glucozei după o digestie triptică progresivă a

stratului de gelatină. Digestia proteolitică a

stratului de gelatină este foarte rapidă în prezenţa

unei concentraţii de 300 µg/ml tripsina,

conducând la o creştere continuuă a curentului

anodic timp de un minut de tratament cu

tripsină. După acest timp, se observă un efect

toxic al tripsinei asupra moleculelor de gluco-

oxidaza ce induce o scăderea progresivă a

curentului. Acest efect de toxicitate este datorat

tripsinei ce atacă situsurilor de arginină şi lizină

prezente în Gox. Ca urmare, timpul de dozaj

foarte rapid al tripsinei (1 min), precum şi

simplicitatea cons-truirii biosensorului enzimatic

face ca acest tip de dozare enzimatică să vină în

ajutorul monitorizării stării de sănătate a

pacienţilor suspecţi de dereglări în nivelul

tripsinei.

4. D4. DETECTAREAETECTAREA AMPEROMETRICĂAMPEROMETRICĂ AA CCADN-ADN-

ULUIULUI DERIVATDERIVAT DINDIN VIRUSULVIRUSUL NNILEILE W WESTEST

FOLOSINDFOLOSIND ELECTROZIELECTROZI MODIFICAŢIMODIFICAŢI CUCU FILMULFILMUL

DEDE POLIPIROLPOLIPIROL

4.1. Introducere

În acest capitol prezentă o noua strategie

de fabricare a sensorilor-ADN bazată pe grefarea

chimică a oligonucleotidelor pornind de la

simpla elaborare a filmului de poli(pirol) N-

substituit de către grupele de hidroxi-sucinimidă

(NHS). Secvenţa cADN a fost sintetizată dintr-o

secvenţa ARN a virusului Nile West (WNV) (de

provenienţă din Israel) [86]. Detectarea ampero-

metrică a fragmentelor scurte de cADN WNV a

fost investigată după producerea procesului de

hibridizare, prin intermediul unui marker

enzimatic gluco-oxidaza.

4.2.1. Oligonucleodele WNV

Oligonucleotidele WNV au fost obţinute

de la Integrated DNA Technologies (IA).

Probe-WNV-DNA (WNVP-21 mer): Amino +

12/5'-CTTTGGTGGAGAGATCGCTGA-3' (-)

Target-WNV-DNA (WNVT-36 mer):

5'-GCTATTTGGCTACCGTCAGCATCTCTCCACCAAAG-3' (+)

WNV-DNA-biotin (WNVB–15 mer):

5'-CGGTAGCCAAATAGC/Biotin/-3'(-)

Non-complementary target WNV-DNA (NCT-

37 mer):

5'-AGCATATTGACGCTGGGAAAGACCAGAGATCCTGCTG-3'

(+)

4.4. Prepararea sensorului ADN

Etapele urmate în elababorarea

sensorului cADN WNV sunt ilustrate în Figura

4.2:

Figura 4.2. Fabricarea sensorului cADN WNV. 1. Filmul de poli(pirol-NHS); 2. Cuplarea probei ADN aminate; 3. Hibridizarea cADN WNV - ţintă; 4. Hibridizarea cu lanţul oligonucleotic biotinilat; 5. Cuplarea gluco-oxidazei cu avidină şi detectarea semnalului.

4.5. Rezultate şi discuţii

4.5.1. Elababorarea electrochimică şi

caraterizarea filmului de poli(pirol-NHS).

Comportamentul electrochimic al

monomerului de pirol-NHS (2 mM) a fost

- 10 -

investigat în CH3CN + 0.1 M LiClO4. Prin

scanarea oxidativă, monomerul prezintă un pic

ireversibil la 1.08 V (faţă Ag/10 mM Ag+

electrod de referinţă) ceea ce corespunde oxidării

grupării pirol în radicali cationici (Figura 4.3A).

Electropolimerizarea monomerului de pirol-NHS

a fost realizată prin repetarea ciclării potenţialului

pe intervalul 0 – 0.95V. Aparenţa şi continuua

cresşere a picului reversil la 0.48V indică clar

formarea filmului polimeric la suprafaţa

electrodului (Figura 4.3B). Electrodul modificat

a fost transferat în soluţia de CH3CN + 0.1 M

LiClO4 fără monomer de pirol-NHS. După cum

s-a presupus, voltamograma ciclică a acestui

electrod prezintă un pic de potenţial de oxidare la

E1/2 = 0.58 V reflectând bine cunoscuta

electroactivitate a scheletului polipirolic (Figura

4.3C).

Figura 4.3. Voltamograme ciclice ale filmului de pirol-NHS (2 mM) la suprafaţa electrodului de platină (diametru 5 mm) (A) înainte şi (B) în timpul electropolimerizării prin repetarea potentţalului de scanare în CH3CN + 0.1 M LiClO4, (C) după tranferul în CH3CN + 0.1 M LiClO4.; viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.

4.5.3. Curba de calibrare amperomtrică

pentru determinarea concentraţiilor de cADN

WNV.

În prezenţa oxigenului, Gox catalizează

oxidarea glucozei cu producerea concomitentă a

H2O2 , care poate fii detectată şi cuantificată prin

intermediul oxidării sale electrochimice.

Figura 4.5. prezintă răspuns de curent

amperometric al sensorului ADN pentru două

concentraţii de glucoză (20 mM şi 140 mM) în

funcţie de concentraţia de WNVT, indicând o

limită de detecţie extrem de sensibilă şi anume

de 1 fg ml.-1 Ambele curbe de calibrare cresc cu

creşterea concentraţiei de WNVT obţinându-se

un pseusoplatou peste 500 ng ml.-1

- 11 -

Figura 4.5. Răspunsul de curent amperometric al sensorului cADN la injectarea glucozei (a) 140 mM, (b) 20 mM în funcţie de concentraţia de WNVT. Potenţialul aplicat: 0.6 V în soluţia agitată de 0.1 M PBS (pH = 7).

4.6. Concluzii

În acest capitol este prezentatǎ

electrogenerare filmului de polipirol-NHS în

combinaţie cu procesul de supraoxidare

electrochimicǎ în vederea obţinerii unui polimer

permeabil pentru grefarea de oligonucleotide

reagentless. Acestǎ legaturǎ chimicǎ a probei

cADN WNV de filmul polimeric conduce la

fabricarea unui sensor cADN eficient prin

utilizarea unui marker enzimatic ce identificǎ

duplexul ADN format la suprafaţa electrodului

de platinǎ. Se obţine o limită de detecţie extrem

de sensibilǎ (1 fg ml-1) de cADN WNV ce este

asociatǎ cu o stabilitatea ridicatǎ a rǎspunsului

amperometric.

5. S5. SENSORENSOR ELECTROENZIMATICELECTROENZIMATIC POLIPIROLPOLIPIROL--INTERCALATORINTERCALATOR PENTRUPENTRU DETECTAREADETECTAREA CCADNADN

DERIVATDERIVAT DINDIN VIRUSULVIRUSUL NNILEILE W WESTEST

5.1. Introducere

Luând în considerare procesul de

intercalare, în acest capitol se propune un

concept original de identificare a secvenţei ADN

derivate din virusul Nile West bazat pe

adǎugarea oligonucleotidie complementare într-o

soluţie apoasǎ de ssDNA şi urmatǎ de

identificare (fishing) electrochimicǎ a duplexului

format la suprafaţa sensorului. Electrodul este în

prealabil modificat cu un intercalator planar

sintetic, un derivat redox acridinic (RAD) [145]

grefat chimic la suprafaţa electrodului via unui

film electrogenerat de polipirol N-substituit de

gruparea N-hidroxidsuccinimida (Figura 5.1).

RAD-ul grefat va fii ulterior folosit în procesul

de intercalare în dsADN la suprafaţa electrodului.

Figura 5.1. Structura chimicǎ a derivatului redox de acridona (RAD) (a) şi a celui de pirol N-substituit de grupul N-hydroxysuccinimida 1 (b).

Elaborarea unui sensor genomic WNV a

fost astfel selectat ca model pentru investigarea

conceptului de WNV-sensor. Pentru aceasta,

determinarea procesului de hibridizare dintre

douǎ oligonucleotide derivate dintr-un fragment

provenind din partea proteicǎ a WNV regiunea

codatǎ 1145-1180 a fost realizatǎ prin capturarea

(fishing) duplexului ADN. Ulterior, carac-

teristicele analitice ale sensorului WNV cDNA

au fost investigate prin mǎsuratori amperometrice

ce folosesc unui marker enzimatic [87].

5. 4. Rezultate şi discuţii

Scopul electrozilor modificaţi a fost acela

de a detecta duplexul-ADN după marcarea cu

molecule de Gox, prin oxidare electrochimicǎ la

suprafaţa electrodului de platinǎ cu producerea de

H2O2 de cǎtre Gox. Oricum, caracterul hidrofobic

a filmului poli1 îngreuneazǎ transformarea H2O2

- 12 -

în apǎ, influenând astfel detectarea

amperometricǎ. Pentru creşterea permebilitǎţii,

filmul polimeric [150] a fost superoxidat prin

ciclarea potenţialului între 0.0V şi 1.3V (Figura

5.2B).

Immobilizarea covalentǎ a RAD a fost

efectuatǎ la temperatura camerei, prin depositarea

unei soluţii apoase de RAD pe electrodul

polipirolic modificat (20 µl, 140 µg/ml) şi lǎsat

la incubaţie peste noapte în condiţii de mediu

umid.

Voltamograma ciclicǎ a electrodului

RAD-modificat efectuatǎ în tamponul fosfat

deaerat prezintǎ în regiunea negativǎ un pic

reversibil la – 0.35 V, regiune în care filmul

poli1 nu este electroactiv (Figura 5.2C). Acest

semnal redox este în bunǎ acordanţǎ cu valoarea

potenţialului (- 0.25 V) obtinutǎ pentru reducerea

a RAD-ului în soluţie. În plus, intensitate de

curent a picului reversibil variazǎ liniar cu viteza

de scanare, confirmând astfel grefarea chimicǎ a

RAD.

Acoperirea aparentǎ a electrodului cu

RAD (Г = 2.25 x 10-9 mol x cm-2) a fost estimatǎ

prin integrarea sarcinii caracteristicǎ picului.

Luând în considerare cǎ din punct de vedere

teoretic, acoperirea maximǎ a suprafeţei

electrodului cu un strat compact de RAD

corespunde la 2.37 x 10-10 mol x cm-2, se

confirmǎ clar cǎ moleculele de intercalator au

fost grefate atât la interfaţa polimer-solutţe cât şi

în interiorul structurii polipirolice.

Figura 5.2. Voltamogramele ciclice pentru electrodul modificat cu poly(pirol) (diametrul de 5mm): (A) electroactivitatea polipirolului (B) supraoxidarea polipirolulu (a) primul scan, (b) patru scanari în CH3CN + 0.1M LiClO4 ; viteza de scanare 0.1 Vs-1 ; (C) dupǎ imobilizarea chimicǎ a RAD în tampon PBS deaerat, viteza de scanare 20 (a), 50 (b), and 100 (c) mVs-1. (D) Voltamograme ciclice ale electrodului poly-1-RAD (a) înainte şi (b) dupǎ incubarea cu WNV dsDNA (10 ng/mL) în soluţie tampon PBS; viteza de scanare 0.1 Vs-1.

Rǎspunsul curentului obţinut de

electrozii modificaţi (poli1-RAD-dsDNA) la

injecţia glucozei (20 mM) a fost investigat în

tamponul PBS (Figura 5.3). Curentul maxim a

fost obţinut într-un timp foarte scurt (30-40

secunde). Intensitatea curentului obţinut a fost

proporţional cu concentraţia ADNului-ţintǎ, iar

limita de detecţie a fost de 1 mg/ml (90 fM).

Figura 5.3. Rǎspunsul curentului amprometric pentru sensorii de poli 1 – RAD dsADN în funcţie de concentraţia de ADN analizatǎ (target). Insertul reprezintǎ curentul oţtinut de sensorul ADN la injecţia glucozei (20mM) pentru 1 ng/mL de ADN-target. E = 0.6 V/Ag/AgCl.

5.5. Concluzii

În acest capitol s-a prezentat realizarea

unui nou tip de sensor genomic amperometric

- 13 -

foarte sensibil pentru detectarea unui singur lanţ

oligonucleotidic (ssADN) derivat dintr-o

secvenţǎ din virusul virusul virusul Nile West

(WNV). Sensorul este bazat pe folosirea unui

intercalator-ADN (un derivat redox acridinic)

grefat chimic la suprafaţa unui electrod de platinǎ

modificat cu un film electropolimerizat de

polipirol N-substituit de cǎtre grupǎrile N-

hidroxisuccinimida (pyrrole-NHS). Intercalatorul

grefat de electrod se inserǎ în duplexul-ADN

format între ssADN – WNV (analitul) şi

oligonucleotida complementarǎ (ssADN) ce este

marcatǎ cu unitǎţi biotinice ceea ce, ulterior

permite ancorarea unui marker enzimatic ca

gluco-oxidaza prin intermediul intercaţiei de

afinitate dintre avidinǎ şi biotinǎ. Dozajul

amperometric simplu a permis obţinerea unei

limite de detecţie foarte sensibil în domeniul de

1pg/ml ssADN-WNV.

6. I6. IMUNOSENSORMUNOSENSOR AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU

DETECTAREADETECTAREA ANTIANTI--NNILEILE WWESTEST VIRUSVIRUS I IggGG

FOLOSINDFOLOSIND UNUN COPOLIMERCOPOLIMER FOTOACTIVFOTOACTIV

6.1. Introducere

Cu scopul de fabricare a unui

imunosensor portabil şi necostisitor pentru

dozarea anticorpilor WNV acest capitol prezintǎ

elaborarea unui transducer amperometric bazat pe

imunoreacţia cu phagii-WNV displayed-epitope

imobilizaţi la suprafaţa electrodului de platinǎ

(bacteriophagii sunt virusuri ce infecteazǎ

bacteriile).

In acest capitol se raporteazǎ elaborarea

reauşitǎ a unui film copolimeric în scopul

utilizǎrii sale în construcţia de imunosensori,

copolimerul având la bazǎ doi monomeri pirolici:

un monomer fotoactivabil pirol-benzofenona

(monomerul 1) şi un monomer cationic

tris(bipiridin-pirol)rutenium complex (monomer

2) (Figura 6.1).

Figura 6. 1. Structura monomerilor 1 şi 2.

Imobilizarea phagilor de WNV-diplayed

epitope de filmele copolimerice fotoactivabile se

realizeazǎ prin iradierea copolimerului ce

favorizeazǎ formarea de legǎturi covalente

multiple între grupele de benzofenonǎ

polimerizate şi phagi. Electrozii modificaţi cu

phagi au fost testaţi amperometric pentru

imunodozarea de anticorpi-WNV.

6.2.3. Modificarea electrozilor de carbon un

film polimeric

Electropolimerizarea monomerilor sau a

amestecului de monomeri (2mM) a fost efectuatǎ

într-o soluţie organicǎ de CH3CN + 0.1 M TBAP

prin controlarea potenţialui de electrolizǎ la +

0.85 V fǎţǎ de electrodulde referinţǎ de Ag/Ag+.

Procesul de electropolimerizare a fost oprit când

densitatea de sarcinǎ anodicǎ a fost de 2.5 mC

cm-2. Electrozii modificaţi au fost apoi transferaţi

într-o soluţie de CH3CN + 0.1 M TBAP fǎrǎ

monomer iar apoi tranferaţi într-o soluţie de

CH3CN conţinând 0.1M LiClO4.

6.2.4. Imobilizarea bacteriophagilor de filmul

de copolimeric

O soluţie apoasǎ de 20 µl a fost

- 14 -

depozitatǎ pe electrodul modificat cu filme

copolimerice şi lasǎtǎ sǎ se evapore. Electrozii

rezultaţi au fost iradiaţi la λ = 355 nm pentru 5

minute. Iradierea electrozilor modificaţi cu phagi

adsorbiţi a fost realizatǎ cu o fibrǎ opticǎ folosind

o lampǎ de mercur (presiunea medie de 500 W)

în conexiune cu lampa de o putere de 68910 Arc

(ambele provenite de la Oriel Instruments).

Filtrele au fost folosite pentru selectarea lungimii

de undǎ de 335 nm şi sǎ blocheze razele IR,

prevenind astfel supraîncǎlzirea fiberei optice şi a

suprafeţei electrodului.

6.4. Rezultate şi discuţii

6.4.3. Construcţia imunosensorului şi detecţia

anticorpilor WNV

Dupǎ adsopţia phagilor de filmele de

poli(1-2) a urmat legarea lor covalentǎ de suport

prin intermediul activǎrii luminii la λ = 355 nm

ceea ce iniţiazǎ polimerizarea grupelor de

benzofenonǎ. Pentru a investiga efectul produs de

aceastǎ reacţie fotochimicǎ, electrozii modificaţi

au fost incubaţi cu diferite concentraţii de

anticorpi-WNV (de la 10 la 106). Apoi, electrozii

au fost incubaţi cu cel de-al doilea anticorp

marcat cu peroxidaza din hrean. Recunoaşterea

anticorpilor-WNV legaţi de phagi este realizatǎ

prin intermediul unui marcǎr enzimatic ca

peroxidaza. Ulterior, toţi imunosensorii-WNV au

fost imersaţi în soluţia de tampon fosfat salinǎ

0.1 M (20 ml, pH 7.2) conţinînd 2 mM

hidrochinonǎ şi potenţiostaţi la 0V. Dupǎ

injectarea peroxidului de hidrogen (2 mM),

semnalul amperometric corespunzînd reducerii

chinonei produse enzimatic a fost înregistrat în

fucţie de diluţia de anticorpii-WNV (Figura 6.5).

Figura 6.5. Principiul funcţionǎrii imunono-sensorului-WNV amperometric.

Se observǎ obţinerea unui semnal

amperometric stabil într-un timp foarte scurt de

30 secunde ilustrînd astfel buna permeabilitate a

filmului copolimeric. Valorile curentului maxim

obţinute pentru diferite diluţii a anticorpii-WNV

au fost folosite pentru realizarea curbei de

calibrare (Figura 6.6).

Figura 6.6. Curba de calibrare pentru anticorpii-WNV obtinutǎ de filmele de poli(1-2) în raport de 1:1 prin intermediul imunodozarii electroenzimatice. Potenţialul aplicat a fost de 0V in PBS 0.1M (20 ml pH = 7.2)

Fiecare punct din curba de calibrare

reprezintǎ media de rǎspuns în curent înregistratǎ

de trei imunosensori diferiţi. Se observǎ o

scǎdere a semnalului amperometric pentru titrul

anticorpilor din intervalul 1:10 la 1:106

constituind astfel o limitǎ de detecţie foarte

sensibilǎ.

- 15 -

6.5. Concluzii

În acest capitol este prezentǎ

electrogenerarea filmelor de polipirol compuse

din grupǎri de benzofenonǎ şi grupǎri de

tris(bpiridin-pirol) rutenium (II) pentru o

imobilizare fotochimicǎ inovatoare a entitaţilor

biologice, în particular a phagilor virusului Nile

West ce-şi prezervǎ proprietǎţile de recunoaştere

molecularǎ în prezenţa anticorpilor specifici.

Pentru dozarea reacţiilor imunologice s-a utilizat

dozajul amperometric ceea ce permite obţinerea

unei limite de detecţie în intervalul de 1:106 ce

reprezintǎ titrul anticorpilor IgG-WNV. Acesta

reflectǎ eficienţa legǎrii covalente fotochimice

dintre phagii şi filmul polipirolic, fǎrǎ a afecta

ulterior imunoreacţiille, precum şi o

permeabilitate bunǎ a filmului copolimeric

datoratǎ complexului de rutenium ce permite

transducerea amperometricǎ a imunoreacţiei.

7. I7. IMUNOSENSORULMUNOSENSORUL AMPEROMETRICAMPEROMETRIC PENTRUPENTRU

DETECTAREADETECTAREA ANTIANTI--NNILEILE W WESTEST VIRUSVIRUS I IggGG

FOLOSINDFOLOSIND INCAPSULAREAINCAPSULAREA PHAGILORPHAGILOR INTRINTR--UNUN

FILMFILM DEDE POLIPIROLPOLIPIROL((ALCHILALCHIL--AMONIUMAMONIUM)

7.1 Introducere

În acest capitol este raportatǎ construcţia

imunosensorilor amperometrici pentru

identificarea rapidǎ a anticorpilor IgG-WNV

folosind filme de poli(pirol-alchilamonium)

pentru reţinerea phagilor-WNV la suprafaţa

electrodului de cǎrbune. Ca urmare au fost

investigate proprietǎţile electrochimice ale

electrozilor modificaţi cu polimer-phagi WNV,

iar performanţele analitice amperometrice ale

imunosensorului cu configuraţie optimizatǎ au

fost determinate. Moleculele de phagi au fost

modificate cu o secvenţa de 15 aminoacizi

proveniţi din anvelopa proteicǎ avirusul virusul

Nile West virusului (WNV) ce au fost folosiţi

drept antigeni în loc de virusul propriu-zis (phagi

identici cu cei din capitolul 6). Avantajul major

al phagilor constǎ în faptul cǎ sunt inofensivi

pentru oameni iar preparea lor nu necesitǎ etape

complicate de execuţie.

7.4. Prepararea imonosensorului-WNV având

la bazǎ phagi incapsulaţi într-un film de

polipirol

Dupǎ imobilizarea phagilor de electrod,

a fost realizatǎ saturarea eventualelor siturilor

non-specifice de adsopţie a proteinelor cu

albumina sericǎ bovinǎ (BSA) sporind astfel

sensibilitatea testului de dozare. Soluţia blocantă

a fost preparatǎ zilnic din soluţie de tampon

fosfat salinǎ (0.1 M PBS, pH = 7.2) conţinînd 5

% (w/v) BSA. Din aceastǎ soluţie s-au depozitat

20 µl pe electrodul modificat cu filmul polimeric

de poli(pirol-alchilamonium) conţinînd particule

phagi şi incubat pentru 1 ora la temperatura

camerei. Apoi, imunosensorii au fost clǎtiţi cu

PBS (pH = 7.2) pentru 5 minute şi incubaţi cu

20 µl soluţie de anti-IgG WNV de concentraţii

diferite (de la 10 la 107). Anticorpii-WNV au fost

diluaţi cu o soluţie de 1 % (w/v) BSA/PBST

(PBS conţinînd 0.05 % (v/v) Tween-20, PBST)

şi pǎstraţi la 4°C. Electrozii rezultaţi au fost

clatiţi pentru 20 de minute cu soluţia de PBST.

Ulterior electrozii au fost incubaţi cu 20 µl de

solutţe de anticorpii-IgG marcaţi cu HRP (102)

pentru 20 de minute urmînd clǎtirea lor pentru 20

de minute cu PBST înainte de efectuarea

mǎsurǎtorilor amperometrice (Figura 7.1).

- 16 -

Figura 7.1. Reprezentarea schematicǎ a principiului de funcţionare a imunosensorului amperometric pentru detecţia anticorpilor-WNV prin intermediul anticorpului-secundar marcat cu HRP ce catalizeazǎ formarea speciilor electroactive de chinonǎ (Q) în prezenţa substratelor: hidrochinonǎ (HQ) si a H2O2.

7.5. Rezultate şi discuţii

7.5.1. Elaborarea electrozilor modificaţi cu polimer si phagi

Comportamentul electrochimic al

filmelor adsorbite de pirol-alchil amonium cu şi

fǎrǎ phagi a fost investigat prin voltametria

ciclicǎ la suprafaţa electrodului de cǎrbune în

mediul apos conţinînd 0.1M LiClO4 drept

electrolit suport. Prin scanǎri repetitive ale

electrodului în intervalul de potenţial 0 – 0.9 V

se observǎ apariţia quasi-reversibilǎ a sistemului

de picuri în jurul a 0.5 V (Figura 7.2). Aceastǎ

evoluţie indicǎ formarea filmului de polipirol la

suprafaţa electrodului de cǎrbune.

Figura 7.2. Voltamogramele ciclice ale filmelor adsorbite de monomer de pirol-alchil amonium (120 nmol) în timpul procesului de polimerizare şi a polimerului obţinut. (A) monomerul singur; (B) monomerul amestecat cu 10 µl monomerul amestecat cu 20 µl phagi; (D) monomerul amestecat cu 30 µl phagi. Electropolimerizarea a fost efectuatǎ timp de 10 minute prin ciclarea potenţialului între 0 şi 0.9V /Ag/AgCl într-o soluţie apoasǎ coţinând 0.1M LiClO4, cu o vitezǎ de scanare de 0.1V s-1.

Prezenţa phagilor imobilizaţi, densitatea

lor şi acesibilitatea pentru imunoreacţia cu

anticorpii-WNV este direct reflectatǎ de

intensitatea curentului obţinut la reducerea

chinonei. Valorile de curent maxim (Imax)

corespunzînd a trei cantitaţi diferite de phagi (10,

20 si 30 µl) imobilizate prin CPE sau RPS sunt

schematizate in Tabelul 7.2.

- 17 -

Tabelul 7. 2. Influenţa diferitelor cantitǎti de phagi T7-Ep 15x2 incapsulaţi în filme polimerice de poli(pirol_alchilamonium) generate fie prin CPE, fie prin RPS asupra rǎspunsului de curent amperometric cînd s-a folosit anticorpi-WNV în stare de saturare (1/10 dilutie)a

phagi T7-Ep15x2 (µl) 10 20 30

Imax (CPE) (nA) 240 140 70

Imax (RPS) (nA) 40 15 10

a) dupǎ marcarea cu anticorpul secundar-HRP în prezenţa H2O2 (0.1mM) şi a 2 mM hidrochinonǎ , iar electrozii sunt potenţiostaţi la 0 V.

7.5.2. Permeabilitatea filmelor de polipirol-

phagi WNV

Figura 7.3. ilustreazǎ voltamograma

RDE obţinutǎ pentru filmul polimer-phagi.

Permeabilitatatea (Pm) este estimatǎ folosind

ecuaţiile descrise anterior de Gough şi Leypoldt

[136-138] (Figura 7.3). Valorile de

permeabilitate ale filmului de poli(pirol-alchil

amonium) şi cele ale polimerului conţinînd phagi

T7-Ep 15x2 (10 μl) sunt similare, 4.2 şi

respectiv 2.5 x 10-2 cm s-1. In plus, aceste valori

de permeabilitate sunt similare cu cele raportate

pentru acelaşi tip de polimer (polipirol-alchil

amonium) cu şi fǎrǎ incapsularea glucoz-oxidazei

(3 si respectiv 5 x 10-2) [167]. Aceste rezultate

ilustreazǎ cum fenomenul de incapsulare a

phagilor într-un film de polipirol pentru o

cantitate micǎ de phagi (10 μl) nu afecteazǎ

permeabilitatea filmului şi prin urmare structura

sa.

Figura 7.3. (A) 10 μl phagi T7 -Ep 15x2 in prezenţa a 2 mM soluţie de hidrochinonǎ dizolvatǎ in 0.1 M PBS (pH = 7.2). Voltamogramele electrodului turnant de carbon (diametru de 5 mm) modificat cu filmul de poli(pirol-amonium): (a) 3000, (b) 2500, (c) 2000, (d) 1500, (e) 1000, si (f) 500 rpm/min. Viteza de scanare a fost de 0.020 V s-1. (B) Graficul Koutecky-Levich pentru (a) un electrod nemodificat, (b) pentru un electrod modificat cu un film polimeric şi (c) pentru un electrod modificat cu un film polimeric conţinând 10μl phagi T7lEp15x2 phage. Soluţia test a fost 2 mM hidrochinonǎ în soluţia de 0.1 M PBS (pH = 7.2).

7.5.3. Performanţele imunosensorului pentru

detectarea anticorpilor-WNV

Pentru a investiga capabilitǎţile analitice

ale electrozilor modificaţi cu polipirol-phagi

pentru dozarea amperometricǎ a anticorpilor-

WNV, electrozii cu phagi au fost incubaţi cu

diferite diluţii de anticorpi-WNV în intervalul de

- 18 -

10 pînǎ la 107. Aceste rǎspunsuri de curent au

fost proporţionale cu concentraţia anticorpilor,

iar limita de detecţie a fost de107 (Figura 7.4).

Figura 7.4. Rǎspunsul de curent amperometric înregistrat pentru imunosensorii-WNV în prezenţa sistemului hidrochinona/H2O2 în funcţie de diluţiile de anticorpi-WNV (1:10 pǎnǎ la 1:107). Potenţialul aplicat este de 0V faţǎ de SCE.

Dozarea amperometricǎ este mult mai

sensibilǎ decât alte technici ca testul colorimetric

ELISA, testul chemiluminescent ELISA sau

imunotestul bazat pe fibre optice [168] ce conduc

la limite de detecţie a titrului de anticorpi de

1:105, 1:5x105, şi respectiv de 1:106.

De menţionat este rapiditatea rǎspunsului

de curent a diferiţilor imunosensori care este

stabil dupǎ numai 5 la 20 secunde ceea ce

ilustreazǎ o bunǎ permeabilitate a filmului de

polimer-phagi.

7.6. Concluzii

În acest capitol a fost demonstratǎ

eficienţa funcţionalizǎrii filmelor de polipirol cu

phagi-WNV cu pǎstrarea proprietǎţilor de

recunoaştere molecularǎ a anticorpilor specifici.

Configuraţia imunosensorului este bazatǎ pe

grefarea fotochimicǎ a phagilor-WNV de un film

electrogenerat la un potenţial de 0.850 V ce

permite detectarea de anticorpi-WNV cu o

sensibilitate extremǎ a titrului de detecţie (1:107).

De asemenea, a fost posibilǎ regenerarea stratului

sensibil de polimer-phagi folosind condiţii acide

cu scopul fabricǎrii de noi WNV-imunosensori.

8. C8. CONSTRUIREAONSTRUIREA IMUNOSENSORILORIMUNOSENSORILOR

AMPEROMETRICIAMPEROMETRICI PENTRUPENTRU DETERMINAREADETERMINAREA

ANTICORPILORANTICORPILOR ANTIANTI--HOLERǍHOLERǍ BAZAŢIBAZAŢI PEPE

ELECTROGENERAREAELECTROGENERAREA FILMELORFILMELOR PERMEABILEPERMEABILE

DEDE POLIPIROLPOLIPIROL--BIOTINILATBIOTINILAT

8.1. Introducere

Luând în considerare problema

permeabilităţii scăzute a filmelor de polimer

biotinilate, în acest capitol se prezintă un nou

protocol de construire de imunosensori

amperometrici bazaţi pe electrogenerarea unui

film original de copolimer biotinilat ce prezintă o

foarte bună permeabilitate, ceea ce permite

tranducerea sa amperometrică [79]. Filmul

copolimeric prezintă grupe de biotină -ce permite

ancorarea anticorpului sau antigenului prin

intermediul interacţiilor de afinitate cu avidina- şi

grupe de lactobionamidă ce imbunatăţesc

caracterul hidrofilic al filmului organic

electrogenerat şi astfel permeabilitatea sa.

Transducerea implică recunoaşterea

anticorpilor capturaţi de către cel de-al doilea

anticorp (anticorp secundar) marcat cu enzima

peroxidază (Figura 8.1). Performanţele

imunosensorului sunt investigate prin detecţia

amperometrică a oxidarii enzimatice a

hidrochinonei în prezenţa peroxidului de

hidrogen.

- 19 -

Figura 8.1. Fabricarea imunosensorului-HRP amperometric bazat pe sistemul electrochimic hidrochinona(HQ)/peroxid de hidrogen (H2O2).

8.5. Prepararea imunosensorului

Etapele urmate în elaborarea

imunosensorului la suprafaţa electrodului de

cărbune vitros au fost: mai întâi, 20 µl soluţie

blocantă a fost depozitată la suprafaţa

electrodului modificat cu filmul copolimeric

biotinilat pentru a preveni acrosarea nespecifică a

avidinei de acest film electrogenerat. După etapa

de blocare a electrodului a urmat construirea

specifică a imunosensorului prin depozitarea a

20 µl de avidina (1 mg/ml) dizolvată în 1 %

(w/v) BSA/PBST şi incubarea timp de 20 minute

cu filmele biotinilate. După clatirea cu PBS,

electrozii rezultaţi au fost incubaţi pentru alte 20

de minute cu 15 µl toxina B a colerei-biotinilată

[0.3 mg/ml dizolvată în 1% (w/v) BSA/PBST].

Apoi electrozii au fost clătiţi cu PBS şi incubaţi

cu 20 µl anticorpul anti-toxina colerei

subunitatea B dezvoltat în iepure la o

concentraţie ce variază în intervalul de 0.05 până

la 500 µg/ml. Timpul de incubaţie a fost de 20 de

minute, după care a urmat clătirea electrodului cu

soluţia de PBS. În final electrozii au fost incubaţi

pentru alte 20 minute cu 20 µl soluţie de

anticorp secundar IgG-anti-holera- marcat cu

HRP în concentraţie de 0.5 mg/ml ce a fost

dizolvat în soluţia 1% (w/v) BSA/PBST. Toţi

electrozii modificaţi (imunosensorii) au fost

spălaţi cu soluţia tampon PBS înainte de

măsurătorile amperometrice.

8.7. Rezultate şi discuţii

8.7.1. Caracterizarea electrochimică a filmului

de copolimer format din poli(pirol-biotină) şi

poli(pirol-lactobionamidă)

Deşi electropolimerizarea monomerului

de pirol-biotină furnizează un film compact şi

activ cu unităţi de biotină, caracterul său oragnic

impiedică umflarea polimerului în mediul apos şi

astfel îngreunează difuzia speciilor electroactive

ca chinona la suprafaţa electrodului [188]. Pentru

a îmbunătaţi detectarea amperometrică a chinonei

au fost introduse prin electrocopolimerizare

grupe hidrofilice de pirol-lactobionamidă în

scheletul polimeric de poli-pirol-biotină) pentru a

contrabalansarea caracterului său hidrofobic

(Figura 8.2).

- 20 -

Figura 8.2. Structura monomerilor de pirol-lactobionamidă (A) şi de pirol-biotină (B).

Figura 8.3. prezintă voltamograme ciclice ale

speciei permeante electroactive -hidrochinonă- la

suprafaţa electrodului modificat fie cu filmul de

polipirol biotinilat, fie cu filmul copolimeric-

biotinilat, filme formate cu aceeaşi sarcină de

electropolimerizare, 1 mC. Prin compararea cu

picul de oxidare a hidrochinonei înregistrat la

suprafaţa electrodului de carbon nemodificat se

observă a scădere uşoară a intensităţii picului de

curent (-14%) ce este asociată cu creşterea

separării picului anodic şi catodic pentru

copolimer, în timp ce pentru filmul de pirol

biotinilat se remarcă o quasidispariţie picului

anodic. Acesta indică clar că homopolimerul

impiedică drastic pătrunderea hidrochinonei, în

timp ce copolimerul apare mult mai permeabil.

Procesul de transfer de masă în filmele

polimerice electrodepozitate la suprafaţa

electrodului a fost investigat prin voltametria de

electrod disc rotitor (RDE) [136-138].

Figura 8.3. Voltamogramele ciclice în prezenţa 1 mM hidrochinonă şi 0.1 M LiClO4 în PBS (pH = 7) pentru (a) un electrod de cărbune nemodificat (diametru de 5 mm), (b) un electrod modificat cu poli(pirol-biotină) şi poli(pirol-lactobionamidă) , (c) un electrod modificat cu polipirol biotină. Viteza de scanare a fost de 100 mV s-1.

Figura 8.4A prezintǎ voltamogramele de

disc-rotitor caractristice filmului copolimeric în

solutţa apoasǎ de hidrochinonǎ (1 mM).

Experienţele de voltametrie RDE au fost

reprezentate sub forma de grafic Koutechy-

Levich unde densitatea de curent limitǎ este

reprezentatǎ în funcţie de pǎtratul rǎdǎcinii

vitezei de rotaţie (Figura 8.4B). Din grafic, se

observǎ un comportament liniar al copolimerului

cu aceeaşi pantǎ ca şi electrodul nemodificat

prezentând o intersecţie pozitivǎ ce permite

extragerea raportului DmK/δ ca fiind de 2.38 x

10-2 cm s-1.

8.7.3. Curba de calibrare a imunosensorului

pentru anticorpul-CT

Pentru a determina sensibilitatea de

dozare a anticorpului-CT, imunosensorii au fost

testaţi cu diferite concentraţii de analit în

- 21 -

domeniul de 0.01 -500 µg/ml. Prin imersarea

imunosensorilor-HRP în soluţia de tampon

conţinând 2 mM hidrochinonǎ, curentul de bazǎ

s-a stabilizat dupǎ 4 minute iar semnalul de

curent a fost înregistrat dupǎ injectarea

peroxidului de hidrogen în celula electrochimicǎ.

Curba de calibrare pentru detectarea

amperometricǎ a anticorpului CT a fost obţinutǎ

dupǎ fiecare concentraţie de anticorp-CT prin

înregistrarea a rǎspunsului de curent caracteristic

electrodului modificat (Figura 8.5).

Figura 8.5. Curba de calibrare a imunosensorului-HRP cu anticorpii-CT in intervalul de 0.05 -500 µg/ml folosind sistemul hidrochinona/H2O2.

8.8 Concluzii

În acest capitol se prezintǎ o nouǎ

strategie de imobilizare a materialului

imunologic de un electrod modificat cu un film

copolimerict pentru dozarea anticorpilor specifici

holerei. Studiul efectuat prezintǎ pentru prima

datǎ coelectropolimerizarea monomerilor de

pirol-biotinǎ şi pirol-lactobionamidǎ ca o

variantǎ de film polimeric eficientǎ pentru

ancorarea biomoleculelor în stare lor biologicǎ

activǎ. Datoritǎ caracterului hidrofilic ridicat,

monomerul de pirol-lactobionamidǎ sporeşte

considerabil permeabilitatea copolimerului

pentru speciile electroactive. Acesta a permis

detectarea amperometricǎ rapidǎ şi foarte

sensibilǎ a anticorpului de holerǎ în combinaţie

cu un indicator enzimatic (peroxidaza).

9. C9. COMPARAREAOMPARAREA AA TREITREI CONFIGURAŢIICONFIGURAŢII DEDE

IMUNOSENSORIIMUNOSENSORI ENZIMATICIENZIMATICI PENTRUPENTRU

DETECTAREADETECTAREA ANTICORPULUIANTICORPULUI ANTIANTI--TOXINATOXINA

HOLEREIHOLEREI

9.1. Introducere

În acest capitol au fost fabricati

imunosensori amperometrici pentru detectarea

anti-toxinei holerice bazaţi pe imobilizarea

materialului imunogenic (subunitatea B a toxinei

holerei biotinilată) la suprafaţa electrodului

biotinilat, folosind interacţiile de afinitate

avidină-biotină [78]. Analitul - anticorpul anti-

toxina holerei- a fost detectat folosind alternativ

trei markeri enzimatici: anticorpul IgG din iepure

marcat cu peroxidaza (HRP), gluco-oxidaza

biotinilata (Gox-B) sau polifenol oxidaza

biotinilata (PPO-B) în combinaţie cu avidina

legata de anticorpii IgG din iepure care a fost

pentru prima data folosită pentru tranducerea

unei imunoreacţii. Pentru a asigura accesibilitatea

speciilor active la suprafaţa electrodului şi

imobilizarea calitativă a probei, au fost elaborate

punţi de avidina-biotina cu un film copolimeric

biotinilat ce a fost obţinut prin electropoli-

merizarea monomerului de pirol-biotina (pentru

interactii de afinitate) si monomerului de pirol-

lactobionamida (pentru îmbunătăţirea permeabili-

tăţii). Prin metoda de electropolimerizare se

asigură formarea unui film controlabil ca

grosime, reproductibil, activ cu unităţi de biotină,

fără defecte, cu stabilitate chimică şi de stocare în

timp [172, 175, 176, 188, 198].

- 22 -

9.4. Prepararea imunosensorilor

amperometrici

Electropolimerizarea copolimerului bioti-

nilat a fost realizată prin controlarea potenţialului

de electroliză la 0.85V în electrolitul de

acetonitril conţinînd amestecul de monomer de

pirol-lactobionamidă (4 mM) şi de monomer de

pirol-biotină (4 mM). Luând în considerare

natura reacţiei electroenzimatice folosite pentru

detectarea anticorpului anti-holeră, electrozii de

platină au fost utilizaţi pentru sistemul enzimatic

bazat pe Gox-B, în timp ce electrozii de cărbune

au fost folosiţi pentru HRP şi PPO-B (Figura

9.1).

Figura 9.1. Schema electrozilor modificaţi cu

subunitatea B a toxinei holerei, biotinilate.

9.5. Tranducerea amperometrică a

imunoreacţiei

Imunosensorii au fost incubaţi timp de

20 de minute cu anticorpul anti-toxina holerei

(anti-CT, 20 µl) secretat în iepure în domuniul de

concentraţii de 0.05 pâăa la 500 µg/ml. Apoi, au

fost investigate diferitele transducţii

electroenzimatice.

Pentru imunosensorul-HRP, anticorpul

secundaIgG marcat cu peroxidaza din hrean (20

µl) la o concentraţie de 0.5 mg/ml şi dizolavat în

diluantul de anticorp a fost depozitat pe

suprafaţa electrodului timp de 20 de minute.

Apoi electrozii au fost clătiţi insensiv cu PBS.

Trei mediatori redox diferiţi au fost folosiţi

pentru testarea răspunsului amperometric a

imunosensorilor-HRP: hidrochinona, ferocenul

dicarboxilic, ferocianid (2mM) în prezena a 2μM

H2O2 (Figura 9.2).

Imunosensensorii-HRP au fost

potenţiostaţi la -0.1, -0.01 şi -0.1V faţă de SCE

pentru detectarea unui din cei trei compuşi

enzimatici produşi amperometric: fericianuda,

ferocenium, şi respectiv chinona.

Figura 9.2. Imunosensori amperometrici folosind copolimerul [poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida)] pentru modificarea electrozilor de platinǎ sau cǎrbune cu cei trei markeri enzimatici (Gox-B,PPO-B, HRP) pentru detectarea antitoxinei holera. (A) HRP-imunosensor; (B) Gox-B imunosensor; (C) PPO-B imunosensor; Medred/Medox = ferocianura/fericianuda; hidrochinona/chinona; ferocen/ferocenium; Gox - glucos-oxidaza biotinilatǎ, PPO-polifenol oxidaza biotinilatǎ; HRP-anticorpul IgG anti-iepure marcat cu HRP.

9.6. Rezultate şi discuţii

Pentru a imobiliza CT la suprafaţa

electrodului prin interactţi de afinitate via

punţilor de avidină-biotină, s-a folosit un nou

film copolimeric biotinilat [poli(pirol-biotina),

- 23 -

poli(pirol-lactobionamida)] ca un strat iniţial de

ancorare. Acest film copolimeric a fost elaborat

pentru îmbunătăţirea sensibilităţii transducţiei

reacţiilor enzimatice bazate pe detectarea

amperometrică a produşilor enzimatici prezenţi la

suprafaţa electrodului. Catecolul a fost utilizat ca

probă electrochimică pentru a ilustra diferenţa în

permeabilitate dintre copolimerul biotinilat şi

filmul de poli(pirol-biotina). Figura 9.3. prezintă

o serie de voltamograme ciclice înregistrate la

100 mV s-1 pentru electrodul nemodificat,

electrodul modificat cu poli(pirol-biotina) şi

electrodul modificat cu copolimer.

Figura 9.3. Voltamogramele ciclice ale electrozilor de platină (diametru de 5 mm): (a) electrod nemodificat, (b) electrod modificat cu copolimerul poli(pirol-biotina, pirol-lacto-bionamida), (c) electrod modificat cu polipirolul biotinilat în prezenţa a 1 mM catecol în soluţia apoasă de 0.1 M LiClO4 (pH 7). Filmele polimerice au fost electrodepozitate prin controlarea potenţialului de electroliză la 0.8 V (sarcina de electropolimerizare a fost de 1 mC). Viteza de scanare a fost de 100 mV s-1.

9.6.1. Răspunsul de curent amperometric la

anti-CT folosind imunosensorul-HRP

Configuraţia enzimatică cea mai simplă a

constat în folosirea anticorpului secundar

conjugat cu o enzimă, în cazul de faţă HRP.

Datoriă spectrului larg de substrate enzimatice,

trei sisteme electroactive (ferocianura/H2O2,

acidul dicarboxilic/H2O2 şi hidrochinona/H2O2)

au fost alese pentru investigaţia amperometrică.

Timpul de răspuns pentru toţi imunosensorii-

HRP a fost extrem de rapid, variind între 5 la 30

de secunde. Acesta ilustrează o permeabilitate

bună a filmului copolimeric. Figura 9.4. prezintă

curbele de calibrare ale imunosensorilor-HRP

pentru detectarea amperometrică a anti-CT prin

intermediul celor trei substrate-HRP.

Figura 9.4. Curbele de calibrare pentru anti-CT în cazul imunosensorilor-HRP folosind diferite sisteme de mediatori redox /H2O2 ;( ■) hydrochinona, (□) ferocianid, (♦) ferocen.

9.6.2. Performanţele analitice ale

imunosensorilor-HRP, Gox-B, şi PPO-B

Sensibilitatea imunosensorului a fost

determinată ca panta obţinută din partea liniară a

curbei de calibrare. În Tabelul 9.1. sunt

prezentate valorile limitei de detecţie,

sensibilităţii şi a curentului maxim (Imax) obţinute

în condiţii de saturare a anti-CT pentru cele trei

sisteme de detecţie enzimatică.

Sistemul hidrochinona/H2O2 conduce la

obţinerea celor mai bune performanţe analitice:

cea mai scăzută limită de detecţie (50 ng/ml) şi

cea mai ridicată sensibilitate (1.5 µAµg-1ml cm-

2). De asemenea, au fost înregistrate valori

ridicate ale Imax pentru formarea teoretică a unui

monostrat de anti-CT şi astfel a monostratului de

HRP.

- 24 -

Cele mai bune perfomanţe analitice

obţinute cu substratul hidrichinonă pot fii

atribuite dimensiunilor reduse ale cestui

mediator redox comparativ cu ferocianura şi

ferocenul, conducând astfel la o mai bună

permeabilitate în filmul copolimeric.

Valorile de detecţie de 50 ng/mL anti-CT

sunt similare cu cele obţinute cu imunosensorii

bazaţi pe fibre optice folosind anticorpul

secundar marcat cu HRP (160 ng/ml) [180, 181,

199, 200].

9.6.3. Răspunsul de curent amperometric la

anti-CT folosind Gox-B şi PPO-B ca markeri

enzimatici în construcţia de imunosensori

Cu scopul îmbunătăţirii limitei de

detecţie, anticorpul secundar marcat cu HRP a

fost înlocuit cu anticorpul-biotinilat. Markerii

enzimatici, Gox-B şi PPO-B au fost ataşaţi de

anticorpul secundar prin puntea de avidină-

biotină.

Figura 9.5A prezintǎ curba de calibrare a

imunosensorilor Gox-B în funcţie de

concentraţiile de anti-CT.

În ceea ce priveşte PPO-B, polifenol

oxidaza biotinilatǎ este folositǎ pentru prima datǎ

ca marker enzimatic în fabricarea unui

imunosensor. Acestǎ enzimǎ catalizeazǎ în

prezenţa oxigenului oxidarea fenolului şi o-

difenolilor în o-chinona. Ca urmare, detecţia

amperometricǎ a anti-CT a fost efectuatǎ în

prezenţa a 10 mM catecol (principalul substrat al

PPO) prin potenţiostatarea imunosensorilor PPO-

B la -0.2V faţǎ de SCE pentru a reduce o-chinona

generatǎ. Figura 6B prezintǎ urba de calibrare

pentru imunosensorii PPO-B în funţtie de

concentraţiile de anti-CT.

Figura 9.5. Curba de calibrare pentru anti-CT folosind (A) imunosensorii Gox-B în prezeţta glucozei, Eapplicat= 0.6V, (B) imunosensorii PPO-B în prezeţa catecolului; Eaplicat= -0.2V.

9.7. Concluzii

În acest capitol este demonstratǎ

posibilitatea fabricǎrii de imunosensori pentru

dozarea anticorpilor specifici pentru holera prin

intermediul simplei imobilizǎri a materialului

imunologic (toxina holerei) la suprafaţa

electrodului modificat cu un nou film de pirol

copolimeric ce poartǎ grupǎri de biotinǎ si

lactobionamidǎ. Interacţia antigen-anticorp este

dozatǎ amperometric. Datoritǎ permeabilitǎţii

bune a filmului copolimeric, a fost posibilǎ

utilizarea a trei sisteme de transducere

electroenzimaticǎ (HRP, Gox-B, PPO-B) pentru

detectarea anticorpului de anti-toxina holerei, ce

au fost ulterior studiate şi comparate în ceea ce

priveşte performanţele analitice obţinute pentru

fiecare marker. Astfel, imunosensorii ce folosesc

- 25 -

HRP prezintǎ cea mai sensibilǎ limitǎ de detecţie

(50 ng/ml).

10. Î10. ÎMBUNATATIRIMBUNATATIRI ADUSEADUSE ÎNÎN REŢINEREAREŢINEREA

ENZIMELORENZIMELOR DEDE FILMULFILMUL DEDE POLIPOLI((PIROLPIROL--

ALGINATALGINAT) ) ÎNÎN ELABORAREAELABORAREA BIOSENSORILORBIOSENSORILOR

10.1. Introducere

De-a lungul timpului s-au folosit diferiţi

polimeri naturali şi sintetici pentru incapsularea

biomoleculelor, celulelor şi microorganismelor

pentru scopuri variate. Dintre acestea, alginatul

este unul dintre polimerii naturali cel mai

promiţǎtor folosit la imobilizarea de celule [203,

204] şi enzime [205].

Capitolul de faţǎ ilustreazǎ superioritatea

oferitǎ de un matrix nou sintetizat de pirol-

alginat [216] comparativ cu cel bazat pe alginatul

natural în elaborarea biosensorilor. De fapt, idea

a fost de a demonstrata ca dupǎ

electropolimerizarea conjugatului de pirol-alginat

(Figura 10.1), în condiţiile în care alginatul

natural este îndepǎrtat, alginatul modificat este

reţinut de suporturi (electrozi) datoritǎ

polimerizǎrii grupelor pirolice grefate. De

asemenea, s-a efectuat o evaluare a cantitǎţii de

gluco-oxidaza pierdutǎ din matrixul de polipirol-

alginat ca a fost comparatǎ cu cea din matrixul de

alginat natural. Capitolul descrie performanţele

analitice ale biosensorilor amperometrici bazaţi

pe matrixul de gluco-oxidaza-polipirol-alginat şi

cel de gluco-oxidaza-alginatul natural [228]

Figura 10.1. Reprezentarea schematicǎ a

sintezei compusului pirol-alginat.

10.4. Rezultate şi discuţii

10.4. 1. Prepararea electrozilor cu alginat şi

polipirol-alginat pentru testele electrochimice

Pentru funcţionalizarea electrodului de

cǎrbune, s-au depozitat pe suprafaţa sa 3 µl

soluţie apoasǎ de alginat sau pirol-alginat (2%,

w/v) şi lǎsat sǎ reacţioneze timp de 5 minute cu o

picaturǎ de 0.1 M CaCl2 [217]. Prezenţa acestor

geluri conduce la o scǎdere marcantǎ a

intensitǎţii picului reversibil comparativ cu cel

obţinut pentru un electrod nemodificat (Figura

10.2).

Ambele geluri au fost oxidate prin

controlarea potenţialului de electrolizǎ în soluţia

apoasǎ conţinând 0.1 M LiClO4 timp de 10

minute la 0.93 V faţǎ de electrodul saturat Ag-

AgCl-KCl (Ag/AgCl). Polimerizarea presupusǎ a

pirol-alginatului a fost eficientǎ, deoarece se

observǎ o scǎdere accentuatǎ (-70%) a intensitǎţii

picului de oxidare a derivatului de ferocen

comparativ cu valoarea sa iniţialǎ (34 µA)

obţinutǎ înaintea procesului de

electropolimerizare. Acestǎ creştere în rezistenţa

difuzionalǎ reflectǎ formarea lanţurilor

polimerizate în structura de gel. Din contrǎ,

- 26 -

voltamograma ciclicǎ caracteristicǎ oxidǎrii

aliginatului natural prezintǎ o creştere a

intensitǎţii curentului de la 32 la 42µA.

Figura 10. 2. Voltamogramele ciclice în prezenţa ferocenului dicarboxilic în tamponul 0.1M Tris-HCl (pH = 7) pentru (A) (a) un electrod nemodificat de cǎrbune vitros (diametrul de 5 mm), (b) un electrod modificat cu pirol-alginat (3 µl), (c) un electrod modificat cu polipirol-alginat (3 µl) oţtinut prin controlarea poteţialului de electrolizǎ la 0.93V, (d) identic cu (c) dupǎ imersarea în soluţie de etanol (10 min) şi 0.1M tampon fosfat (pH 7) pentru alte 10 minute.(B)(e) un electrod modificat cu 3 µl alginat, (f) un electrod modificat cu 3 µl alginat dupǎ electroliza la potenţial fix de 0.93 V, (g) un electrod modificat identic cu (e) dupǎ imersarea în soluţie de etanol (10 minute) şi în soluţie de 0.1M tampon fosfat (pH 7, 10 minute). Timpul de gelificare a fost de 5 minute în prezenţa

agentului de gelificare 0.1 M CaCl2. Viteza de scanare a fost de 0.1V s-1.

10.4.2. Studii de permeabilitate

Pentru a dovedi prezenţa lanţurilor de

polipirol în gelul de alginat, a fost determinatǎ

permeabilitatea filmelor de alginat şi polipirol-

alginat cu ajutorul experienţelor de electrod-disc

rotitor (RDE) la diferite turaţii şi în prezenţa 1

mM hidrochinona dizolvatǎ în 0.1 M Tris-HCl

(pH = 7) şi a ecuaţiilor Gough şi Leypoldt

descrise în capitolul 4 (Figura 10.4).

Diferenţa mare de permeabilitate

estimatǎ pentru filmul de alginat şi polipirol-

alginat (3.65 x 10-1 şi respectiv 2.7 x 10-2 cm s-1)

reflectǎ clar împiedicǎrile sterice datorate

lanţurilor de polipirol generate in situ.

Figura 3. Voltamogramele RDE ale electrodului de platinǎ în formǎ de disc (diametru = 5 mm) modificat cu polipirol-alginat în prezenţa soluţie de hidrochina (1 mM) in tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH=7): (a) 2000; (b) 1500; (c) 1000; (d) 500; (e) 100 rpm/min. Viteza de scanare: 20 mV 1.

- 27 -

Figura 10.4. Graficul Koutecky-Levich pentru un electrod nemodificat (a), modificat cu alginat (b) şi modificat cu polipirol-alginat (c). Soluţia test a fost 1 mM hidrochinonǎ în tamponul 0.1 M Tris-HCl (pH = 7).

10.4.4. Biosensori amperometrici bazaţi pe

filmele de alginat şi polipirol-alginat

Pentru evideţierea aplicabilităţii noului

matrix sintetizat (pirol-alginatul) au fost elaboraţi

biosensori amperometrici pentru dozarea

glucozei. Prin compararea performanţelor

analitice ale biosensorilor în ceea ce priveşte

valorile de curent maxim (Imax) şi de sensibilitate

se obţin valori superioare ale Imax = 1.11 µA, şi

sensibilităţii = 122 µAM-1 pentru filmul de

polipirol-alginat, faţă de un Imax = 0.62 µA, şi o

sensibilitate = 34 µAM-1 obţinute pentru filmul

de alginat (Figura 10.5).

Figura 10.5. Curbele de calibrare pentru dozarea glucozei înregistrate de electrozii de platină modificaţi cu alginat-Gox (3 µl) (▲), polipirol-alginat-Gox (3 µl) (■) şi 15 μl (♦), ce au fost potenţiostaţi la 0.6 V în tamponul de 0.1 M Tris-HCl (pH = 7).

Aceste rezultate confirmă faptul că

procesul de polimerizare induce o creştere a

gradului de retenţie a moleculelor de Gox,

contribuind la îmbunătăţirea performanţelor

biosensorului.

10.5. Concluzii

Rezultatele descrise în acest capitol

demonstrează pentru prima dată abilitatea

polimerizării electrochimice a unui film de pirol-

alginat polimer pre-depozitat pe suprafaţa unui

electrod sub formă de gel. De asemenea este

demonstrat prin studii de permeabilitate şi de

distrugere organică a celor tipuri de polimeri

(alginat şi polipirol alginat) cum unităţile de pirol

contribuie substanţial la îmbunătăţirea

proprietăţilor mecanice şi chimice ale gelului de

alginat. Astfel, matrixul de polipirol-alginat

electrogenerat constituie un suport atractiv pentru

imobilizarea enzimelor active şi în fabricarea

potenţială a biosensorilor pentru diagnosticul

medical.

11. B11. BIOSENSORIIOSENSORI AMPEROMETRICIAMPEROMETRICI BAZAŢIBAZAŢI PEPE

GELURIGELURI DEDE ALGINATALGINAT ŞIŞI POLIPIROLPOLIPIROL--ALGINATALGINAT

CONŢINÂNDCONŢINÂND CELULECELULE ALGALEALGALE DEDE CCHLORELLAHLORELLA

VULGARISVULGARIS

11.1. Introducere

Cum a fost menţionat in capitolul 10,

alginatul face parte din familia de polizaharide

liniare ce conţine cantităţi variate de reziduuri de

acid β-D-manuronic şi reziduuri de acid α-L-

guluronic. Aceste reziduuri pot varia mult ca

procent formând aranjamente compacte de-a

lungul lanţului polizaharidic. Cationii divalenţi

- 28 -

sunt legaţi de părţile de acid guluronic într-o

manieră cooperativă sporită, iar mărimea

unităţilor cooperative este mai mare de 20 de

monomeri [222].

Alga verde eucariotă Chlorella vulgaris

este frecvent utilizată pentru studii de imobilizare

şi îndepărtarea nutrienţilor [223, 224] Celule de

C. vulagaris sunt foarte abundente în natura şi

sunt de importanţă majoră pentru ecosistemul

acvatic, fiind considerate bioindicatori naturali

ale bioactivităţii reziduurilor industriale. Analiza

microscopică a acestor celule, evidenţiază o

formă sferică, de 5-10 mm în diametru. În

domeniul biosensorilor, celulele de C. vulgaris

au fost deja utilizate în construirea de biosensori

optici şi electrochimici [225, 226].

În acest capitol se descriu avantajele

aduse în construirea biosensorilor amperometrici

de către noua moleculă sintetizată de pirol-

alginat (capitolul 10) în comparaţie cu cea a

alginatului natural pentru imobilizarea de celule

algale de C. Vulgaris [82]].

11.5. Prepararea biosensorului algal

La temperatura camerei (25°C) au fost

amestecate viguros 5 ml de suspensie celule

algale cu 10 ml alginat (2%, w/v) sau pirol-

alginat (2%, w/v). Cele două amestecuri apoase

diferite au fost depozitate pe suprafaţa

electrodului de platină (20 µl) şi acoperiţi cu o

picătură de clorură de calciu (0.1 M) pentru 5

minute. Electrodul modificat cu pirol-alginat a

fost ulterior electropolimerizat la temperatura

camerei prin controlarea potenţialului de oxidare

la 0.94V pentru 10 minute într-o soluţie apoasă

conţinând 0.1 M LiClO4.

11.7. Rezultate şi discuţii

11.7.1. Compararea electrochimicǎ a

stabilitǎţii gelurilor de alginat şi poli-pirol

alginat ce conţin celule algale

Permeabilitatea ferocenului dicarboxilic

(2 mM) dizolvat în tamponul 0.1 M Tris-HCl

(pH 9) conţinând 1 mM MgCl2 a fost investigatǎ

pentru cele douǎ tipuri de geluri, ilustrând astfel

oxidarea unui electron la suprafaţa electrodului.

Figura 11.1A,B prezintǎ voltamogramele ciclice

obţinute pentru electrodul nemodificat şi

modificat cu poli(pirol-alginat-celule algale) la

temperatura de 30°C.

Prezenţa gelului de APPyA conduce la o scǎdere

marcantǎ în intensitatea reversibilitǎţii picului de

ferocen, unde valoarea curentului anodic scade de

la 130 la 58 µA. Dupǎ incubarea acestui electrod

modificat în tamponul agitat magnetic (300 rpm)

la 30°C pentru 50 de minute, se observǎ o

creştere a curentului anodic pânǎ la 68 µA

(Figura 11.1C). Acestǎ creştere minorǎ de curent

demonstreazǎ stabilitatea bunǎ a gelului de

Figura 11.1. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) pentru (A) un electrod de platinǎ nemodificat la 30°C; B) un electrod de Pt modificat cu un gel de poli(pirol-alginat) conţiâind celule algale - etapa inţialǎ; C) acelaşi electrod (B) folosit dupǎ 50 de minute într-o soluţie dimamicǎ tampon. Potenţialul de scanare a fost între 0 şi 0.7 V faţǎ de Ag/AgCl în 0.1M Tris-HCl (pH 9) conţinând 1 mM MgCl2 la 30°C. Viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.

- 29 -

APPyA la suprafaţa electrodului de

platinǎ la 30°C.

Cum s-a presupus, depozitul de alginat-

celule algale (AA) induce iniţial aceleaşi

impiedicǎri sterice ca APPyA în ceea ce priveşte

accesul speciei redox, efect ilustrat prin valoare

de curent anodic de 60 µA (Figura 11.2A). Din

contrǎ, se observǎ o creştere a curentului anodic

pânǎ la 120 µA dupǎ imersarea în soluţia de

tampon termostatǎ la 30°C, indicând astfel

pierderea aproape totalǎ a depozitului de alginat

în soluţie (Figura 11.2B). Deoarece stabilitatea

gelului de alginat a fost influenţatǎ de

temperatura de 50°C, s-au efectuat experienţe

similare cu gelul de AA la temperaturi scǎzute de

10°C şi 15°C. Din rezultatele obţinute se observǎ

o creştere a curentului anodic de la 60 A la 100

A şi respectiv 105 µA (Figura 11.2C, D). Deşi

creşterea temperaturii sporeşte instabilitatea

gelului de AA, la temperaturi scǎzute de

asemenea AA este instabil la suprafaţa

electrodului de platinǎ.

Figura 11.2. Voltamogramele ciclice ale ferocenului dicarboxilic (2 mM) în soluţia tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) + 1 mM MgCl2

pentru un A) electrod de platinǎ (Pt) modificat cu gel de alginat conţinând celule algale (faza iniţialǎ); B) acelaşi electrod modificat dupǎ 50 de minute de agitare într-o soluţie tampon termostatǎ la 30°C. C) acelaşi AA electrod dupǎ 50 de minute într-o soluţie dinamicǎ, termostatǎ la 10°C; D) acelaşi AA electrod dupǎ 50 de minute într-o soluţie termostatǎ la 15°C. Potenţialul de scanare a fost cuprins între 0 si 0.7 V faţǎ de Ag/AgCl; viteza de scanare a fost de 0.1 V s-1.

11.7.3. Performanţele analitice ale

biosensorilor celule algale-alginat şi celule

algale-pilipirol-alginat

Performanţele analitice ale celor douǎ

tipuri de biosensori-algali pentru determinarea

pNPP au fost comparate în condiţii de pH optim

de 9 şi la o temperaturǎ optimǎ de 20°C.

Sensibilitatea şi rǎspunsul biosensorului celule

algale-polipirol alginat au fost de 2 mAM-1 cm2 şi

de 15s, iar pentru biosensorul celule algale-

alginat au fost de 4 mAM-1 cm2 şi de 5s. Aceste

rezultate evidenţiazǎ o sensibilitate şi un

rǎspunsul rapid al biosensorului celule algale-

alginat mult superioare în comparaţie cu cele ale

biosensorul celule algale-polipirol alginat ca

urmare a unei porozitǎţi mai bune a gelului

nemodificat de alginat ce faciliteazǎ creşterea

proprietǎţilor de difuzie faţǎ de reţeaua de

polipirol-alginat.

Cum a fost descris în experimentele de

voltametrie ciclicǎ, reţeaua de polipirol afecteazǎ

profund accesul speciilor electroactive la

suprafaţa electrodului.

Stabilitatea operaţionalǎ a celor douǎ

tipuri de biosensori algali a fost studiatǎ prin

înregistrarea continuǎ a rǎspunsului de curent

maxim (Imax) obţinut în prezenta a 1mM pNPP

- 30 -

dispersat în soluţia agitatǎ magnetic de 0.1 M

Tris-HCl (pH 9, 20°C) în funcţie de timp.

Rǎspunsul biosensorului a fost stabil pentru 20 şi

120 minute pentru gelul de AA şi respectiv

APPyA

Stabilitatea de stocare a biosensorilor-

AA şi APPyA la 4°C a fost investigatǎ în soluţie

de tampon 0.1 M Tris-HCl (pH 9) conţinând 1

mM MgCl2. Pentru acesta au fost înregistrate

rǎspunsurile de curent caracteristice biosensorilor

în prezenţa concentraţiilor crescǎtoare de pNPP.

Mai mult, se observǎ cum sensibilitatea

biosensorului bazat pe gelul de APPyA scade la

65% din valoarea iniţialǎ a curentului dupǎ 10

zile, în timp ce a fost total distrusǎ sensibilitatea

bio-sensorului-AA.

11.7. Concluzii

În acest capitol este prezentatǎ elaborarea

reuşitǎ a biosensorilor amperometrici cu celule

algale de Chlorella vulgaris incapsulate fie într-

un gel natural de alginat, fie într-un gel sintetic

de alginat ce conţine grupǎri de pirol grefate.

Studiul comparativ al celor douǎ geluri

de alginat ilustreazǎ prin intermediul activitǎţii

fosfatazei alcaline a celulelor algale incapsulate,

rolul benefic jucat de polimerizarea

electrochimicǎ a reţelei de polipirol în interiorul

gelului de alginat. Acestǎ reţea sporeşte

stabilitatea mecanicǎ a gelului în prezenţa

temperaturilor ridicate (30°C) şi a convectiei.

CONCLUZII FINALE

Lucrarea de doctorat a avut drept

obiective construcţia şi caracterizarea unor

biosensori cu aplicabilitate în laboratorul

medical, în particular a imunosensorilor

amperometrici pentru dozarea enzimelor

proteolitice (exemplu: tripsina) ce sunt

importante în metabolismul uman, a

imunosensorilor amperometrici pentru dozarea

anticorpilor specifici pentru microorganismul

Vibrio cholera, a biosensorilor amperometrici

pentru identificarea virusului Nile West, si a

biosensorilor ce folosesc un nou matrix sintetizat

-pirol-alginatul- pentru o imobilizare eficientǎ a

enzimelor şi celulelor (exemplu: celule algale de

Chorella vulgaris), întrucât biosensorii sunt

instrumente analitice rapide şi ieftine în

comparaţie cu metodele convenţionale utilizate în

monitorizarea sǎnǎtǎţii oamenilor.

Toţi biosensorii fabricaţi în aceastǎ tezǎ

au la bazǎ utilizarea derivaţilor de pirol [pirol-

alchil amoniu, pirol-biotinǎ, pirol-benzofenona,

pirol-hidroxisuccinimida, pirol-alginat, pirol-

tris(bipyridin) ruteniu (II)] care în urma

procesului de electropolimerizare asigurǎ

formarea reţelelor polimerice ce permit ulterior

imobilizarea speciilor biologice (enzime,

anticorpi, antigeni, oligonucleotide) în starea lor

biologicǎ activǎ. Ca urmare, dozarea tripsinei s-a

realizat rapid şi simplu cu ajutorul unui biosensor

amperometric având la bazǎ digestia graduatǎ a

unui strat uscat de gelatinǎ (strat format la

suprafaţa unui electrod de platinǎ modificat cu

filme de polipirol alchil-ammoniu ce conţine

molecule enzimatice de gluco-oxidaza) în funcţie

de concentraţia utilizatǎ de tripsinǎ. O limitǎ de

detecţie foarte sensibilǎ a fost obţinutǎ pentru

dozarea tripsinei cu o concentraţie de 1 pg/ml

unde timpul de răspuns al biosensorului a fost de

10 minute.

În continuare au fost construiţi biosensori

ce sunt capabili de a detecta specific anticorpii

- 31 -

caracteristici holerei (anti-CT) cu ajutorul

sistemelor electrochimice ce folosesc markeri

enzimatici ca gluco-oxidaza biotinilatǎ (Gox-B),

polifenol oxidaza biotinilatǎ (PPO-B) şi

peroxidaza (HRP). Limitele de detecţie obţinute

pentru biosensorii Gox-B, PPO-B, şi HRP sunt

foarte sensibile de 1 g/ml, 0.1 g/ml şi

respectiv 50 ng/ml anti –CT, iar timpul de

răspuns al celor trei imunosensorii a fost foarte

rapid – mai puţin de 30 de secunde.

În ceea ce priveşte detecţia virusului Nile

West, teza de doctorat descrie 4 tipuri de

(imuno)biosensori: (i) imunosensori pentru

detecţia anticorpilor IgG specifici virusului Nile

West, sensori bazaţi pe fotoimobilizarea

phagilor-WNV într-un film copolimeric format

din pirol-benzofenona şi tris(bipiridin-

pirol)ruteniu; (ii) imunosensori pentru detecţia

anticorpilor IgG specifici virusului Nile West,

unde phagilor-WNV sunt incapsulaţi într-un film

de polipirol-alchil ammoniu; (ii) sensori cADN

derivaţi din WNV unde oligonucleotida aminatǎ

este grefatǎ de un film electrogenerat de

polipirol- substituit cu grupul de N-

hidroxisuccinimida; (iv) sensori cADN derivaţi

din WNV bazaţi pe utilizarea unui intercalator

redox acridic pentru detecţia specificǎ a

duplexului-ADN WNV. Limite de detecţie

remarcabile au fost obţinute pentru biosensorii cu

configuraţia (ii) de 10-7 anticorpi-WNV şi pentru

biosensorii cu configuraţia (iv) de 1 pg/ml

oligonucleotidǎ specificǎ pentru WNV. De

asemenea timpul de răspuns al acestor biosensori

a fost foarte rapid: între 5-20 secunde pentru (ii)

şi mai puţin de 40 de secunde pentru (iv).

În ultima parte a lucrǎrii de doctorat se

prezintǎ fabricarea biosensorilor bazaţi pe

utilizarea unui nou derivat de pirol (pirol-alginat)

ce-şi poate gǎsi aplicaţii în laborartorul medical

datoritǎ caracterului sǎu netoxic. Ca exemplu

pentru confirmarea capabilitǎţilor acestui nou

polimer au fost construiţi biosensori enzimatici şi

biosensori pentru dozarea activitǎţii fosfatazei

alcaline caracteristicǎ celulelor algale de

Chlorella vulgaris importante în monitorizarea

poluǎrii mediului, ce sunt un bun indiciu de

estimare a declanşǎrii eventualelor maladii

umane.

Pentru viitor se sperǎ elaborarea de

(imuno)biosensori utili în depistarea timpurie a

altor virusuri şi bacterii extrem de periculoase

pentru om, în testarea coagulǎrii sângelui, în

moni-torizarea unui tratament medicamentos a

citokinelor şi markerilor cardici în unitǎţile de

reanimare, precum şi în testarea fertilitǎţii şi în

monotorizǎri endocrinologice. În acest sens

progresele înregistrate în domeniul

nanotechnolgiei [231-233] vor favoriza

dezvoltarea nano-imunosensorilor, în particular

în proteomics (studiul proteinelor) şi cellomics

(studiul celulelor).

Unanim acceptat, scopul final al

(imuno)biosensorilor este miniaturizarea ce va

permite integrarea tuturor etapelor efectuate în

laboratorul medical într-un singur dispozitiv -

sensor lab-on-chip- care în mare parte poate fii

de unicǎ folosinţǎ. Ca un avantaj major,

cantitatea de probǎ lichidǎ (sânge, urinǎ, etc)

necesarǎ pentru testarea biochimicǎ se va

diminua considerabil, mai puţin de < 1 µl [234]

unde cel mai probabil elementele de bazǎ pentru

construirea unui sensor-integrat miniaturizat vor

fii pompele, valvulele, şi un circuit pentru

control electronic [235].

- 32 -

De asemenea se sperǎ ca imunosensori

implatabili sǎ poatǎ fii comercializaţi la un preţ

scǎzut, ceea ce va facilita introducerea lor în

rutina medicalǎ ca o alternativǎ precisǎ pentru

depistarea unei eventuale maladii.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVA

21.Rodica E. Ionescu , Serge Cosnier, Gregoire

Herzog, Karine Gorky, Boaz Leshem,

Sebastien Herrmann, Robert S. Marks,

“Amperometric immunosensor for the

detection of anti-Nile West virus IgG using a

photoactive copolymer“, Enzyme and

Microbial Technology, 40(3), 403-408,

(2007).

22. Rodica E. Ionescu, Serge Cosnier, Sebastien

Herrmann, Robert S. Marks, “Amperometric

immunosensor for the detection of anti-Nile

West virus IgG“, Anal. Chem., acceptat spre

publicare.

48. Rodica E. Ionescu, Anton Ciucu,

“Aplicatiile biosensorilor in laboratorul

medical“, Jurnalul laboratorului clinic, 2, 4-5,

(1998).

54. Rodica E. Ionescu , Serge Cosnier, Robert S.

Marks, “Protease amperometric sensor“,

Anal. Chem., 78(18), 6327-6331, 2006.

65.Razvan Stoia, Adriana Dumitrescu, Ioana

Moţoiu, Rodica E. Ionescu , Dan Coliţă,

”Major parameters of chronic lymphocytic

leukemia”, Documenta Haematologica, 3(1),

41- 45, (1999).

78.Rodica E. Ionescu , Chantal Gondran, Serge

Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks,

“Comparison between the performances of

amperometric immuno-sensors for holera

antitoxin based on three enzyme markers,“

Talanta, 66 (1), 15-20 (2005).

79.Rodica E. Ionescu , Chantal Gondran, Serge

Cosnier, Levi A. Gheber, Robert S. Marks,

“Construction of amperometric immuno-

sensors based on the electro-generation of a

permeable biotinylated polypyrrole“,

Anal.Chem, 76( 1), 6808-6813, (2004)

82. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah,

Serge Cosnier, Claude Durrieu, Jean-Marc

Chovelon, Robert S. Marks, “Amperometric

algal Chlorella vulgaris cell biosensors

based on alginate and polypyrrole-alginate

gels,“ Electroanalysis 18 (11), 1041-1046,

2006.

86. Rodica E. Ionescu , Sebastien Herrmann,

Serge Cosnier, Robert S. Marks, ”A

polypyrrole cDNA electrode for the

amperometric detection of Nile West virus”,

Electrochem. Comm., 8 (11), 1741-1748

(2006).

87. Serge Cosnier, Rodica E. Ionescu, Sebastien

Herrmann, Laurent Bouffier, Martine

Demeunynck, Robert S. Marks,

”Electroenzymatic polypyrrole-intercalator

sensor for the detection of Nile West virus

cDNA”, Anal. Chem., 78(19), 7054-7057

(2006).

117. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth,

C.R.

Lowe, Anal. Chem., 67 (1995) 4229.

118. R.B. Millington, A.G. Mayes, J. Blyth,

C.R.

Lowe, Sens. Actuators, B: Chem., 33

(1996)

55.

136. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, J. Electrochem.

Soc., 127 (1980) 1278.

- 33 -

137. D.A. Gough, J.K. Leypoldt, Anal. Chem.,

51 (1979) 439.

138. J.M. Saveant, J. Electroanal. Chem., 302

(1991) 91.

145. L. Bouffier, M. Demeunynck, A. Millet,

P.J.

Dumy, J. Org. Chem., 69 (2004) 8144.

150. F. Palmisano, C. Malitesta, D. Centonze,

P.G. Zambinin,. Anal. Chem., 67 (1995)

2207.

172. S. Cosnier, B. Galland, C. Gondran, A. Le

Pellec, Electroanalysis 10 (1998) 808.

175. S. Cosnier, M. Stoytcheva, A. Senillou, H.

Perrot, R.P.M. Furriel, F.A. Leone,

Anal.Chem., 71 (1999) 3692.

176. O. Ouerghi, A. Touhami, N. Jaffrezic-

Renault, C. Martelet, H. Ben Ouada, S.

Cosnier, Bioelectrochemistry 56 (2002)

131.

180. R.S. Marks, E. Bassis, A. Bychenko, M.M.

Levine, Opt. Eng., 36 (1997) 3258.

181. T. Konry, A. Novoa, S. Cosnier, R.S.

Marks, Anal. Chem., 75 (2003) 2633.

188. C. Mousty, J.L. Bergamasco, R. Wessel, H.

Perrot, S. Cosnier, Anal.Chem., 73 (2001)

2890.

198. S. Cosnier, A. Le Pellec, R.S. Marks, K.

P´eri´e, J.P. Lellouche, Electrochem.

Commun., 5 (2003) 973.

199. S. Cosnier, A. Leppelec, B. Guidetti, I.

Rico-Lattes, J. Electroanal. Chem., 449

(1998) 165.

200. R.S. Marks, A. Novoa, D. Thomassay, S.

Cosnier, Anal. Bioanal. Chem., 374 (2002)

1056.

203. G. Orive, R.M. Hermandez, A.R. Gascon,

R.

Calafiore, T.M. Chang, P. De Vos, G.

Hortelano, D. Hunkeler, I. Lacik, A.M.

Shapiro, J.L. Pedraz, Nature Medicine 9

(2003) 1104.

204. P.S.J. Cheetham, K.W. Blunt, C. Bucke,

Biotechnol. Bioeng., 21 (1979) 2155.

205. N. Munjal, S.K. Sawhney, Enzyme

Microb. Technol., 30 (2002) 613.

216. Khalil Abu-Rabeah, Boris Polyak, Rodica

E. Ionescu , Serge Cosnier, Robert S.

Marks, “Synthesis and characterization of

a pyrrole-alginate conjugate and its

application in a biosensor construction”,

Biomacromolecules, 6(6), 3313-3318,

(2005).

217. E. Taqieddin, M. Amiji, Biomaterials 25

(2004) 1937.

222. O. Smidsrod, G. Skjak-Braek, TIBTECH

8 (1990) 71.

225. P. Pandard, D. M. Rawson, Environ.

Toxicol. Water. Qual., 8 (1993) 323.

226. C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu,

J.-M. Chovelon, Biosens. Bioelectron., 21

(2005) 273

228. Rodica E. Ionescu, Khalil Abu-Rabeah,

Serge Cosnier, Robert S. Marks,

”Improved enzyme retention from an

electropolymerized polypyrrole-alginate

matrix in the development of biosensors”,

Electrochem. Commun., 7 (12), 1277-

1282, (2005).

231. B.M. Cullum, T. Vo-Dinh, Trends

Biotechnol., 18 (2000) 388.

232. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi

A.Gheber, “Nanolithography using

protease etching of protein surfaces,”

NanoLetters 3(12), 1639-1642 (2003).

- 34 -

233. Rodica E. Ionescu, Robert S. Marks, Levi

A. Gheber, “Manufacturing of

nanochannels with controlled dimensions

using protease nanolithography”

NanoLetters 5(5), 821-827 (2005).

234. M.I. Song, K. Iwata, M. Yamada, K.

Yokoyama, T. Takeuchi, E. Tamiya, I.

Karube, Anal. Chem., 66 (1994) 778.

235. R.A. Felder, G.J. Kost, MLO Med. Lab.

Obs., 30 (1998) 22.

- 35 -