CITOLOGIE ANIMALA

Lucrari de laborator

Lucrarea de laborator 1

Separarea componentelor celulare

Noţiunea de component celular are o semnificaţie largă, ea desemnând atât structurile celulare organizate, cu semnificaţie funcţională (organite celulare), substanţele de rezervă şi depozit ale celulei (incluziuni celulare), cât şi macromoleculele, micromoleculele şi ionii ce definesc compoziţia chimică a celulelor.

Separarea componentelor celulare reprezintă atât un scop experimental în sine, dar este şi o etapă iniţială şi obligatorie necesară studiului ulterior al acestor componente, prin variate mijloace de investigaţie.

Dintre diversele metode de separare a componentelor celulare (cu diferite niveluri de complexitate) aplicate în prezent în diferite laboratoare, se pot enumera:

separarea pe cale chimică; electroforeza; cromatografia; centrifugarea şi ultracentrifugarea etc.

În vederea separării componentelor celulare, prin oricare dintre metodele enumerate, este însă necesar ca, într-o primă instanţă, integritatea morfostructurală a celulelor intacte să fie alterată, pentru ca aceste componente celulare să fie puse în libertate; trebuie deci practicate o serie de tehnici, desemnate global sub numele de omogenizare (omogenare) celulară.

1.1. Omogenizarea şi omogenatele celulare

Simplificat, noţiunea de „omogenizare” poate fi definită ca operaţia (operaţiile) prin care se obţine un omogenat celular.

Omogenatul celular este o suspensie de celule întregi (sau de componente subcelulare), realizată într-un mediu lichid cu două caracteristici esenţiale: pH fiziologic şi izotonicitate.

Există mai multe metode de realizare a omogenatelor celulare, care, în funcţie de factorul principal ce determină dezorganizarea celulelor (sau detaşarea celulelor întregi dintr-un ţesut), se pot clasifica în:

1.1.1. Metode mecanice de omogenizare.

Există mai multe tipuri de metode mecanice de omogenizare, dintre care se pot enumera următoarele:

omogenizarea cu ajutorul omogenizatorului Potter, dispozitiv ce prezintă următoarele componente (Fig. 1.1):

Datorită spaţiului foarte îngust dintre peretele interior al cuvei şi extremitatea îngroşată a pistilului celulele sunt supuse unei acţiuni de triturare mecanică, produsă prin rotaţia pistilului; membrana celulară cedează sub acţiunea forţei rotative, iar componentele celulare, chiar de dimensiuni mari, sunt eliberate în mediul de omogenizare, obţinându-se astfel un omogenat celular.

Fig. 1.1. Schema unui omogenizator de tip Potter

omogenizarea cu ajutorul omogenizatorul Warring (cu cuţite) (Fig. 1.2.)

P ist i l (par te inferioarã)

Cutite (lame) semic irc ulare

Fig.1.2. Reprezentarea schematică a extremităţii inferioare a pistilului omogenizatorului Warring

Datorită lamelelor semicirculare cu care este prevăzut pistilul acestui omogenizator, se obţine o omogenizare mai avansată a celulelor, rezultând, în general, suspensii de com-ponente celulare mai fine decât în cazul metodei Potter.

prin mojarare, cu sticlă pisată (sau nisip de cuarţ)

Această metodă este considerată cea mai agresivă variantă mecanică de omogeni-zare, datorită acţiunii abrazive a particulelor de sticlă asupra celulelor; ea conduce la eliberarea de agregate moleculare întregi, în mediul de omogenizare, din ansamblul unor organite celulare.

1.1.2. Metode fizice

Dintre acestea, cea mai cunoscută este ultrasonarea (ultrasonicarea), bazată pe u-tilizarea ultrasunetelor (sunete cu frecvenţă înaltă). Ultrasunetele acţionează în primul rând asupra membranei celulare, pe care o distrug, conţinutul celular fiind eliberat apoi în mediul de omogenizare.

metoda îngheţului – dezgheţului alternativConstă în supunerea celulelor la o alternanţă de şocuri termice succesive (tempera-

turi extreme), care conduc în timp la dezorganizarea în fragmente a acestora, datorită varia-ţiilor de volum ale apei intracelulare produse în timpul îngheţului-dezgheţului.

1.1.3. Metode fizico – chimice.

Cea mai utilizată dintre acestea este metoda şocurilor osmotice, care constă în in-troducerea celulelor într-un mediu ce prezintă o diferenţă mare de presiune osmotică în com-paraţie cu mediul intracelular (mediu hipotonic sau hipoosmotic), actiune care are ca rezultat liza osmotică a celulelor. O variantă frecvent utilizată de liză osmotică este hemoliza hematiilor, obţinută prin introducerea acestor elemente figurate în apă distilată (sau bidistilată).

1.1.4. Metode chimice.

Se aplică, în special, in vederea detaşarii şi separarii unor celule întregi din diverse ţesuturi.

Constau în tratarea fragmentelor tisulare cu diverse enzime, în special proteolitice (de exemplu, tripsina şi colagenazele), care atacă şi digeră diferite tipuri de joncţiuni intercelula-re.

Componentele celulare aflate în suspensie în mediul de omogenizare, eliberate în ur-ma practicării uneia sau alteia dintre metodele descrise, pot fi supuse în continuare diferitelor tehnici de separare.

1.2. Centrifugarea

Centrifugarea este o metodă mecanică clasică de separare a componentelor celula-re.

Separararea se realizează sub acţiunea unei forţe centrifugale (G), generate în tim-pul mişcării piesei rotative (rotorului) unui aparat numit centrifugă.

Forţa centrifugală este o forţă derivată din forţa de atracţie gravitaţională, dar de sens opus, ea determinând îndepărtarea corpurilor de la centru spre periferie, în timpul unei rotaţii.

Expresia fizică (formula) forţei centrifugale se poate deduce cu uşurinţă din următoa-rea schemă (Fig. 1.3.):

r

ru

Traiec toria rotatie irotorului

Fig. 1.3. Reprezentarea schematică a rotaţiei rotorului unei centrifuge, pentru deducerea valorii lui G

Din schemă se deduce următoarea formulă:

G = 1,118 x 10-5 x r x u2 , unde:

G = forţa centrifugală, măsurată în unităţi g;

1,118 = constanta de centrifugare;

r = raza dispozitivului de rotaţie (rotor), măsurată în cm;

u= viteza unghiulară (viteza cu care este acoperit un anumit sector de cerc în unitatea de timp; u reprezintă, de fapt, viteza de rotaţie a rotorului şi se măsoară în rotaţii/minut – rpm)

În practică, pentru determinarea unora dintre mărimile care fac parte din formula for-ţei centrifugale (G sau u), nu se foloseşte formula de calcul, ci un dispozitiv grafic cunoscut sub numele de nomogramă (Fig. 1.4.).

Fig. 1.4. Nomograma

Nomograma este un sistem grafic triaxial, pe baza căruia, cunoscând două valori ale unor parametri din expresia forţei centrifugale, se poate afla direct valoarea parametrului ne-cunoscut, unind punctele cunoscute cu ajutorul unei drepte. Prelungind linia trasată în direc-ţia axei cu valoarea necunoscută, se obţine un punct de intersecţie, care reprezintă tocmai valoarea parametrului căutat.

1.2.1. Tipuri de centrifuge

În practica de laborator se folosesc, în general, două tipuri de centrifuge, ce diferă în principiu după construcţia rotorului:

centrifuga cu eprubete balansante (cu rotor orizontal) În cazul acestui tip de rotor, eprubetele (tuburile de centrifugare) sunt ataşate mobil la extremitatea externă a rotorului, fapt care face ca poziţia lor să se modifice pe parcursul rotaţiei acestuia (din poziţie verticală în repaus, eprubetele ajung în poziţie orizontală, în timpul centrifugării). Raza rotorului cu eprubete balansante este egală cu distanţa de la centrul de rotaţie până la baza eprubetei, orizontalizată (Fig. 1.5.);

r rotorului

RotorP ozitia eprubeteiîn timpul rotatie i

P ozitia eprubeteiîn repaus

M otor e lec tric

Axulrotorului

Fig. 1.5. Centrifuga cu eprubete balansante

centrifuga cu rotor angular În cazul acestei centrifuge, rotorul este un dispozitiv masiv, de formă trapezoidală în secţiune, prezentând în interior locaşuri pentru eprubetele de centrifugare, dispuse în poziţie oblică faţă de axul de rotaţie. Spre deosebire de centrifuga cu rotor orizontal, poziţia eprubetelor este fixă, nemodificată, în timpul rotaţiei. Raza acestui tip de rotor este egală cu distanţa dintre centrul de rotaţie şi centrul geometric al eprubetelor (punctul de intersecţie al celor două mediane imaginare care trec prin eprubete) (Fig. 1.6.).

Rotor

M otor e lec tric

Axulrotorului

rL oc as ul

eprubetei Centrul geometrica l eprubetei

Fig. 1.6. Centrifuga cu rotor angular

1.2.2. Factori care condiţionează sedimentarea componentelor celulare

În condiţiile în care G şi timpul de centrifugare sunt constante, în timpul centrifugării sedimentează numai anumite componente celulare, tipul particulelor care se colectează, în condiţiile menţionate, depinzînd în principal de două categorii de factori:

a. Caracteristicile particulelor. Aceste caracteristici se referă la:

masa şi densitatea particulelor - care sunt direct proporţionale cu viteza de sedimentare (componentele mai grele şi mai dense se depun întotdeauna, sub formă de sediment, înaintea celor mai uşoare, cu densitate mai mică);

forma şi suprafaţa particulelor – un component celular, deşi greu, se poate deplasa şi depune în tubul de centrifugare cu o viteză cu atât mai mică cu cât suprafaţa sa este mai extinsă şi forma mai neregulată.

b.Caracteristicile mediului de centrifugare. Se referă în principal la densitatea şi vâscozi-tatea acestui mediu (caracteristici invers proporţionale cu viteza de deplasare şi sedimentare a componentelor celulare)

1.2.3. Centrifugarea celulelor întregi şi a omogenatelor celulare

Reprezintă două variante distincte ale modului în care G acţionează asupra separării componentelor celulare.

În cazul centrifugării celulelor întregi (variantă ce poate fi exemplificată prin centrifu-garea unor celule dotate cu remarcabile proprietăţi de elasticitate şi plasticitate, cum este ca-zul celulelor protozoarului Amoeba proteus) cu ajutorul unui dispozitiv numit microscop – centrifugă, se remarcă două evenimente interesante:

o alungire a celulelor pe direcţia de acţiune a forţei centrifugale (ele căpătând o formă tubulară)si

o separare intracitoplasmatică şi o grupare zonală a structurilor celulare, de la polul centrifugal spre polul centripetal (în funcţie de dispunerea celulelor faţă de axul de rotaţie) (Fig. 1.7.).

Cris ta le

C itoplas mãdens ã

N uc leu

M itoc ondrii

Vac uole

L ipozomi

Pol c entrifugal

Pol c entripetal

Fig. 1.7. Deformarea celulei şi dispunerea internă a componentelor în cazul centrifugării unei suspensii de Ameoba proteus

În cazul centrifugării omogenatelor celulare, la sfârşitul centrifugării se obţin întotdea-una două componente: o parte solidă, precipitată (sediment) şi o parte lichidă, dispusă deasupra primei, care conţine particulele nesedimentate, aflate în suspensie (supernatant).

Mărind progresiv valoarea lui G şi a timpului de centrifugare, se pot obţine practic principalele componente celulare, în etape successive, sub formă de sediment, motiv pentru care o astfel de centrifugare mai este cunoscută şi sub numele de fracţionare diferenţiată sau centrifugare diferenţiată a celulelor.

În schema următoare, se prezintă parametri specifici (G şi timpul de centrifugare) ne-cesari pentru separarea, sub formă de sediment, a principalelor componente celulare, pornind de la un omogenat celular:

omogenat

600 – 1000 g, 10min

sediment I (nuclei) + supernatant I

supenatant I6000 – 7000 g, 10min sediment II (mitocondrii) +

supernatant II

supernatant II10000 g, 30min sediment III (lizozomi) +

supernatant III

supernatant III100000 g, 60min sediment IV (microzomi) +

supernatant IV

1.2.4. Centrifugarea nucleilor şi mitocondriilor – etape de lucru

Pentru a separa prin centrifugare nuclei şi mitocondrii, plecând de la materialul biologic avut la dispoziţie, se parcurg următoarele etape experimentale (Fig. 1.8.):

1. se sacrifică animalul de laborator (şobolan alb din rasa Wistar) prin decapitare totală sau parţială;

2. se practică o incizie pe linia medioventrală a corpului animalului, din regiunea suprapubiană până la nivelul rebordului costal (se pot secţiona şi coastele, paralel cu sternul, pentru abordarea organelor din cavitatea toracică);

3. se prelevează organe, parcurgând următoarele subetape: se toarnă soluţie de zaharoză (sucroză) 0,25M în cristalizoare şi acestea se

depun în plăci Petri, pe cuburi de gheaţă de mici dimensiuni, pentru răcirea soluţiei;

se decupează cu foarfecele fragmente de organe şi se introduc cu pensa în soluţia de zaharoză răcită la gheaţă;

4. se realizează omogenate din organele luate în lucru: se cântăresc câte 0,5 g din fiecare organ pe sticle de ceas, fragmentele

cântărite se mărunţesc fin cu foarfecele, organul mărunţit se transvazează în cuva omogenizatorului Potter şi se adaugă, prin pipetare 4,5 ml soluţie de zaharoză 0,25 M (astfel încât diluţia omogenatului sa fie 1 / 10);

se triturează mecanic fragmentele suspendate în zaharoză, până când o-mogenatul, privit prin transparenţă, capătă un aspect fin şi omogen.

5. se decantează omogenatele obţinute în eprubete de centrifugare şi se echilibrează la balanţă;

6. se introduc eprubetele în rotorul centrifugei (faţă în faţă) şi se realizează centrifuga-rea pentru sedimentarea nucleilor (10 min, la o viteză unghiulară corespunzătoare la g = 1000 g şi r = 5 cm, viteza aflată din nomogramă);

7. la finalul centrifugării se obţine un sediment reprezentativ cantitativ, depus pe fundul eprubetei şi un supernatant opalescent, care se colectează într-un alt tub de centrifu-gare, în vederea centrifugării ulterioare (pentru separarea mitocondriilor);

8. se realizează controlul citologic (microscopic) al separării nucleilor în modul următor: se depune o picătură de zaharoză pe lama de microscop; mică porţiune din sedimentul colectat se amestecă pe lamă cu zaharoza, se

acoperă cu lamela şi se observă succesiv, la obiective din ce în ce mai mari (10x – 40x); dacă separarea este corespunzătoare, în câmpul microscopic se pot observa direct, prin transparenţă, corpusculi în general sferic-ovoizi, delimitaţi de o membrană refringentă, care reprezintă nucleii izolaţi prin centrifugare.

Este indicat însă ca, înainte de separarea propriu-zisă, să se realizeze mai multe spălări de purificare a sedimentului nuclear (2 – 3 cicluri de resuspendare în zaharoză – cen-trifugare), care conduc la o purificare a sedimentului în proporţie de 95 – 98%.

9. pentru centrifugarea mitocondriilor, supernatantul, colectat în urma separării nucleilor, se centrifughează la parametri corespunzători (7000 g, 10 min);

10. la sfârşitul centrifugării rezultă un sediment (mai redus cantitativ decât în cazul nucle-ilor) şi un supernatant, care se îndepărtează;

11. controlul microscopic al separării mitocondriilor se face într-o manieră analogă cu cea precizată pentru observarea nucleilor, cu deosebirea că pe lama de microscop se a-daugă şi o picătură de colorant specific pentru aceste organite celulare (verde

Janus). 12. în cazul unei coloraţii şi separări adecvate, mitocondriile pot fi vizualizate doar cu o-

biective mari (40x – imersie), apărând ca nişte formaţiuni ovale sau sferice, verzi cu reflexe gălbui şi cu densitate relativ redusă în câmpul microscopic.

Animal deexperientã(s obolan)

Sac rifi c are,disec tie

Organ(fi c at)

P relevareZaharozã

Cuburi degheatã

P lac ã P etri

C intãrire(0,5g),omogenizare

OmogenizatorP otter

Dec antare

OmogenatEprubetã

dec entrifugare

Centrifugare(1000g, 10min.)

Sedimentde nuc le i

Sedimentde mitoc ondrii

Sedimentde nuc le i purifi c at

1

1

2

2

Res us pendare,rec entrifugare(2-3ori)

Centrifugare (7000g, 10 min.)

Dec antareasupernatantului

Observare mic ros c opic ã

Colorare,observare mic ros c opic ã

Fig. 1.8. Etape de lucru pentru separarea şi observarea nucleilor şi a mitocondriilor

Lucrarea de laborator 2

Ultracentrifugarea

Ultracentrifugarea reprezintă o variantă superioară (înaltă) de centrifugare a compo-nentelor celulare.

Intre centrifugare şi ultracentrifugare, principial, nu există deosebiri de ordin calitativ, ci doar cantitativ, putându-se considera că ne aflăm în domeniul ultracentrifugării atunci când forţa centrifugală (G) depăşeşte 100.000 g.

Ultracentrifugele sunt, în ansamblu, aparate mai complexe decât centrifugele obişnui-te, această complexitate derivând din faptul că, la viteze de rotaţie foarte mari ale rotorului, frecările care apar sunt imense. Reducerea la minim a frecărilor impune vidarea camerei de centrifugare cu ajutorul unei pompe de vid, care crează în această incintă o presiune negati-vă avansată (măsurată în torr). De asemenea, rotorul este ridicat în timpul rotaţiei, odată cu axul său, iar mişcarea de rotatie a acestuia este controlată şi de acţiunea unui câmp de forţe electromagnetice, în afară de rotaţia mecanică sustinuta de motorul ultracentrifugei.

Pentru evitarea la maxim a degajării de căldură, care apare totuşi în timpul mişcării rotorului, ultracentrifuga este prevăzută cu un sistem de răcire complex, menit să reducă la maxim excesul termic. Acest sistem de răcire este constituit din trei componente:

instalaţie de refrigerare (cu freon) care coboară temperatura din camera apa-ratului până la –500C (–600C);

instalaţie de circulare a apei, legată la reţeaua de apă; 1 – 2 ventilatoare care răcesc piesele aparatului ce se încălzesc în timpul

funcţionării. Deosebirile constructive dintre centrifuge şi ultracentrifuge includ şi tuburile de ultra-

centrifugare. Acestea sunt realizate din materiale rezistente (mase plastice sau teflon) şi pre-zintă un sistem multiplu de închidere, format din următoarele piese: un dop de metal cu gar-nitură de cauciuc pentru etanşare şi o prelungire externă cu filet dublu (interior şi exterior), un capac metalic perforat, o piuliţă care solidarizează cele două piese, împiedicând alunecarea dopului în eprubetă şi un şurub ce se înfiletează în prelungirea tubulară a dopului metalic (Fig. 2.1.). Acest sistem multiplu de închidere are rolul de a izola complet conţinutul tubului de atmosfera internă din camera de ultracentrifugare şi, totodată, poate fi utilizat pentru elimi-narea aerului şi echilibrarea eprubetelor, înainte de ultracentrifugare (excesul de mediu se e-limină, sub formă de picături, prin prelungirea tubulară a dopului metallic, în urma presării uşoare a dopului).

Surub

P ic ãturã demediu e liminatã

prin presareadopului

Dopmetalic

P iulitã

Garniturãde c auc iuc

Fig. 2.1. Aspectul tubului de ultracentrifugare şi a sistemului său de închidere

2.1. Medii de ultracentrifugare

Dacă la centrifugarea obişnuită, pentru separarea particulelor celulare, se utilizează medii omogene din punct de vedere a densităţii (de exemplu, soluţie de zaharoză 0,25 M), la ultracentrifugare se utilizează medii neomogene, adică medii care prezintă un gradient de densitate (diferenţă de densitate) pe verticală (în înalţimea coloanei de mediu). După modul în care variază gradientul, se disting două tipuri de medii cu gradient de densitate, care, în ordinea utilizării şi a capacităţii lor de separare a particulelor, sunt: mediul cu gradient discontinuu de densitate şi mediul cu gradient continuu de densitate.

2.1.1. Mediul cu gradient discontinuu de densitate

În cadrul mediului cu gradient discontinuu de densitate, densitatea variază brusc (descreşte) pe verticală, între fazele cu densitati diferite apărând limite nete (interfeţe) de se-paraţie.

Aspectul unui astfel de mediu, realizat din trei soluţii de zaharoză cu densitati (concentraţii) diferite, este prezentat în Fig. 2.2. A

Zaharozã0,25M

Zaharozã1,25M

Zaharozã2,30M

L imite deseparatie între

faze

a

b

c

G

A B

Fig. 2.2. Mediul cu gradient discontinuu de densitate (A) şi separarea componentelor celulare într-un astfel de mediu, prin ultracentrifugare (B)

Dacă, utilizand acest mediu, se ultracentrifughează o fracţiune iniţială, depusă pe suprafaţa sa (la suprafaţă soluţiei cu densitatea cea mai mică), se constată că, în timpul procesului, din această fracţiune se separă particule care migrează în masa mediului, cu viteze şi pe distanţe diferite, în funcţie de masa şi densitatea acestora: particulele cu densitatea cea mai mică se depun la limita de separaţie dintre soluţiile de zaharoză cu concentraţiile 0,25 M şi 1,25 M, particulele cu densitate mai mare se etalează la interfaţa dintre soluţiile de zaharoză 1,25 M şi 2,30 M, iar particulele cele mai dense străbat toate fazele de densitate, depunându-se pe fundul eprubetei (formează un sediment „clasic”, întâlnit şi în centrifugările obişnuite) (Fig. 2.2. B).

Se poate afirma deci că, prin ultracentrifugare în mediul cu gradient discontinuu de densitate, se obţine un număr de fracţiuni egal cu numărul fazelor distincte de densitate pe care le conţine mediul respectiv.

În general, la ultracentrifugare, fiecare particulă se depune în masa mediului exact în punctul în care densitatea sa proprie este egală cu densitatea mediului (punct izopicnic).

Particulele separate prin ultracentrifugare, într-un astfel de mediu, poartă numele de microzomi. Microzomii sunt reprezentaţi de fragmentele de membrane care delimitează or-ganite celulare de mari dimensiuni (reticul endoplasmatic, aparat Golgi) şi care nu persistă sub formă aplatizată în mediu, ci se închid sub forma unor structuri veziculare, diferite ca dimensiuni; dintre microzomi fac parte şi agregatele ribozomale, de diferite tipuri.

În exemplul din Fig.10B, cele trei fracţiuni microzomale figurate (a, b şi c), repre-zintă:

fracţiunea a – microzomi cu membrană netedă (proveniţi din saculii golgieni şi REN); fracţiunea b – microzomi cu membrană acoperită de ribozomi, rugoasă (proveniţi din

REG); fracţiunea c – agregate ribozomale de diferite forme şi dimensiuni (polimeri ribozomali

şi poliribozomi).

Prepararea mediului cu gradient discontinuu de densitate se realizează foarte simplu, manual (Fig. 2.3. A şi B): se pipetează soluţia cea mai concentrată de zaharoză (2,30 M), menţinând pipeta şi tubul de ultracentrifugare în poziţie verticală (Fig. 2.3. A); pen-tru pipetarea soluţiilor de zaharoză de concentraţii mai mici (următoarele faze de densitate), se înclină eprubeta la un unghi cât mai ascuţit faţă de orizontală, se sprijină vârful pipetei pe gura eprubetei şi se lasă să se scurgă soluţia mai diluată, cât mai lent, peste soluţia mai con-centrată (Fig. 2.3. B). Procedând în acest fel se evită amestecul fazelor cu densitate diferită şi se prepară un mediu cu gradient discontinuu corespunzător.

Zaharozã2,3M

Zaharozã1,25M

P ipetã

Eprubetãde

ultrac entrifugare

BA

Fig. 2.3. Prepararea mediului cu gradient discontinuu de densitate

2.1.2. Mediul cu gradient continuu de densitate

În cazul acestui mediu, densitatea descreşte continuu şi discret pe verticală, de la ba-za spre partea superioară a tubului de ultracentrifugare, nemaiapărând limite de separaţie în-tre fazele cu densitati diferite. Un exemplu de astfel de mediu, realizat din două soluţii de za-haroză (20% şi 5%) este prezentat în Fig. 2.4. Mediul cu gradient continuu de densitate se poate utiliza în continuarea mediului cu gradient discontinuu, oricare dintre fracţiunile microzomale rezultate în urma ultracentrifugării putând fi re - centrifugate în mediul cu gradient continuu.

G

Zaharozã5%

Zaharozã20%

a

b

c

d

e

f

Fig. 2.4. Aspectul mediului cu gradient continuu de densitate şi separarea componentelor celulare prin ultracentrifugare într-un astfel de mediu

Fracţiunile obţinute utilizând un astfel de mediu (b, c, d, e, f), separate prin ultracen-trifugarea fracţiunii iniţiale a, poartă numele de ultramicrozomi. Spre deosebire de fracţiuni-le microzomale, rezultate în urma ultracentrifugării în mediul cu gradient discontinuu de den-sitate, prin ultracentrifugare în mediul cu gradient continuu se obţine un număr nedefinit de fracţiuni, dar egal cu numărul punctelor izopicnice care se stabilesc între particule şi mediu.

Prepararea mediului cu gradient continuu de densitate este mai complicată şi ne-cesită utilizarea unui dispozitiv special conceput in acest scop (Fig. 2.5.).

Zaharozã5%

Zaharozã20%

Eprubetãde

ultrac entrifugare

M ediu c u gradientc ontinuu de dens itate

Robinet Tubdec olec tare

P aletã deames tecAB

Fig. 2.5. Dispozitiv de preparare a mediului cu gradient continuu de densitate

Acest dispozitiv, de plexiglas, conţine în interior doi cilindri verticali (A şi B), în care se

introduc cele două soluţii de zaharoză cu concentraţii diferite (20%, si respectiv 5%), din care se prepară mediul; cilindrii sunt conectati printr-un canal circular, care se prelungeşte şi se deschide pe o latură a dispozitivului. La acest nivel se introduce un tub elastic, prin intermediul caruia se colectează mediul rezultat în urma amestecului, într-un tub de ultracentrifugare.

În condiţiile în care robinetul care obturează comunicarea dintre cei doi cilindrii este deschis, iar paleta de amestec, ce pătrunde în soluţia concentrată de zaharoză, este acţiona-tă de un motor electric, soluţia de zaharoză 5% pătrunde în cilindrul A şi este amestecată cu soluţia de zaharoză mai concentrată, aceasta diluându-se treptat şi continuu. Dacă debitul de pătrundere a soluţiei diluate în cilindrul A este egal cu debitul de evacuare a amestecului din acelaşi cilindru, mediul cu gradient continuu, preparat la acest nivel, este colectat în tubul de ultracentrifugare.

Lucrarea de laborator 3

Analiza ultracentrifugatului

Studiul fracţiunilor ultramicrozomale rezultate în urma ultracentrifugării în mediul cu gradient continuu de densitate se poate realiza, în principiu, pe douä căi:

prin metode fizico-chimice; prin metoda spectrofotometrică.

3.1. Principiul metodei spectrofotometrice

Metoda spectrofotometrică constă în determinarea valorii extincţiei (absorbţiei) unei radiaţii monocromatice, absorbtie produsa de structura chimică spaţială (tridimensională) a unui cornpus aflat în soluţie.

Fiecare substanţă prezintă un optimum de absorbţie pentru o radiaţie cu o lungime de undă determinată (radiaţie monocromatică). Totuşi, acelaşi compus poate absorbi mai mult sau mai puţin lumina cu lungime de undă caracteristică, în funcţie de concentraţia sa. Deci, prin analiza spectrofotometrică se poate stabili in final concentraţia compusului investigat în soluţia de lucru (pe baza interpolării extincţiilor obţinute într-o aşa - numită curbă etalon, construită în prealabil).

Deoarece analiza spectrofotometrică a întregului ultracentrifugat nu se poate realiza într-o etapă unică (datorită heterogenităţii sale, care implică apariţia concomitentă a mai multor absorbţii, la o lungime de undă dată), este necesar ca, iniţial, conţinutul tubului de ultracentrifugare să fie divizat şi distribuit în mai multe volume mici, egale, în eprubete de colectare, urmând ca ulterior aceste volume de lichid să fie spectrofotometrate, pe rând. Fragmentarea ultracentrifugatului în aceste volume egale se realizează numai cu ajutorul unui dispozitiv special, numit micropompă peristaltică.

Micropompa peristaltică funcţionează în modul următor: prin rotaţia piesei mobile faţă de o piesa fixă, se crează o forţă de absorbţie şi împingere prin care ultracentrifugatul este aspirat prin extremitatea unui tub elastic, care este introdusă în ultracentrifugat, până în partea bazală a eprubetei de ultracentrifugare. La extremitatea opusă a tubului ce se interpune între cele două piese, ultracentrifugatul antrenat se scurge sub formă de picături ce se colectează în mai multe eprubete, în număr egal (deci, în volume egale); micropompa peristaltică este o pompă aspiratoare-respingătoare; cilindrii care unesc cele două plăci ale piesei rotative au o mişcare de sens contrar faţă de mişcarea piesei în ansamblu, permiţând

astfel menţinerea tubului în poziţie fixă (Fig. 3.1.).

După cum s-a menţionat, fracţiile obţinute în urma distribuţiei ultracentrifugatului sub forma mai multor volume egale vor fi ulterior analizate spectrofotometric, succesiv, la o lungime de undă determinată si caracteristica.

P iesã fixã

P iesãrotativã

C ilindri

Tub de c entrifugarec u ultrac entrifugat

Eprubete de c olec tarea ultrac entrifugatului

1 2 3 4 etc .

P ic ãturi

Tub pentru abs orbtia s idis t ibutia ultrac entrifugatului

Fig. 3.1. Micropompa peristaltică

Extincţiile obţinute vor fi utilizate apoi pentru construirea unui grafic, pe baza căruia se pot figura, după desenarea eprubetei de ultracentrifugare, atât poziţia, cât şi concentraţia diferitelor fracţiuni în coloana de mediu cu gradient continuu de densitate. Graficul obţinut are forma unei linii frânte (zig-zag); vârfurile (peak-urile) acestui grafic, corespunzătoare extincţiilor maxime obţinute, reflecta zonele de concentraţie crescută a particulelor în mediu (atât poziţia, cât şi densitatea fracţiunilor ultramicrozomale) (Fig. 3.2).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1,6

1,8

2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

E prubete

Ex

tin

cti

e(E

)

Fig. 3.2. Grafic reprezentând poziţia şi concentraţia fracţiunilor ultramicrozomale, obţinutîn urma analizei spectrofotometrice

3.2. Schema constructivä a spectrofotometrului

Spectrofotometrul utilizat în această lucrare (Beckman DB) posedă câte o sursă de lumină pentru cele două domenii spectrale în care funcţionează — ultraviolet şi vizibil (UV şi VIS).

Sursele de lumină emit radiaţii compuse (policromatice), care ajung la nivelul unui sistem de prisme (monocromator), care transformă aceste radiaţii în fascicule monocromatice, cu lungimea de undă dorită. Radiaţiile monocromatice sunt reflectate, în continuare, de o oglindă plană cu unghi variabil; o parte dintre ele străbat două fante şi ajung la nivelul celor două cuve ale aparatului (cuva cu etalonul - E şi cuva cu proba de analizat - P). Mediile din cele două cuve absorb în mod diferentiat radiaţiile incidente, astfel încât radiaţiile emergente (care ies din cuve) sunt inegale ca intensitate. Aceste radiaţii excită două celule fotoelectrice, care transformă semnalul luminos într-un curent electric cu intensitate variabilă, ce pune în mişcare acul indicator, pe scala dublă a spectrofotometrului: scala transrnisiei (T), în partea inferioară şi scala extincţiei (absorbţiei - A), în partea superioară. Extincţia variază logaritmic, având valoarea maximă 2, pe când transmisia este înscrisă procentual, de la 1 Ia 100% (Fig. 3.3.).

Înainte de citirile propriu-zise, se reaIizează etalonarea aparatului, in vederea

stabilirii cuantumului de extincţie datorat etalonului.

In cazul de faţă, etalonarea se face cu apă distilată

Atât etalonarea, cât şi determinarea extincţiei probelor, se realizează la (lungimea de undă) de 260 nm (în UV), această valoare fiind caracteristică pentru moleculele de ARN prezente în compoziţia ultramicrozomilor separaţi.

0.05

.1

.2.3.4.5

.6.8

.9.7

12

Radiatiepolic romatic ã

Radiatiemonoc romatic ã

M onoc romator

EP10

0

2030 40 50 60

90100%

7080 A

TCuve

Fante

Oglindã

Surs ã deluminã

(U V -V IS )

Celulefotoelec tric e

Fig. 3.3. Schema constructiva a spectrofotometrului BECKMAN DB

Lucrarea de laborator 4

Determinarea respiraţiei celulare (metoda Warburg)

Respiraţia celulară reprezintă totalitatea proceselor de oxido - reducere care au loc la nivelul unor compartimente celulare specializate (în general, mitocondrii), procese care furnizează cea mai mare parte a energiei necesare desfăşurării activităţilor celulare vitale.

La organismele aerobe, respiraţia se desfăşoară în două etape distincte:

etapa anaerobă - in care substraturile nutritive sunt descompuse până la produşi intermediari de catabolism (această etapă este asimilată frecvent cu glicoliza anaerobă, sau, în unele cazuri, cu procesul de fermentaţie); randamentul energetic al respiraţiei anaerobe este relativ scăzut;

etapa aerobă - prin care produşii intermediari rezultaţi din prima etapă sunt transformaţi în produşi finali de catabolism (apă şi bioxid de carbon), prin parcurgerea etapelor de reacţie ale ciclului Krebs şi ale lanţului transportorilor de electroni; randamentul energetic al acestei etape este superior faţă de cel al respiraţiei anaerobe.

Deoarece aprecierea intensităţii respiraţiei celulare, prin investigarea tuturor reacţiilor biochimice care o caracterizează, este dificil de realizat, determinarea acestui proces se face în mod curent prin măsurarea manifestărilor sale exterioare, în mod frecvent a schimburilor de gaze dintre celule şi mediu (consumul de O2 sau eliminarea de CO2), într-o unitate determinata de timp.

Una dintre cele mai utilizate metode de determinare a respiraţiei celulare este metoda Warburg (microrespirometrică), utilizata pentru măsurarea schimburilor gazoase ale unei cantităţi reduse de material biologic: un fragment de organ animal sau vegetal, o cultură de microorganisme, o suspensie planctonică etc.

4.1. Principiul metodei Warburg

Metoda Warburg este o metodă manometrică, bazată pe măsurarea variaţiilor presiunii parţiale ale oxigenului (pO2) faţă de presiunea atmosferică, la volum constant şi temperatură constantă (V = ct şi T0 = ct).

Aparatul Warburg, folosit în acest scop, cuprinde următoarele componente principale:

baie de apă termostatată, prevăzută cu termometru de contact (pentru termostatare);

rezistenţă electrică, pentru încălzirea apei; dispozitiv mecanic de agitare; manometre pentru determinarea variaţiilor pO2 (sau pCO2).

Manometrele aparatului Warburg sunt construite din sticlă, fiind alcatuite din două braţe verticale ce se unesc în partea inferioară, unde se continuă cu o scurtă prelungire la

care se ataşează rezervorul cu lichid manometric (un tub de cauciuc elastic); nivelul lichidului manometric poate fi controlat prin presarea rezervorului elastic, cu ajutorul unui dispozitiv (şurub).

Cele două braţe ale manometrelor sunt diferite: unul dintre braţe (B) este permanent deschis, presiunea atmosferică exercitându-se asupra lichidului manometric din acesta; cel de-al doilea braţ (A) prezintă un diverticul lateral cu o dilataţie la capăt, ce serveşte la ataşarea vasului de respiraţie cu materialul biologic; deasupra acestui diverticul există un robinet, care, în funcţie de poziţie, obturează sau nu comunicarea cu aerul atmosferic. Ambele braţe sunt notate cu diviziuni liniare (mm şi cm), de la diviziunea 0 la diviziunea 30 (cm). În momentul începerii determinării (t0), nivelul lichidului manometric se aduce la diviziunea 15, în ambele braţe (fig. 4.1.).

150 mm

300 mm

0 mm

Brat delegãturã

Robinet

L ic hidmanometric

(B rodie)

Rezervor

Surub de presare

Vas derespiratie

BA

Fig. 4.1. Aspectul manometrelor aparatului Warburg

Volumul constant (Vc) în care se apreciază consumul de oxigen al celulelor (şi, deci, modificările pO2, conform principiului metodei), cuprinde următoarele segmente: porţiunea din braţul A de la nivelul lichidului manometric (diviziunea 15) până la robinet în poziţie închisă, volumul interior al braţului lateral şi volumul vasului de respiraţie.

Înainte de utilizare, toate manometrele se etalonează cu mercur, la temperatura de lucru (de exemplu, 370C pentru ţesuturile de mamifere).

Etalonarea se realizează prin umplerea manometrului, cât şi a vasului de respiraţie corespunzător, montat la diverticulul lateral, cu o cantitate cunoscută de Hg. Prin etalonare

se stabilesc două constante: volumul total al manometrelor (Vt) şi volumul unei diviziuni – 1 mm liniar (Vdiv).

Lichidul manometric utilizat pentru măsurători – lichidul Brodie întruneşte două calităţi, care-l recomandă pentru utilizarea in acest scop: este suficient de fluid pentru a se mişca cu uşurinţă în manometru, înregistrând cea mai mică variaţie de presiune a O2 şi are o tensiune superficială suficient de mare pentru a nu se volatiliza în aerul din volumul constant al manometrului şi, în acelaşi timp, pentru a împiedica difuziunea moleculelor de gaz în masă sa.

Aceste calităţi sunt asigurate de compoziţia sa chimică: 5g taurocolat de sodiu, 23g NaCl/500ml apă distilată, o picătură de eozină pentru coloraţie şi 2-3 cristale de timol pentru conservare; densitatea lichidului Brodie este 1,034 iar presiunea sa echivalentă (1 atm) este de 10.000 mm coloana lichid.

4.2. Înregistrarea variaţiilor pO2

În condiţiile în care robinetul este închis (se delimitează Vc), consumul de O2 de către celule face ca pO2 din Vc să scadă, lichidul manometric urcând în braţul A cu înălţimea h şi scăzând în braţul B cu o înălţime echivalentă (- h) în intervalul de determinare (Fig. 4.2. a).

Această creştere a înălţimii lichidului Brodie în braţul A înseamnă, de fapt, reducerea valorii Vc (enunţată anterior); de aceea, la sfârşitul intervalului de determinare propus, prin uşoara deşurubare a piesei de presare a rezervorului, se readuce nivelul lichidului la diviziunea de start (15 cm) în braţul A, fapt care antrenează o scădere echivalentă a înălţimii lichidului în braţul B (în care lichidul Brodie înregistrează o scădere totală egală cu – 2h) (Fig. 4.2.b).

În concluzie, măsurarea variaţiilor pO2 nu se realizează în mod direct, pe braţul A (aflat în legătură cu ţesutul), ci indirect, pe braţul deschis (B), apreciindu-se de fapt creşterea presiunii atmosferice în raport cu pO2, exercitată prin presiunea hidrostatică a coloanei de lichid manometric.

+h

-h-2h

A B

Fig. 4.2. Măsurarea consumului de oxigen prin variaţiile înălţimii coloanei lichidului Brodie

Consumul de oxigen, în intervalul de timp propus pentru determinare, se apreciază prin formula:

Consum de O2 (mm ) = h x c3

în care:

h = scăderea înălţimii coloanei de lichid Brodie în braţul B;

c = constanta manometrului (o mărime caracteristică fiecărui instrument de măsură în parte, care reflecta corelaţia între presiune, temperatură şi volum).

c se calculează din următoarea formulă:

c ________________________________(V t - V l) x + V l x _________273

273 + t0

10000=

unde:

Vt = volumul total al manometrului (care coincide, în formulă, cu Vc);

Vl = volumul lichidelor din vasul de respiraţie plus volumul materialului biologic;

273 = temperatura absolută, exprimată în 0Kelvin (00C);

273 + t0 = temperatura de lucru (370C pentru ţesuturile de mamifere);

= coeficientul de solubilitate Bunsen (ce exprimă solubilitatea unui gaz într-un lichid, în funcţie de temperatură); de exemplu, pentru O2 = 0,024 (la 370C, în tampon fosfat).

4.3. Etape de lucru

se sacrifică animalul de experienţă şi se prelevează 2-3 organe diferite în soluţie tampon fosfat răcită la gheaţă (preparată din 81,8ml Na2HPO4 M/15 şi 18,2ml KH2

M/15); se completează vasele de respiraţie cu amestecul corespunzător (0,2ml KOH 20

– 60%, introdus în incinta centrală a vasului pentru absorbţia CO2 degajat şi 5ml tampon fosfat, pipetat în restul vasului);

se cântăresc câte 0,5 g din organele luate în lucru, se taie în fragmente mai mici şi se introduc cu pensa în tamponul fosfat din vasele de respiraţie (Fig. 4.3.);

‘

Inc intãc entra lã

Solutie K OH(20 sau 60%)

Fragmente de organ (0,5g)

Solutie tamponfos fat (5ml)

Fig. 4.2. Aspect schematic al unui vas de respiraţie si al conţinutului acestuia

vasele de respiraţie, împreună cu conţinutul, lor se montează, prin gresare cu vaselină, la extremitatea dilatată a diverticulului lateral al manometrelor cores - punzătoare;

odată pregătite, manometrele se ataşează, prin înşurubare, la rama dispozitivului de agitare;

se porneşte dispozitivul de agitare mecanică şi, timp de 15min, ţesuturile se lasă la incubat în baia de apă, cu robinetele deschise (pentru acomodarea lor cu temperatura de lucru);

după 15min, robinetele se închid şi se măsoară periodic (din 15 în 15min) valorile denivelărilor lichidului Brodie apărute la nivelul fiecărui manometru;

rezultatele (h) obţinute se trec într-un tabel, pe baza căruia se calculează consumul de O2, conform formulei enuntate mai sus.

Observaţie

În afară de manometrele asociate cu probele se utilizează şi un manometru martor, numit termobarometru (TB), necesar înregistrării variaţiilor de moment ale presiunii gazelor, produse, cel mai frecvent, de o dilataţie gazoasă determinată de temperatură; modificările lui h, obţinute pe TB, se scad, sau se adună (după caz), la valorile lui h înregistrate pe manometrele cu probe. În vasul de respiraţie cuplat la TB nu se introduce material biologic (sau, se introduc fragmente de organe, dar acestea se inactivează în prealabil, prin fierbere).

4.4. Exemplu de tabel de calcul al consumului de O2

Manometrul Organ hCorecţia 1 – c1

(hprobă + hTB)Corecţia 2 – c2

(c1 x Vdiv)Consum O2

(mm3) (h x c)

1

2

etc.

TB

ficat

-

-

-

-

-

-

-

-

4.5. Valori ale constantelor manometrelor (c) şi ale unei diviziuni liniare (1mm)

Manometrul c Volumul unei diviziuni

liniare (mm3)

1 2,0287 0,012

2 2,0461 0,011

3 1,7159 0,011

4 1,2709 0,012

5 1,8100 0,011

6 1,2708 0,011

Lucrarea de laborator 5

Determinarea concentraţiei acizilor nucleici (metoda Spirin)

Spre deosebire de alte metode similare, metoda Spirin reprezinta o modalitate simplă şi directă de determinare a concentraţiei acizilor nucleici (ADN şi ARN) dintr-o cantitate determinată de material biologic. Specificul acestei metode constă în complexitatea calculului final, prin care se realizează aprecierea cantitativă a concentraţiei fiecărui tip de acid nucleic prezent în amestecul de extracţie.

5.1. Principiul metodei

Metoda Spirin constă în extracţia şi hidroliza concomitentă a ADN-ului şi ARN-ului din materialul biologic cu acid percloric, prin fierbere la 1000C.

După extracţie şi hidroliză, amestecul de nucleotide rezultat este supus unei analize cantitative spectrofotometrice, absorbţia fiecărei probe fiind determinată la două lungimi de undă diferite, în UV (1 = 270nm şi 2 = 290nm).

5.2. Reactivi necesari

Acid percloric (HClO4) 0,5N

5.3. Etape de lucru

se sacrifică animalul de experienţă şi se prelevează fragmente foarte mici de organe, direct pe sticle de ceas;

fragmentele prelevate se cântăresc la balanţa de torsiune (pentru fiecare, o cantitate foarte redusă, cuprinsa între 5 – 20 g);

fragmentele cântărite se omogenizează cu sticlă pisată, în mojare; mojaratele se antrenează cu 5ml HClO4 0,5N, în eprubete de centrifugare; probele obţinute se introduc în baia de apă aflată la 1000C şi se incubează 30min;

eprubetele se răcesc cu jet de apă şi, după echilibrare, se centrifughează (4000rpm / 10min);

supernatantele obţinute (extractele hidrolizate de acizi nucleici) se decantează în noi eprubete şi, după transvazare în cuvele spectrofotometrului, probele se spectrofotometrează pe rând, la cele două lungimi de undă menţionate; etalonarea se face cu apă distilată.

5.4. Calculul concentraţiei acizilor nucleici

Determinarea concentraţiei acizilor nucleici din extractele obţinute nu se realizează direct, ci în două etape distincte de calcul:

1. determinarea concentraţiei fosfatului din acizii nucleici, după următoarea formulă:

unde:

CP-AN = concentraţia fosfatului din acizii nucleici, exprimată în g/ml;

E270 = extincţia extractului hidrolizat la 270nm;

E290 = extincţia extractului hidrolizat la 290nm;

0,19 = indicele extincţiei specifice.

2. determinarea propriu-zisă a concentraţiei acizilor nucleici, ce se poate realiza pe două cai diferite:

a. determinarea concentraţiei mediei a ADN şi ARN, conform formulei:

CAN (g/ml) = 10,3 x CP-AN

unde:CAN (g/ml) = concentraţia medie a celor doi acizi nucleici, exprimată în g/ml;

10,3 = coeficientul mediu de transformare.

b. determinarea concentraţiei fiecărui acid nucleic în parte, conform formulelor:

CP – AN (g/ml) =

E270 – E290

0,19

CARN (g/ml) = 10,5 x CP-AN

CADN (g/ml) = 10,1 x CP-AN

unde:CARN (g/ml) = concentraţia ARN, exprimată în g/ml;

CADN (g/ml) = concentraţia ADN, exprimată în g/ml;

10,5 = coeficient specific de transformare pentru ARN;

10,1 = coeficient specific de transformare pentru ADN-ului.

Valoarea coeficientului specific de transformare este diferită pentru cei doi acizi nucleici, deoarece s-a constatat, în soluţii pure, că extincţia unui extract de ADN este diferită de cea a unui extract de ARN, ca urmare a unei proporţii diferite a fosfatului la nivelul nucleotidelor specifice.

Astfel, coeficientul specific de transformare pentru ARN este 10,5 deoarece conţinutul procentual al fosfatului este de 9,5% în acest acid nucleic, iar cel a ADN-ului este 10,1 deoarece conţinutul procentual al fosfatului în acest acid nucleic este de 9,9%.

Lucrarea de laborator 6

Determinarea concentratiei proteinelor celulare solubile (metoda Lowry modificată)

În funcţie de amploarea lor, metodele de determinare a concentratiei proteinelor

celulare solubile se pot clasifica în două mari categorii: metode de ansamblu – prin care se dozează concentratia de proteine totale

dintr-o cantitate de material biologic (ţesut, organ); metode de detaliu – prin care se realizează analiza cantitativă a unei clase

de proteine, sau chiar a unei proteine specifice, dintr-o cantitate determinata de material biologic.

Metoda Lowry se bazează pe analiza fotocolorimetrică a proteinelor solubile, extrase din materialul biologic prelucrat, proteine evidenţiate prin coloraţii specifice cu reactivi diferiţi de culoare. În prealabil, în vederea colorării, materialul biologic, prelevat în condiţii adecvate, este omogenizat, tratat cu reactivi de solubilizare a proteinelor şi hidrolizat.

6.1. Principiul metodei fotocolorimetrice

Metoda fotocolorimetrică constă în determinarea absorbţiei (extincţiei) unei radiaţii monocromatice specifice, produsa de intensitatea culorii compusului analizat, aflat în soluţie. Deoarece intensitatea coloraţiei este proporţională cu concentraţia compusului analizat în soluţie, rezultă că, în final, prin fotocolorimetrie se determină concentraţia compusului respectiv, in mod indirect (similar metodei spectrofotometrice).

6.2. Reactivi necesari

soluţie tampon fosfat cu pH 7,2 (preparată prin amestecul a 81,8ml soluţie Na2HPO4 M/15 şi 18,2 ml KH2PO4 M/15);

soluţie NaOH 2% (reactiv de hidroliză); reactivi de culoare. Se utilizează, în ordine, doi reactivi de culoare:

A] reactivul de culoare 1 preparat prin amestecul următoarelor două soluţii:

a] Na2CO3 10% în NaOH 0,5N

b] CuSO4 x 5 H2O 0,5% în citrat de Na 1% În momentul utilizării, se amestecă 10 ml soluţie a] cu 1 ml soluţie b].

Reactivul de culoare 1 este specific pentru aminoacizii alifatici din compoziţia pro-teinelor.

B] reactivul de culoare 2 – reactivul Folin-Ciocâlteu (amestec de acid fosfo-woframic cu acid fosfo-molibdenic).

Acest reactiv colorează specific aminoacizii aromatici din proteine.

Înainte de utilizare, reactivul 2 se diluează (1ml reactiv Folin-Ciocâlteu + 10ml H2O distilată).

6.3. Etape de lucru

se sacrifică animalul de laborator şi, după incizarea medio-ventrală, se prelevează 2-3 organe diferite în soluţie tampon fosfat, răcită la gheaţă;

se cântăreşte o cantitate de 0,5 g din fiecare organ; organele se omogenizează, prin mojarare cu sticlă pisată, până la obţinerea unei

paste fine; mojaratul se antrenează, prin spălare atentă şi integrală, în eprubete de centrifugare;

rezultă o primă diluţie a materialului biologic – diluţia omogenatului (D1):

D1 = 1 / 10 (0,5g ţesut + 4,5ml soluţie tampon fosfat);

se centrifughează probele, 5 min la 4000 rpm; se realizează hidroliza extractelor proteice obţinute: în noi eprubete se pipetează câte

0,5 ml din supernatantele corespunzătoare şi 2,5 ml soluţie NaOH 2%; probele se lasă un scurt timp în repaus, până la clarificarea soluţiilor. Se obţine, aşadar, o a doua diluţie succesivă a materialului – cea a hidrolizatului (D2):

D2 = 1 / 6 (0,5ml supernatant + 2,5ml soluţie NaOH);

probele obţinute se colorează în două etape succesive, cu cei doi reactivi de culoare specifici:

o pentru reacţia cu reactivul de culoare 1, în noi eprubete (câte două pentru fiecare probă), se introduc: 0,5ml hidrolizat proteic şi 0,5ml reactiv de culoare 1; amestecul se agită şi probele se lasă 10 min în repaus, în stativ, la finele acestui interval ele căpătând o coloraţie albastră-violacee, de diferite intensităţi;

o pentru reacţia cu reactivul de culoare 2, se adaugă câte 1,5 ml reactiv Folin-Ciocâlteu peste extractele proteice colorate deja cu reactivul de culoare 1. Pentru o bună fixare a acestui colorant, eprubetele se incubează în baia de apă 10 min, la 560C, apărând, în final, o coloraţie albastră-indigo. Dacă intensitatea culorii este prea puternică, probele se diluează cu apă distilată – diluţia colorantului (D3):

D3 = 1/ 10 (1ml soluţie proteică + 9ml H2O distilată);

se realizează determinarea extincţiei probelor, la = 540nm (domeniul albastru), după etalonarea aparatului cu apă distilată; dacă între probele de acelaşi tip (care provin din acelaşi organ) apar diferenţe de extincţie, se calculeaza o medie algebrică a acestui parametru;

rezultatele (extincţiile) obţinute se integrază în curbe etalon ale concentraţiei pro-teinelor solubile, construite pe baza extincţiilor unor soluţii de albumină cu diluţii diferite;

pentru determinarea concentraţiei reale de proteine solubile din fiecare probă, concentraţiile obţinute din curba etalon se înmulţesc cu produsul celor trei diluţii practicate succesiv în prelucrarea materialului biologic:

Dtotal = D1 x D2 x D3 = 1/10 x 1/6 x 1/10 = 1/600

Lucrarea de laborator 7

Dozarea activităţii succinat-dehidrogenazei (metoda Macovski)

Succinat-dehidrogenaza (succin-dehidrogenaza sau succinat-oxidoreductaza) este o enzimă care catalizează dehidrogenarea (oxidarea) acidului succinic la acid fumaric, conform următoarei ecuaţii chimice:

COOH

CH

CH

COOH

2

2

COOH

CH

CH

COOH

-2H

+2H

C

CH

H COOH

HHOOC

ac id suc c inic ac id fumaric (ac id trans - fumaric )

Acidul fumaric, datorită prezenţei unei duble legături între atomii de carbon C2 şi C3

din moleculă, se prezintă sub forma izomerului trans, foarte frecvent. Reacţia catalizată de succinat-dehidrogenază reprezintă o etapă a ciclului Krebs, prin care se realizează cuplarea acestuia cu lanţul transportului de electroni, la capătul căruia, prin reducerea unei molecule de oxigen activat, rezultă apa, ca produs final de catabolism.

Rolul de preluare a doi atomi de hidrogen de la substrat şi de transfer a acestora spre lanţul transportorilor de electroni este exercitat de către coenzima succinat-dehidrogenazei – FAD (flavin-adenin-dinucleotidul). Această grupare prostetică se poate reduce sau oxida cu uşurinţă, proporţia celor două forme ale sale (redusă şi oxidată) refectând echilibrul dintre procesele oxido-reducătoare mitocondriale:

-2H

+2HFA DH 2 FA D

formãredusã

formãox idatã

Succinat-dehidrogenaza, datorită implicării în procesele energogenetice celulare, este prezentă la nivelul cristelor mitocondriale, fiind răspândită cu precădere în celulele cu activitate metabolică intensă (din ficat, rinichi, splină, miocard şi musculatură striată, creier,

suprarenale etc.); de asemenea, enzima a fost identificată şi la plantele superioare (în albumenul seminţelor) şi la unele microorganisme.

În prezent, activitatea succinat-dehidrogenazei poate fi evidenţiată prin mai multe ti-puri de metode: manometrice, colorimetrice, spectrofotometrice.

7.1. Metoda Macovski

Este o metodă colorimetrică, derivată din metoda Thunberg, mai dificil de aplicat în condiţii obişnuite de laborator, deoarece presupune utilizarea unei instalaţii de vidare.

7.1.1. Principiul metodei Macovski

Metoda constă în măsurarea (cronometrarea) timpului de decolorare a unui compus colorat (albastru de metilen) în forma sa incoloră (leuco-albastru de metilen), ca urmare a reducerii, în condiţii anaerobe, a albastrului de metilen:

N

S(C H ) N3 2 N (C H ) C l+ -

3 2

N

S(C H ) N3 2 N (C H )3 2

FA DH 2 FA D

- H c l

H

albas tru de metilen leuc o - a lbas tru de metilen

Reducerea albastrului de metilen se realizează de către FADH2, coenzima încărcân-du-se, la rândul ei, cu hidrogen, în urma catalizării reacţiei de dehidrogenare a acidului succinic la acid fumaric. Se poate afirma că, in vitro, albastrul de metilen joacă rolul primului acceptor al lanţului transportorilor de electroni, FADH2 cedând 2 atomi de hidrogen acestui compus colorat. Condiţiile anaerobe, stipulate în principiul metodei, sunt absolut necesare, deoarece, în prezenţa oxigenului în incinta de reacţie, leuco-albastrul de metilen s - ar dehi-drogena, recolorându-se, ceea ce ar face ca reacţia de culoare sa fie nedecelabilă.

7.1.2. Reactivi necesari

soluţie tampon fosfat (81,8ml Na2HPO4 M/15 + 18,2ml KH2PO4 M/15); soluţie succinat de Na 0,02M (0,162g succinat de Na în 50ml H2O distilată); soluţie albastru de metilen 0,01%; soluţie alcalină de pirogalol, pentru absorbţia oxigenului din incinta de lucru

(3ml soluţie pirogalol 30% + 17,5ml KOH 60%); soluţie KOH 60%.

7.1.3. Etape de lucru

se sacrifică animalul de laborator şi se efectuează secţiunea pe linia medio-ventrală; se prelevează 2 – 3 organe în soluţie tampon fosfat, răcită pe gheaţă; se cântăresc câte 0,5 g din fiecare organ prelevat; se realizează omogenate tisulare, cu D = 1/10, prin metoda Potter (0,5g ţesut + 4,5ml

tampon fosfat); se completează vasele de reacţie (tuburile Macovski) cu componentele necesare;

aceste tuburi sunt nişte eprubete modificate, care prezintă un diverticul lateral oblic, menit introducerii unui component din amestecul de reacţie, care nu trebuie să se amestece de la inceput cu celelalte componente (Fig. 7.1.);

Dop de c auc iuc

Rulou de hîr tie defi ltru umec tat în

pirogalo l

Omogenat c elular(0,2 ml)

Suc c inat de N a(1 ml)

Tampon fos fat(1,3 ml)

A lbastru de metilen(1 ml)

Fig. 7.1. Tubul Macovski şi componentele amestecului necesar dozării activităţii succinat-dehidrogenazei

se realizează rulouri de hârtie de filtru, care se îmbibă în soluţie alcalină de pirogalol şi se introduc în partea superioară a tuburilor Macovski;

în final, tuburile Macovski se astupă cu dopuri de cauciuc, pentru a împiedica pă-trunderea aerului in interior;

Notă: în afară de probe, se foloseşte un tub martor, în care nu se introduce omogenat celular, sau se pipetează volumul corespunzător de omogenat, dar sursa de enzimă se inactivează în prealabil, prin fierbere.

tuburile se lasă în repaus 30 min., într-un stativ;

după expirarea acestui interval de timp, necesar exercitării activităţii succinat-dehidrogenazei asupra substratului (succinat de Na), eprubetele se înclină simultan, pentru ca albastrul de metilen să se scurgă peste restul componentelor de reacţie;

din acest moment, se cronometrează cu exactitate intervalul de decolorare a albastrului de metilen din probe, faţă de martor (în acesta compusul îşi modifică foarte puţin culoarea iniţială, datorită lipsei activităţii enzimei).

Bibliografie selectiva (curs si lucrari practice)

1. Alberts B., Bray D., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2004 – Essential Cell Biology, An introduction to the Molecular Biology of the Cell, International Student edition, Chapter 1: Introduction to Cells, Garland Publishing, Inc., New York, London, Tokio

2. Becker W. M., Kleinsmith L. J., Hardin J., 2003 – The World of the Cell, fifth edition, Pearson Education Inc., San Francisco, Ca

3. Pollard T. D., Earnshaw W. C., 2004 – Cell Biology, Elsevier Science (USA), Inc., Philadelphia

4. Petit J. M., Maftah A., Julien R., 1997 – Biologie cellulaire, Chapitre 2: Méthodes d’exploration de la cellule, Masson, Paris

5. Wilson J., Hunt T. , 2002 – Molecular Biology of the Cell, A Problems Approach, Fourth edition, Garland Science

6. Crăciun C., Florea A., Dragoş N., 1999 – Introduction to cell and molecular biology, Cluj University Press

7. Cruce M., 1999 – Biologie celulară şi moleculară, Aius, Colecţia Hipocrate, Craiova8. Teuşan V., 2000 – Biologie celulară animală, Editura Ion Ionescu de la Brad, Iaşi9. Neacşu I., Cimpeanu C. S., 1999 – Biologie celulară - lucrări practice, Editura Universitatii Al.

I. Cuza, Iaşi10. Cotruţ C., 1994 – Manual de lucrări practice de biologie celulară, Editura Tehnica, Chişinău11. http://web.mit.edu/esgbio/www/7001main.html, Hypertextbook Cell Biology12. http://www.univ-ag.fr/, Cours de Biologie cellulaire13. http://www.web-books.com/MoBio/Free/Contents.htm, Molecular Biology WebBook Contents14. http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/sommaires/bc.htm, Biologie Cellulaire15. http://schwann.free.fr/biocell03.html, Cours de Biologie Cellulaire