Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de ...

Proiect 42-133/2008:Bazele celulare si moleculare ale imbatranirii muschiului - SARCO

Program: Parteneriate in Domeniile Prioritare

Domeniul: 4 – Sanatate

Autoritatea contractanta: Centrul National de Management Programe (CNMP)

Durata: 2008-2011

Bugetul proiectului: 2.000.000 lei (de la Bugetul de stat)

Coordonator: Universitatea din Bucuresti, Departamentul de Biochimie, BCUM-BM

Director de Proiect: Dr. Emilia MANOLE, CS II, BCUM-BM si Sectia Biologie, Laboratorul de Medicina Moleculara, INCD Victor BabesTel.: 021-319.45.28, e-mail: [email protected]

Parteneri:P1 – Institutul National de Cercetare Dezvoltare in Domeniul Patologiei si Stiintelor Biomedical “Victor Babes” - Dr. Bogdan O. Popescu, CS IP2 - Spitalul Clinic Colentina - Dr. Rodica Marinescu

Rezumatul proiectului:

Sarcopenia (ansamblu de fenomene celulare si moleculare care duc la modificari majore in fibra

musculara, avand ca efect aparitia slabiciunii musculare si reducerea masei musculare) a devenit o

problema importanta de ingrijire medicala si devine cu atat mai serioasa cu cat speranta de viata a

polpulatiei creste. In aceste conditii, mentinerea sanatatii persoanelor de varsta a treia pentru o perioada

cat mai indelungata este foarte importanta, un rol major avandu-l mentinerea masei musculare in

parametri functionali. Musculatura scheletica reprezinta aproximativ 40% din greutatea corpului si in

afara de rolul esential in locomotie, mai joaca un rol in mentinerea caldurii corpului si regleaza

metabolismul.

In tara noastra patologia musculara este foarte putin abordata, iar fenomenul sarcopeniei n-a mai

fost studiat pana acum deloc. Din acest punct de vedere proiectul nostru este original si constituie o

noutate pentru Romania.

Pe plan european, studiile privind sarcopenia sunt tot mai multe, problemele segmentului

populatiei de peste 60 de ani preocupand tot mai mult autoritatile medicale si stiintifice.

mailto:[email protected]

Scopul proiectului nostru este acela de a contribui la aprofundarea cunostintelor legate de cauzele

celulare si moleculare ale imbatranirii muschiului, in perspectiva evidentierii unor metode de combatere a

acestor modificari si imbunatatirea calitatii vietii persoanelor varstnice.

Date fiind consecintele fenomenului complex de imbatranire a muschiului, ne propunem, ca

obiectiv principal, sa analizam modificarile celulare si moleculare de baza care se produc in fibra

musculara odata cu inaintarea in varsta. Intr-o prima faza vom analiza modificarile celulare care se produc

de-a lungul vietii in muschiul scheletic prin metode histologice, histochimice si histoenzimologice si de

microscopie electronica. Se vor urmari in special modificarile mitocondriilor si nucleilor (afectati in

primul rand in procesele distructive celulare). Ulterior, prin tehnici de imunohistochimie si Western

blotting, se va urmari expresia unor proteine citocheletale si functionale importante pentru buna

functionare a fibrei musculare, cum ar fi sarcoglicanii - alfa, beta, gama, delta, utrofina, distrofina,

caveolina 3, distroglicanii alfa si beta, talina, vinculina, desmina, actina alfa, miozina lantul greu, calpaina

3, nNOS, receptorii pentru acetilcolina. Se vor face de asemenea investigatii asupra procesului apoptotic,

prin analiza principalilor factori apoptotici, Bcl2 si Bax. Se va analiza expresia lor fenotipica si genotipica.

Expresia genotipica va fi analizata prin investigarea ARNm prin metoda PCR (RT-PCR).

La final se va face o comparatie intre datele de biologie celulara si moleculara ale fibrei musculare

de la subiecti de diferite varste luati in studiu, pentru a evidentia modificarile structurale care survin in

procesul imbatranirii in muschiul striat. Se va face o corelatie cu datele clinice, respectiv cu bolile de care

au suferit participantii la studiu si care ar putea influenta dezvoltarea/reducerea musculaturii, daca au avut

o viata sedentara sau au facut miscare, daca au avut o nutritie echilibrata. Concluziile finale vor aduce

clarificari cu privire la procesele celulare si moleculare care au loc in muschiul scheletic pe parcursul

vietii si in special dupa 60 de ani si vor deschide noi perspective in gasirea unor solutii de intarziere sau

ameliorare a proceselor de imbatranire a fibrei musculare.

Obiectivele generale si specifice ale proiectului:Obiectivul general al proiectului este: determinarea modificarilor celulare si moleculare din fibra

musculara striata in timpul imbatranirii, cu referire speciala la evidentierea expresiei fenotipice a

principalelor proteine structurale sarcolemale, costamerice, contractile si de la nivelul jonctiunilor

neuromusculare, ca si evaluarea procesului apoptotic.

Obiectivele s tiintifice specifice ale proiectului sunt:

1. Stabilirea unui model experimental de studiere a muschiului in imbatranire. Se va incepe prin trasarea

sarcinilor fiecarui partener prin intalniri de lucru cu responsabilii de proiect din partea fiecarui partener. Se

vor stabili principiile de formare a loturilor de studiu. Se vor pune la punct aspectele etice privind

protejarea subiectilor si recoltarea biopsiilor, in acord cu legislatia in vigoare.

2. Investigatii anatomopatologice ale biopsiilor musculare. Se vor urmari modificarile celulare, mai ales la

nivelul mitocondriilor, nucleilor, miofibrilelor, acumularii de glicogen, lipide sau tesut conjunctiv. Se vor

face investigatii electrono-microscopice de asemenea.

3. Introducerea tehnicii de imunohistochimie (IHC) cu marcare fluorescenta, in vederea stabilirii expresiei

fenotipice a proteinelor luate in studiu. Dorim sa vedem daca la nivelul diferitelor compartimente ale

fibrei musculare (sarcolema, costamere, miofibrile contractile, citosol, jonctiuni neuromusculare) exista

modificari ale cantitatii de proteine, daca aceasta scade, creste sau ramane neschimbata, in functie de

varsta subiectilor si de starea lor fiziologica.

4. Introducerea tehnicii Western blot (WB) pentru identificarea expresiei proteinelor musculare (calitativa

si cantitativa). Se va investiga in primul rand calpaina 3 (enzima musculara investigabila doar prin WB),

dar si proteinele cu expresie imunohistochimica incerta.

5. Introducerea tehnicii PCR (RT-PCR) in vederea analizei ARNm al miozinei-lantul greu si proteinelor

markeri ai apoptozei, Bcl-2 si Bax. Dorim sa investigam in acest fel prezenta apoptozei si intensitatea

fenomenului in functie de varsta subiectilor.

6.Validarea modelului experimental propus. Dupa ce toate metodele de investigare anatomopatologica, ca

si metodele de analiza moleculara a proteinelor musculare au fost folosite, se va face un studiu complex al

conexiunilor intre modificarile aparute in muschiul in imbatranire si se va trage o concluzie privind

modelul de studiu propus.

7. Dezvoltarea cunostintelor in domeniul stiintelor medicale, geneticii si biologiei moleculare.

8. Formarea resursei umane in domeniu.

9. Eliminarea decalajului existent fata de nivelul european in privinta serviciilor medicale, obiectiv aflat in

concordanta cu obiectivul programului de accelerare a procesului de aliniere si integrare tehnologica,

conform cerintelor si reglementarilor Uniunii Europene.

10. Formarea, dezvoltarea, integrarea si consolidarea unei retele de cercetare a caror activitate atinge

nivelul de excelenta, recunoscut conform normelor internationale.

Protocolul de lucru (vezi extrasul din Planul de activitati)

Extras din PLANUL DE REALIZARE A PROIECTULUIBazele celulare si moleculare ale imbatranirii muschiului - SARCO

Anul Etape/ Activitati Organizatia executanta

Termene Rezultate/Documente de prezentare a

rezultatelor

2009

Etapa ISTABILIREA MODELULUI EXPERIMENTAL

CO, P1, P2 15.01.2009 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.I.1Stabilirea loturilor de studiu

CO, P1, P2 Protocoale de lucru

A.I.2Stabilirea procedurilor de recoltare a probelor biologice

CO, P1, P2 Proceduri de recoltare

A.I.3Culegerea unor date clinice si fiziologice de la subiectii luati in studiu

CO, P2 nr pacienti introdusi in studiudate clinice si fiziologice

A.I.4Prelevarea de material biologic de la subiecti de diferite varste

P2 nr. probe prelevate

A.I.5Pregatirea probelor biologice

CO, P1, P2 nr. sectiuni; nr. probe incluzionate pentru microscopie electronica; nr. probe congelate

A.I.6Analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu

CO nr. probe analizate anatomopatologic

A.I.7Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei I

CO -plan de activitate pentru fiecare partener-demonstrarea eficientei interrelatiei intre parteneri-nr. pacienti; nr. probe; nr. analize

Etapa IIINVESTIGATII ANATOMOPATOLOGICE ALE BIOPSIILOR MUSCULARE

CO, P1, P2 27.11.2009 Raport de cercetare (etapa), RIA, documentatie economico-financiara

A.II.1Continuarea strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite varste

P2 nr pacienti introdusi in studiudate clinice si fiziologice

A.II.2Pregatirea probelor biologice


A.II.3Analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu


A.II.4Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor investigate prin IHF

CO, P1 protocol de lucru

A.II.5Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei II


2010

Etapa IIIINTRODUCEREA TEHNICII IHF SI WESTERN BLOT PENTRU IDENTIFICAREA EXPRESIEI PROTEINELOR MUSCULARE (CALITATIVA SI CANTITATIVA)

CO, P1, P2 10.12. 2010 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.III.1Continuarea strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite varste


A.III.2Pregatirea probelor biologice


A.III.3Analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu


A.III.4Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu

CO, P1 nr. sectiuni analizate prin IHF

A.III.5Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor fenotipice ale proteinelor prin WB

CO, P1 protocoale de lucru

A.III.6Integrarea datelor obtinute pana in acest moment

CO, P1, P2 studiu

A.III.7Evaluarea rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii

CO, P1, P2 studiu

A.III.8Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei III


2011

Etapa IVINTRODUCEREA TEHNICII PCR (RT-PCR) IN VEDEREA ANALIZEI ARNm AL MIOZINEI- LANTUL GREU SI PROTEINELOR MARKERI AI APOPTOZEI, Bcl-2 SI BAX

CO, P1, P2 30.05.2011 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara

A.IV.1Continuarea strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite varste


A.IV.2Pregatirea probelor biologice


A.IV.3Analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu


A.IV.4Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu


A.IV.5Analiza prin WB a proteinelor luate in studiu

CO, P1 Nr. studii WB

A.IV.6Optimizarea tehnicii PCR(RT-PCR) in vederea analizei ARNm al miozinei-lantul greu si proteinelor markeri ai apoptozei, Bcl-2 si Bax.

CO Protocoale de lucru

A.IV.7Analiza electrono- microscopica a modificarilor ultrastructurale ale fibrelor musculare

P1 nr. sectiuni analizate la microscopul electronic

A.IV.8Analiza prin PCR(RT-PCR) a ARNm pentru proteinele markeri ai apoptozei, Bcl-2 si Bax si pentru miozina-lantul greu

CO nr. studii PCR(RT-PCR)

A.IV.9Diseminare prin comunicare a rezultatelor

CO, P1, P2 - nr. articolenr. comunicari

A.IV.10Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei IV


Etapa VVALIDAREA MODELULUI EXPERIMENTAL

CO, P1, P2 30.09.2011 Raport de cercetare (etapa) si documentatie economico financiara; raport final de activitate.

A.V.1Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu


A.V.2Analiza prin WB a proteinelor luate in studiu

CO, P1 nr.probe analizate prin tehnica WB

A.V.3Analiza prin PCR(RT-PCR) a ARNm pentru proteinele markeri ai apoptozei, Bcl-2 si Bax si pentru miozina-lantul greu

CO nr studii PCR(RT-PCR)

A.V.4Analiza electrono- microscopica a modificarilor ultrastructurale a fibrelor musculare

P1 nr. sectiuni analizate la microscopul electronic

A.V.5Integrarea datelor anatomopatologice, proteomice si genomice

CO, P1, P2 Studiu

A.V.6Analiza functionala a modelului

CO, P1, P2 Studiu

A.V.7Validarea modelului experimental

CO, P1, P2 Studiu

A.V.8Diseminarea rezultatelor prin comunicare si publicare

CO, P1, P2 nr. articolenr. comunicari

A.V.9Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei V


Diseminarea rezultatelor proiectului:

COMUNICARI LA MANIFESTARI STIINTIFICE NATIONALE SI INTERNATIONALE

1. Gisela Gaina, Aura Mihalcea, Emilia Manole, Elena Ionica - Molecular diagnoses of dystrophin gene mutation using MLPA, 1st International Conference 2008 of the Cyprus Society of Human Genetics, Nicosia, Cyprus.

2. Gisela Gaina, Emilia Manole, Elena Ionica – The molecular diagnosis of muscular dystrophies in romanian patients, al 6-lea Simpozion National de Patologie, “Patologie celulara si moleculara” si Sesiunea Anuala a Institutului National “Victor Babes”, 3-5 noiembrie 2009, Bucuresti; prezentare orala – rezumatul in volumul de rezumate al simpozionului, pag. 24.

3. E. Manole, G. Gaina, B. O. Popescu - General indications for the muscle biopsy, al VIII-lea Congres al Societatii de Neurologie din Romania, 19-22 mai 2010, Bucuresti; prezentare orala

Rezumatul Rapoartelor de cercetare

Rezumatul Etapei 1 de executieDENUMIREA PROIECTULUI:BAZELE CELULARE SI MOLECULARE ALE IMBATRANITII MUSCHIULUIAcronim: SARCO

Director de proiect, Universitatea Bucuresti –BCUM-BM (UB): CS II, Dr. Emilia MANOLE Responsabil de proiect, Institutul National “Victor Babes” (INCD) : CS I, Dr. Bogdan O. POPESCUResponsabil de proiect, Spitalul Clinic Colentina (SCC): Dr. Rodica MARINESCU

RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - ETAPA 1, 15.01.2009Stabilirea modelului experimental.

OBIECTIVE GENERALE ALE PROIECTULUIStabilirea modelului experimental.

OBIECTIVELE SPECIFICE ALE ETAPEI 1

1. Stabilirea loturilor de studiu (CO, P1, P2)

2. Stabilirea procedurilor de recoltare a probelor biologice (CO, P1, P2)

3. Culegerea unor date clinice si fiziologice de la subiectii luati in studiu (CO, P2)

4. Prelevarea de material biologic de la subiecti de diferite varste (P2)

5. Pregatirea probelor biologice (CO, P1, P2)

6. Analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu (CO)

7. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei I (CO)

Rezumatul Etapei 1

Sarcopenia este procesul degenerativ de pierdere a masei si fortei ca urmare a imbatranirii. Este un proces

atat de plurivalent incat nu exista criterii clare pentru definitia sa clinica si nici nu se cunosc toate

mecanismele care duc la slabiciunea musculara a varstei inaintate. Ne-am propus abordarea fenomenului

de imbatranire musculara pe multiple planuri. In aceasta etapa ne-am ocupat de initierea unor protocoale

de lucru privind prelevarea si procesarea biopsiilor musculare de la persoane de diferite varste (cuprinse

intre 20-70 de ani).

In aceasta etapa, obiectivul general a fost stabilirea modelului experimental. Pentru indeplinirea

acestuia, s-au formulat 7 Obiective specifice ale etapei si anume: stabilirea loturilor de studiu, stabilirea

procedurilor de recoltare a probelor biologice, culegerea unor date clinice si fiziologice de la subiectii luati

in studiu, prelevarea de material biologic de la subiecti de diferite varste, pregatirea probelor biologice,

analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu si demonstararea functionalitatii modelului la

sfarsitul etapei 1.

In etapa I s-au prelevat biopsii musculare de la persoane cu varste cuprinse intre 20-50 ani,

persoane care au suferit interventii de reconstructie ortopedica. Biopsiile au fost prelucrate in vederea

analizei anatomopatologice, imunohistochimice, imunoblot, microscopie electronica. In etapa curenta s-a

analizat anatomopatologic tesutul muscular, aplicanduse tehnici de colorare histologice, histochimice si

histoenzimologice. S-a constatat ca in acest stadiu si la grupele de varsta I-III, nu s-au observat modificari

patologice.

Ca o idee originala, am introdus in studiul nostru si analiza unor biopsii musculare de la pacienti

cu distrofie musculara forma centurilor. Modificarile care se produc in tesutul muscular in aceste maladii

se aseamana foarte mult cu cele produse in muschiul imbatranit.

CONCLUZII:

In aceasta etapa au fost luati in studiu subiecti care:

- nu au facut sport de performanta;

- nu au suferit de obezitate sau de diabet;

- nu au fost imobilizati la pat pentru o perioada indelungata.

Analiza anatomopatologica a biopsiilor musculare de la pacientii din primele doua grupe de varsta,

respectiv 20-30 de ani si 31-40 de ani, a relevat faptul ca tesutul muscular nu sufera modificari majore, cel

putin la nivelul coloratiilor pentru microscopie optica. Asfel:

- diametrul mediu al fibrelor musculare s-a situat in limite normale;

- nucleii si-au pastrat localizarea periferica;

- nu s-au observat fibre in necrobioza sau in regenerare;

- nu s-a observat proliferare de tesut conjunctiv endo si perimisial;

- nu s-au observat acumulari de glicogen si lipide;

- nu s-au observat vacuole autofagice sau de alta natura;

- nu s-au observat modificari mitocondriale;

- structura interna a fibrelor musculare a fost normala;

- distributia fibrelor musculate pe tipuri histoenzimatice (fibre de tip 1 si de tip 2) a fost in limite

normale.

Muschiul pacientilor cu distrofie musculara forma centurilor a prezentat numeroase modificari, citate

in literatura de specialitate si la nivelul fibrelor musculare ale pacientilor de varsta inaintata, respectiv:

- variabilitate marcata de talie a fibrelor musculare, cu prezenta de fibre atrofice, ca si hipertrofice;

- prezenta unor vacuole autofagice;

- prezenta unor fibre in necrobioza;

- mici acumulari de glicogen;

- proliferare a tesutului conjunctin endo si eprimisial;

- internalizari nucleare.



RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - ETAPA 2, 27.11.2009Investigatii anatomopatologice ale biopsiilor musculare

OBIECTIVUL GENERAL AL ETAPEI 2

Investigatii anatomopatologice ale biopsiilor musculare


1. Continuarea strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite varste

(P2)

2. Pregatirea probelor biologice ( CO, P1, P2)


4. Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor investigate

prin IHF (CO, P1)

5. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei 2 (CO)

Rezumatul Etapei 2

In aceasta etapa, obiectivul general a constat in investigatii anatomopatologice ale biopsiilor musculare si

optimizarea conditiilor de identificare a modificarii cantitative a proteinelor investigate prin tehnica de

IHF. Pentru indeplinirea acestuia, s-au formulat 5 Obiective specifice ale etapei si anume: continuarea

strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite varste; pregatirea

probelor biologice; analiza anatomopatologica a probelor luate in studiu; optimizarea conditiilor de

identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor investigate prin IHF si demonstrarea

functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei 2.

In etapa a 2-a s-au prelevat biopsii musculare de la persoane cu varste cuprinse intre 50-76 ani,

persoane care au suferit interventii de reconstructie ortopedica. Biopsiile au fost prelucrate in vederea

analizei anatomopatologice, imunohistochimice, imunoblot, microscopie electronica. In etapa curenta s-a

analizat anatomopatologic tesutul muscular, aplicandu-se tehnici de colorare histologice, histochimice si

histoenzimologice. S-a constatat ca in acest stadiu si la grupele de varsta V-VI, s-au intalnit modificari

importante ale tesutului muscular striat.. S-a constatat ca o parte din aceste modificari se intalnesc si in

neuropatiile periferice sau in distrofiile musculare. Altemodificari tin de imbatranirea celulei musculare si

de acumularea de pigment lipofuscinic.

De asemenea s-a facut optimizarea concentratiei anticorpilor unor proteine musculare care pot fi

modificate odata cu inaintarea in varsta.

CONCLUZII:

In aceasta etapa au fost luati in studiu subiecti din grupele de varsta a 5-a (60-69 ani) si a 6-a (70-79 ani)

care:




Analiza anatomopatologica a biopsiilor musculare de la acesti pacientii a relevat faptul ca tesutul

muscular sufera modificari importante odata cu inaintarea in varsta, cel putin la nivelul coloratiilor pentru

microscopie optica. Asfel:

- exista o variabilitate importanta de diametru a fibrelor musculare, prin prezenta atat a fibrelor

atrofice, cat si a celor hipertrofice;

- s-a constatat aspectul rotunjit al multor fibre musculare, asemanator cu aspectul din distrofiile

musculare;

- s-au remarcat fibre angulare si alungite, tipice de obicei neuropatiilor periferice;

- in doaua cazuri s-au intalnit nuclei internalizati in numeroase fibre musculare;

- s-au observat fibre in necrobioza;

- s-a observat proliferare de tesut conjunctiv mai ales endo-, dar si perimisial;

- nu s-au observat acumulari de glicogen si lipide; au existat cateva fibre musculare cu o periferie

mai marcata pe coloratia pentru lipide, fara a fi vorba de o acumulare propriuzisa.


- nu s-au observat modificari mitocondriale pe SDH;


- s-a remarcat prezenta unor incluzii de lipofuscina, obisnuite in tesuturile (mai ales muschi cardiac ,

creier si ficat) persoanelor varstnice;


- s-a facut optimizarea concentratiei unui numar important de anticorpi pentru vizualizarea unor

proteine musculare care pot varia cantitativ si calitativ odata cu inaintarea in varsta.



RAPORT STIINTIFIC SI TEHNIC - ETAPA 3, 10.12.2010Introducerea tehnicii IHF si Western Blot pentru identificarea expresiei proteinelor musculare (calitativa si cantitativa)

OBIECTIVUL GENERAL AL ETAPEI 3

Introducerea tehnicii IHF si Western Blot pentru identificarea expresiei proteinelor musculare (calitativa si cantitativa)


1. Continuarea strangerii de date clinice si prelevarii de probe bioogice de la subiecti de diferite

varste (P2)

2. Pregatirea probelor biologice ( CO, P1, P2)


4. Analiza imunohistochimica prin IHF a probelor luate in studiu (CO, P1)

5. Optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor expresiei fenotipice a proteinelor investigate

prin WB (CO, P1)

6. Integrarea datelor obtinute pana in acest moment (CO, P1, P2)

7. Evaluarea rezultatelor partiale si aplicarea eventualelor corectii (CO, P1, P2)

8. Demonstrarea functionalitatii modelului la sfarsitul Etapei 2 (CO)

Rezumatul Etapei 3

In aceasta etapa, obiectivul general a constat in introducerea tehnicilor de imunohistochimie si de

optimizare a tehnicii de Western blot pentru analiza proteinelor musculare din probele de muschi luate in

studiu. S-au facut investigatii anatomopatologice ale biopsiilor musculare.

In etapa a 3-a s-au prelevat biopsii musculare de la alte 12 persoane cu varste cuprinse intre 24-80

ani, persoane care au suferit interventii de reconstructie ortopedica. Biopsiile au fost prelucrate in vederea

analizei anatomopatologice, imunohistochimice, imunoblot.. In etapa curenta s-a analizat

anatomopatologic tesutul muscular, aplicandu-se tehnici de colorare histologice, histochimice si

histoenzimologice. S-a constatat ca in acest stadiu si la grupele de varsta V-VII, s-au intalnit modificari

importante ale tesutului muscular striat, cum ar fi proliferare colagena, fibre in necrobioza, acumulari de

pigment lipofuscinic. Pe imunohistochimie, s-a constatat prezenta normala a tuturor proteinelor

investigate (distrofina, utrofina, sarcoglicani, titina, desmina, vinculina). Este de urmarit in continuare

daca pe western blot, aceste proteine sunt afectate din punct de vedere cantitativ.

De asemenea s-a facut optimizarea conditiilor de identificare a modificarilor fenotipice ale acestor

proteine prin Western blot.

S-a facut integrarea datelor obtinute pana in acest moment si evaluarea rezultatelor partiale.

Ca urmare, s-a constatat functionalitatea modelului propus si necesitatea continuarii studiilor

pentru a observa modificarea cantitativa a proteinelor investigate si evntualele procese apoptotice aparute

in fibra musculara imbatranita.

CONCLUZII:

In aceasta etapa au fost luati in studiu subiecti din grupele de varsta a 5-a (60-69 ani) si a 6-a (70-79 ani) si

a 7-a (80-89 ani)




Analiza anatomopatologica a biopsiilor musculare de la acesti pacientii a relevat faptul ca tesutul

muscular sufera modificari importante odata cu inaintarea in varsta, cel putin la nivelul coloratiilor pentru

microscopie optica. Asfel:

- exista o variabilitate importanta de diametru a fibrelor musculare, prin prezenta atat a fibrelor

atrofice, cat si a celor hipertrofice;

- s-au remarcat fibre angulare si alungite, tipice de obicei neuropatiilor periferice;

- s-au observat fibre in necrobioza;

- s-a observat proliferare de tesut conjunctiv mai ales endo-, dar si perimisial;

- nu s-au observat acumulari de glicogen si lipide;


- nu s-au observat modificari mitocondriale pe SDH;


- s-a remarcat prezenta unor incluzii de lipofuscina, obisnuite in tesuturile (mai ales muschi cardiac ,

creier si ficat) persoanelor varstnice;


- proteinele musculare investigate au fost normal exprimate (distrofina, sarcoglicani, titina, desmina,

vinculina)

- s-a facut optimizarea tehniciii de WB pentru analiza cantitativa a proteinelor investigate.

Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de ...

Documents

Transcript of Analiza moleculara a proteinelor implicate in principalele tipuri de ...