AnaliaProbelorBiologice 4 Spectrometria 2013

7/21/2019 AnaliaProbelorBiologice 4 Spectrometria 2013

1/67

MetodeMetode SpectrometriceSpectrometrice ModerneModerne

Analiza Probelor Biologice-Curs 4


2/67

SpectrometriaSpectrometria

StudiazaStudiaza interactiileinteractiile dintredintre radiatiaradiatiaelectromagmeticaelectromagmetica cucu materiamateria

PentruPentru aplicatiiaplicatii curentecurente inin laboratoarelaboratoare, se face, se faceapelapel lala radiatiaradiatia dindin regiunearegiunea spectralaspectrala dindinultravioletultraviolet si/sausi/sau vizibilvizibil, IR,, IR, masamasa, raze X,, raze X,fluorescentafluorescenta, RMN, RMN

AbsorbantaAbsorbanta radiatieiradiatiei electromagneticeelectromagnetice poatepoate fificalitativacalitativa sisi cantitativacantitativa..


3/67

AplicaAplicaii aleii ale spectrelorspectrelor


4/67


5/67

SpectrulSpectrul vizibilvizibil

390 780450 520 590 620

Lungimea de unda (nm)

IRUV Cresterea Energiei

Cresterea lungimii de unda

Rosu-Portocaliu-Galben-Verde-Albastru-Violet


6/67

EnergiaEnergia OrbitalilorOrbitalilorMoleculariMoleculari

sau orbital molecular

ssaup

orbital

atomic

* sau*

orbital

molecular

orbital ne-legatura

nn

n*

n*

*

*Energi

a


7/67

TranzitiileTranzitiile electronilorelectronilorpepe nivelenivele

molecularemoleculare dede energieenergie

E0

E4E3

E2

E1

Singlet

Triplet

A

VR

F

IC

P

10-6-10-9 sec

10-4-10 sec


8/67

AbsorbAbsorbiaia ii emisiaemisia luminiiluminii AAtomiitomii care nu au nici un electroncare nu au nici un electronn niveluri mai marin niveluri mai mari

de energiede energie -- suntsuntn staren stare fundamentalfundamental

Atomii care au un electron pe un nivel mai mareAtomii care au un electron pe un nivel mai mareenergeticenergetic -- suntsuntn stare excitatn stare excitat

CndCnd radiatiaradiatia electromagneticaelectromagnetica interactioneazainteractioneaza cucu ununatomatom i provoac un electron s ajung pe un nivel cui provoac un electron s ajung pe un nivel cuenergieenergie superioarasuperioara,, energiaenergia radiatieiradiatiei devinedevine parte aparte aenergiei electronuluienergiei electronului i mai departei mai departedisparedispare. Este. Este

absorbiabsorbiiaia..


9/67

AtomiAtomi, molecule,, molecule, ioniioni complecsicomplecsi EnergiEnergiee orbitalorbital marmaree energienergiee orbitalorbital

micmic EMISIEEMISIE

EnergieEnergie orbitalorbital micmic energieenergie orbitalorbitalmaremareABSORBABSORBIEIE

EEatomatom==EEelectronicaelectronica EEmoleculemolecule==EEelectronicaelectronica ++ EEvibratievibratie ++ EErotatierotatie EEionion complexcomplex==EEelectronicaelectronica ++ EEvibratievibratie ++ EErotatierotatie


10/67

Clasificarea spectrelorClasificarea spectrelor


11/67

SpectrulSpectrul de absorbde absorbie/emisieie/emisie

AbsorbAbsorbiaia = msoar

mrimea energiei radiate

de o surs extern care

este absorbit de analit(spectru continuu)

EEmisie/ luminescenmisie/ luminescen--

msoar caracteristicile

energiei radiate de o

surs extern care este

mpratiat, difuzat de

analit


12/67

RadiatiaRadiatia electromagneticaelectromagnetica

E

H

A

Lungimea de unda ()

Viteza luminii = c

hc

hE

E = energia

h = constanta lui Plank

= frecventac= viteza luminii = lungimea de unda


13/67

AbsorptiaAbsorptia radiatiatieiradiatiatiei

electromagneticeelectromagnetice

I0(intensitatea radianta) I (intensitatea transmisa)

abcAbckTkNI

Idnk

I

dIkI

dn

dI I

I

N

;log;ln;;00

0

0


14/67

AbsorbanAbsorbana,a, transmitantransmitanaa

AbsorbanAbsorbanaa esteeste importantimportant pentrupentru analizanalizeecantitativecantitative ((nn spectrometriespectrometrie sese maimai numenumetete iidensitateadensitatea luminiiluminii))

AbsorbanAbsorbanaaeste des utilizateste des utilizat; este direct; este directproporproporional cu grosimea probeiional cu grosimea probei i concentrai concentraiaiaspeciilor absorbitespeciilor absorbiten probn prob..

TransmitanTransmitanaavariaz logaritmic cu grosimeavariaz logaritmic cu grosimea iiconcentraconcentraia probei.ia probei.

TransmitanTransmitanaaunui fascicul de lumin ceunui fascicul de lumin ce

trece printrtrece printr--o cuv cu lungimea lo cuv cu lungimea l..


15/67

LegeaLegea luilui LambertLambert -- BeerBeer

Aceast lege reprezint legea de baz folosit n

analizele i determinrile spectrofotometrice.

Radiaia incident monocromatic, Io cade pe o celula

ce conine proba, celula are lungimea l , concentraia

substanei ce absoarbe lumina, C.

A = -log T

T = I/I0

A= abc


16/67

RelatiaRelatia dintredintre %T%T sisiAA

%T A

1 2

50 0.301

90 0.046

100 0

%T mica = A mare%T mica = A mare


17/67

AbsorbantaAbsorbanta

E

roare

E

roare((dAdA/A

)

/A)

0.0 2.0

eroareaeroarea inin aplicareaaplicarea

legiilegii LambertLambert--BeerBeer

0.434


18/67

I0 = 10,000 I = 5,000

5.010000

5000

0

I

IT

-b-

ExemplulExemplul 11

A = -log T = -log (0.5) = 0.3010


19/67

I0 = 10,000 I = 2,500

25.0

10000

2500

0

I

IT

--2b--

ExemplulExemplul 22

A = -log T = -log (0.25) = 0.6021


20/67

A = e1bc1 + e2bc2 + e3bc3 + enbcn

AnalizaAnaliza amestecuriloramestecurilor

PrincipiulPrincipiul aditivitatiiaditivitatii A(amestecA(amestec)) 11 = A(1)= A(1) 11 + A(2)+ A(2) 11 ++....

, nm

Abso

rbanta

Abso

rbanta

1 2

BB

AA


21/67

DezvoltareaDezvoltarea dede metodemetode

spectrometricespectrometrice AnalitulAnalitul trebuietrebuie sasa absoarbaabsoarba la ola o lungimelungime dede

undaunda unicaunica ((rarrarintalnitaintalnita))

AnalitulAnalitul tebuietebuie sasa reactionezereactioneze cu uncu un reactivreactivproducandproducand unun aductaduct carecare absoarbeabsoarbe la ola o

lungimelungime dede undaunda specificaspecifica (un(un cromoforcromofor))

AnalitulAnalitul sasa fiefie implicatimplicat intrintr--oo reactiereactie prinprin carecare

rezultarezulta unun cromoforcromofor


22/67

Spectrometria UV-Viz


23/67

Spectrometrul cu un singur facicol

Spectrometrul cu doua facicole


24/67

MultiMulti compusicompusi organiciorganiciabsorb inabsorb in regiunearegiunea UVUVaa spectruluispectrului


25/67

MulteMulte metalemetale liberelibere sisicomplexicomplexi anorganicianorganici aiai

acestoraacestora absorb inabsorb inregiunearegiuneaVizViz dindin spectruspectru


26/67

MultiMulti complexicomplexi anorganicianorganicisisi organiciorganici formeazaformeaza

complexicomplexi cu transfer decu transfer desarcinasarcina

ExistaExista in complex oin complex ogruparegrupare donoaredonoare sisi oo

gruparegrupare acceptoareacceptoare dedeelectronielectroni

ComplexulComplexul cu transfer decu transfer desarcinasarcina are oare o bandabanda dede

absorptieabsorptie specificaspecifica ininregiunearegiunea vizibilavizibila aaspectruluispectrului utilizabilautilizabilaanaliticanalitic


27/67

ExempluExemplu de complex cude complex cu tansfertansfer dede sarcinasarcina

NitritulNitritul poatepoate fifideterminatdeterminat analiticanalitic cucuajutorulajutorul unuiunui reactivreactiv cucu

carecare formeazaformeaza unun compexcompexcu transfer decu transfer de sarcinasarcina..

ComplexulComplexul arataarata ooabsorbtieabsorbtie dede bandabanda ininVizVizcu ocu o lungimelungime dede undaunda

((maxmax) care) care poatepoate fifideterminatadeterminata

DeterminarileDeterminarile vorvor fififacutefacute lala aceastaaceasta maxmax

maxmax


28/67

DeterminareaDeterminarea proteineiproteinei totaletotale

ToateToate proteineleproteinele suntsunt compusecompuse din 20din 20 resturiresturide aminode amino acidziacidzi

ExistaExista maimai multemulte metodemetode analiticeanalitice dede

determinaredeterminare aa proteinelorproteinelor:: KjeldahlKjeldahl metodametoda dede referintareferinta

SpectrometrieSpectrometrie directadirecta

MetodaMetoda cucu reactivulreactivul FolinFolin--CiocalteuCiocalteu (Lowery)(Lowery)MetodeMetode dede legarelegare cucu coloranticoloranti specificispecifici ((AmidoAmido

black;black; CoomassieCoomassie Brilliant Blue; Silver)Brilliant Blue; Silver) PrecipitareaPrecipitarea cu acidcu acid sulfosalicilicsulfosalicilic sausau acidacid

tricloracetictricloracetic (TCA)(TCA)

MetodaMetoda BiuretBiuret


29/67

SpectrometrieSpectrometrie DirectaDirecta

AbsorptiaAbsorptia la 200la 200225 nm225 nm poatepoate fifi utilizatautilizata((maxmax pentrupentru legaturilelegaturile peptidicepeptidice))

Tyr ,Tyr , TrpTrp, uric acid, uric acid sisi bilirubinabilirubina interferainterfera lala280 nm280 nm

C

NH2

H2C COOH

H

OH

C

NH2

H2C COOH

H

HNCH

Tyrosine Tryptophan

max= 280 nm


30/67

MetodaMetoda BiuretBiuret

TartratTartrat de Na, Kde Na, Kadaugatadaugat la complexla complexpentrupentru aa stabilizastabiliza ioniiionii de Cude Cu++++ (cupric)(cupric)

IodulIodul adugatadugat ca antioxidantca antioxidant

H2NHN NH2

OO

HC

C NH

C

O

HN

O

or . . .Cu

++

OH-Blue adduct(= 540 nm)


31/67

MetodaMetoda FolinFolin--CiocalteuCiocalteu (Lowry)(Lowry)

De 100De 100 oriori maimai sensibilasensibila decatdecat metodametoda BiuretBiuret

NecesitaNecesita purificaripurificari datoritadatorita interferentelorinterferentelormarimari

forma redusa (bleu)Acid fosfotungstic/

Acid fosfomolibdenic

ProteinaProteina

(Tyr,(Tyr,TrpTrp))


32/67

DetrminareaDetrminarea ProteinelorProteinelor

Metoda Domeniul, g

Proteina Totala

Biuret 1000 - 5000

UV Absorption @ 280 nm 200 - 2000

Lowry 5 - 40

Bradford (Coomassie

Brilliant Blue)

0.1 - 10


33/67

DeterminareaDeterminarea creatinineicreatininei

ReactiaReactia

creatinineicreatininei

cucu

picratulpicratul

alcalinalcalin

rezultarezulta un complexun complex cece absoarbeabsoarbe inin vizibilvizibil

MultiMulti compusicompusi reactioneazareactioneaza dede asemeneaasemeneacucu picratulpicratul

NH

NH

H3C

O

O-

NO2O2N

NO2

OH-

-O

O2N

O2N

NO2

HN

NH

CH3

-O

+

Creatinine Picric acid

Janovski complex

max= 485 nm


34/67

NH

N

O

CH3

NHN

CH3

NH

NH2COOH

H3C

HN COOH

O2 H2O2

H2NCH2

COOH+ CH2O

H3C

HN COOH

Creatinine

Creatinine

amidohydrolase

Creatine

Urea

Sarcosine

Sarcosine

Sarcosine

oxidase

Glycine

Creatine

amidohydrolase

DeterminareaDeterminarea enzimaticaenzimatica aa creatinineicreatininei

H2O2 este determinata prin metode

conventionale peroxidare/colorant

HH22OO22 esteeste determinatadeterminata prinprin metodemetode

conventionaleconventionale peroxidareperoxidare/colorant/colorant


35/67

DeterminareaDeterminarea ureeiureei

((metodametoda

directadirecta

))

metodametoda directadirecta masoaramasoara absorbantaabsorbantacromoganeuluicromoganeului produsprodus direct dindirect din ureeuree

metodametoda indirectaindirecta masoaramasoara amoniaculamoniaculprodusprodus dindin ureeuree

H3C

CH3

O

NOH

H+

H3C

CH3

O

O

H2N NH2

O

N N

H3C CH3

O

+H

+,

Diacetyl monoxime Diacetyl Urea Diazone

max= 540 nm


36/67

DeterminareaDeterminarea ureeiureei

((metodametoda indirectaindirecta))

H2N NH2

O

Urease2 NH4

++

OH

OH-

N

-O O

Urea Phenol Indophenol

max= 560 nm


37/67

DeterminareaDeterminarea aciduluiacidului uricuric

Tungsten blueTungsten blue absoarbeabsoarbe lala = 650= 650--700 nm700 nm

enzimaenzima UricaseUricase catalizeazacatalizeaza aceeasiaceeasi reactiereactie multmult maimaispecificspecific

AbsorbantaAbsorbanta aciduluiacidului uric lauric la 585 nm585 nm esteeste monitorizatamonitorizata

MetodaMetoda sese bazeazabazeaza pepe masurareamasurarea HH22OO22

HN

N

H

N

H

N

O

O

O-

O2 H2O2N

H

HN

N

H

H2N

O

O

O

Phosphotungstic acid Tungsten blue

Uric Acid Allantoin


38/67

DeterminareaDeterminarea Ca totalCa total

ProbeleProbele suntsunt acidifiateacidifiate pentrupentru eliberareaeliberarea CaCa++++

dindinproteineproteine,, dardar complexulcomplexul CPCCPC--CaCa++++ sese formeazaformeaza lalapHpH alkalinalkalin

NN N

N

AsO3H2OH OH

H2O3As

SO3--

O3S

O

CH3

HO

CH3

OH

N

O

-O

N

-O O O-O

O

O-

O

Arsenazo III

max= 650 nm

o-Cresolphthalein complexone

max= 570 - 580 nm


39/67

DeterminareaDeterminarea MgMg

complexcomplex coloratcolorat cu Mgcu Mg

2727MgMg activareactivare cucu neutronineutroni sausauAASAAS metodemetode dedereferintareferinta

N

N

H3C

OH

HO

SO3-

SO3-CH3

HO

H3C CH3 H3C CH3

O

N

O

O-

O-O

CH3

N

O

-O

O O-

Calmagite

max= 530 - 550 nm

Methylthymol blue

max= 600 nm


40/67

DeterminareaDeterminarea FeFe

ProbeleProbele suntsunt acidificateacidificate pentrupentru ca Feca Fe sasa fiefieeliberateliberat dede transferinatransferina sisi redusredus de la Fede la Fe3+3+

la Fela Fe2+2+ (ion(ion ferosferos))

N N N N

SO3H

SO3NaBathophenanthroline Ferrozine

Fe ++

max

= 534 nm

Fe ++

max= 562 nm


41/67


42/67

DeterminariDeterminari cucu enzimeenzime

OO reactiereactie catalizatacatalizata de ode o enzimaenzima poatepoate fifi

urmaritaurmarita prinprin determinareadeterminarea urmatoarelorurmatoarelor:: DispartitiaDispartitia substratuluisubstratului

AparitiaAparitia produsuluiprodusului

ConversionConversion cofactoruluicofactorului

Substrate ProductEnzyme

Cofactor Cofactor*


43/67

SpectrulSpectrul dede absorptieabsorptie in UV alin UV al

cofactorilorcofactorilorNADNAD sisi NADHNADH

Absorbanta

250 300 350 400

(nm)

NAD+

NADH

max= 340 nm


44/67

DeterminareaDeterminarea fosfatazeifosfatazei alkalinealkaline

substratulsubstratul naturalnatural pentrupentruALKP nuALKP nu esteestecunoscutcunoscut

N+

O O-

O

P

O-

OO H2O PI

N+

O O-

O-

N+

-O O

-

O

p-Nitrophenol

phosphate

Alkaline phosphatase

pH 10.3, Mg++

p-Nitrophenoxide

Benzoid(colorless)

Quinonoid

(max= 404 nm)


45/67

SPECTROMETRIA DESPECTROMETRIA DEFLUORESCENTAFLUORESCENTA


46/67

Culoarea corpurilorCuloarea corpurilorssi culoarea absorbiti culoarea absorbit

pentru regiunea vizibilpentru regiunea vizibil

Albastru verdeRosu650 780

Verde albastruOranj595 650

AlbastruGalben575 595VioletGalben verde560 575

PurpuriuVerde500 560

RosuAlbastru verde490 500

OranjVerde albastru480 490

GalbenAlbastru435 480

Galben verdeViolet385 435

Culoarea complementar

(culoarea

observat/transmis)

Culoarea luminii

absorbite

Domeniul spectral al

luminii absorbite (nm)


47/67

Diagrama energiilor parDiagrama energiilor pariale pentru un sistemiale pentru un sistem

fotoluminiscentfotoluminiscent


48/67

EEmisia luminii de la orice stare de excitare amisia luminii de la orice stare de excitare amoleculei este cunoscut sub denumireamoleculei este cunoscut sub denumirea

general degeneral de l um in iscenlumin iscenAceastaAceasta cuprinde fenomenele decuprinde fenomenele de f luorescenf luorescen ii

fos forescenfosforescen

Nivele energeticeNivele energetice

Emisia fluorescenEmisia fluorescenei este unei este unproces de durat scurtproces de durat scurt,,ntrentre

1010--99 1010--66 s, pe cnd,s, pe cnd,n cazuln cazul

fenomenului defenomenului de

fosforescenfosforescen, d, durata deurata de

emisie a luminii este maiemisie a luminii este mai

lunglung, f, fiind cuprinsiind cuprinsntre 10ntre 10--33

i cteva secunde.i cteva secunde.


49/67

Prin definiPrin definiie,ie, fluorescenfluorescenaa poate fi enunpoate fi enunatat

ca energia emis cnd o substanca energia emis cnd o substan revine de revine dela o stare de excitare (sau de la o stare dela o stare de excitare (sau de la o stare deenergieenergie naltnalt),), la o stare fundamentalla o stare fundamental (sau(saula o energie mai joasla o energie mai joas).).

FosforescenFosforescenaa reprezint capacitatea uneireprezint capacitatea uneimolecule de a suferi fenomenul de emisiemolecule de a suferi fenomenul de emisie

ntrziat de pe un nivel inferior al striintrziat de pe un nivel inferior al striielectronice de excitare, pe un nivelectronice de excitare, pe un nivel al striiel al striifundamentale, trecnd prifundamentale, trecnd printrntr--o stareo staremetastabil de tripletmetastabil de triplet..


50/67

Excitarea moleculelor nu se face numai prinExcitarea moleculelor nu se face numai prin

absorbabsorbia radiaia radiaiei de luminiei de lumin, ci, ci i prin absorbi prin absorbiaiaenergiei chimice ce rezultenergiei chimice ce rezult n urma unei reacn urma unei reaciiii

chimice. Emisia de fotoni de la produsul reacchimice. Emisia de fotoni de la produsul reacieiiei

chimice poart numele dechimice poart numele de chemi luminiscenchemi luminiscen..

Acest fenomen are loc pe msur ce speciile aflateAcest fenomen are loc pe msur ce speciile aflaten staren stare

excitat se relaxeaz la starea fundamentalexcitat se relaxeaz la starea fundamental. E. Emisia demisia de

luminluminn chemiluminiscenn chemiluminiscen respect legea lui Planck respect legea lui Planck..

A+B C* C+hv


51/67


52/67

Spectrul de absorbSpectrul de absorbttieie

ssi de emisie ideali de emisie ideal

VariaVariattia fluorescenia fluorescentteiein funcn functtieie

de concentrade concentrattia analituluiia analitului

Curba de calibrareCurba de calibraremsurat la maximul de fluorescenmsurat la maximul de fluorescentt


53/67

Randamentul cuanticRandamentul cuantic

Randam en tu l cuan t i cRandam en tu l cuan t i creflect probabilitatea careflect probabilitatea cavariavariaia proceselor fotochimice sau fotofizice sia proceselor fotochimice sau fotofizice s

conduc la dezactivarea radiativ sau neradiativ aconduc la dezactivarea radiativ sau neradiativ astrii excitatestrii excitate..

Randamentul cuantic poate lua valoriRandamentul cuantic poate lua valori ntre 0ntre 0 ii1. Cnd ia valoarea 1 (maxim), toate moleculele care1. Cnd ia valoarea 1 (maxim), toate moleculele careabsorb lumin emit total la toate lungimile de undabsorb lumin emit total la toate lungimile de und,,

ele fiind puternic fluorescente. Dele fiind puternic fluorescente. Dacac,, n caz contrar,n caz contrar,randamentul cuantic iarandamentul cuantic ia va lor i m ai m ic i dect 1, pva lor i m ai m ici dect 1, pnnaproape de 0aproape de 0, atunci, atunci compucompui ii ivor fi consideravor fi consideraii slabslabf luorescenf luoresceni ( sau ch iar nef luor esceni (sau ch iar n ef luor esceni ,i , dacdac = 0 ) .= 0 ) .

Ie / Ia =Ie / Ia =


54/67

MMoleculele cu randament cuantic de fluorescenoleculele cu randament cuantic de fluorescen

intens prezint urmatoarele particularitaintens prezint urmatoarele particularitaiinnstructura lorstructura lor

un numar mare de duble legturiun numar mare de duble legturi

conjugate de tipul C = C, C = O, C = N;conjugate de tipul C = C, C = O, C = N; un numar mare de grupe de tipulun numar mare de grupe de tipul NHNH22,,OH,OH, OCHOCH33 (donoare de electroni);(donoare de electroni);

oonalta stabilitate datorat rezonannalta stabilitate datorat rezonanei;ei; o absorbtivitate molar pronuno absorbtivitate molar pronunatat;;

o structur rigido structur rigid..


55/67

FluoresceinaFluoresceina FenolftaleinaFenolftaleina

OHO OH

C = O

O

HO

C

C =O

O

OH


56/67

Randamentul cuantic poate fi influenRandamentul cuantic poate fi influenat,at,nn

sensul scderii salesensul scderii sale, de mai mul, de mai muli factorii factori::

de ciocnirile dintre moleculele excitatede ciocnirile dintre moleculele excitate i cele alei cele alesolventului, care duc lsolventului, care duc la dezactivria dezactivri;;

de prezende prezena impurita impuritilor puternic absorbante dinilor puternic absorbante dinproba de analizat (ducproba de analizat (duc la o scdere a intensitla o scdere a intensitiiiide emisie a radiade emisie a radiaiei prin fluoresceniei prin fluorescen););

de asemenea, prezende asemenea, prezena unor grupe de tipula unor grupe de tipul -- I,I,

-- Br,Br, -- NONO22 n structura compun structura compuilor duce lailor duce lainhibarea fluoresceninhibarea fluorescenei;ei;

energia consumata prin ruperea legaturiienergia consumata prin ruperea legaturii..


57/67

Caracteristicile analitice aleCaracteristicile analitice ale

determinrilor prin fluorescendeterminrilor prin fluorescen

Dintre factorii care pot influenDintre factorii care pot influena sensibilitatea cantitativa sensibilitatea cantitativ aadeterminarilordeterminarilor putem enumera:putem enumera:

Nelinearitatea este data de creNelinearitatea este data de creterea concentraterea concentraiei deiei decompucompui fluoroforii fluorofori

Efectul pHEfectul pH--uluiului

Viscozitatea mediuluiViscozitatea mediului i,i, implicit, nuimplicit, numrul de ciocniri dintremrul de ciocniri dintremolecule sunt influenmolecule sunt influenate de temperaturate de temperatur

ExtincExtincia de luminiscenia de luminiscen este dat de scderea intensit este dat de scderea intensitiiiide fluorescende fluorescen prin interac prin interacia moleculelor aflateia moleculelor aflaten stare den stare deexcitare cu mediul. Ea repexcitare cu mediul. Ea reprezint un indicator al interacrezint un indicator al interaciiloriilorchimice specifice ce pot avea locchimice specifice ce pot avea loc


58/67

SursaSursa dede radiaradiaiiii

1)1) Lamp cu vapori de HgLamp cu vapori de Hg--este specific fluorimetreloreste specific fluorimetrelor..

Acesata emite multe liniAcesata emite multe linin UVn UV i VIS.i VIS.

2)2) Lamp cu XeLamp cu Xe--specfic spectrofluorimetrelorspecfic spectrofluorimetrelor

3)3) Lasari (HeLasari (He--Cd)Cd)-- nu sunt folosinu sunt folosii foarte mult.i foarte mult.SelectoriiSelectorii lungimiilungimii de undde und: filtre: filtre i monocromatori (mai noui monocromatori (mai nou

policromatori).policromatori).

FLUORIMETREFLUORIMETRE II

SPECTROFLUORIMETRESPECTROFLUORIMETRE

Schema unui fluorimetru fotoelectricSchema unui fluorimetru fotoelectric

monofascicul cu filtre.monofascicul cu filtre.1) lamp cu vapori de mercur, 2) i 4)

filtre, 3) celul ce conine proba de

analizat, 5) fotocelul, 6) instrument de

msur


59/67


60/67

AplicaAplicaii analitice ale spectrometriei deii analitice ale spectrometriei de

fluorescenfluorescenAnalitii pot fiAnalitii pot fi::1.1. f luorescent if luorescent i, putand fi detectatii direct cu ajutorul, putand fi detectatii direct cu ajutorul

spectrofluorimetrului (de exemplu hidrocarburile aromatice,spectrofluorimetrului (de exemplu hidrocarburile aromatice,proteinele, cateva mediamente),proteinele, cateva mediamente),

2.2.

slab f luorescent i sau nef luorescent islab f luorescent i sau nef luorescent isi metodele indirectesi metodele indirectecare sunt utilizate in analiza lor sunt urmatoarele:care sunt utilizate in analiza lor sunt urmatoarele:

DerivatizareaDerivatizarea(de exemplu reactia analitului cu un compus(de exemplu reactia analitului cu un compusfluorescent), este de obicei utilizata in conjunctie cufluorescent), este de obicei utilizata in conjunctie cucromatografia de lichide cu detectie de fluorescenta. Aceastacromatografia de lichide cu detectie de fluorescenta. Aceastametoda este utilizata in mod curent in biochimie si chimiametoda este utilizata in mod curent in biochimie si chimia

clinica.clinica. Formarea unui complex f luorescentFormarea unu i complex f luorescent

Stingerea f luor escenteiSt ingerea f luorescenteirezulta dinrezulta din coliziunea analitului cucoliziunea analitului cuun compus fluorescent. Aceasta metoda este utilizata laun compus fluorescent. Aceasta metoda este utilizata ladetectia de gaze ca de exemplu oxigenul, SOdetectia de gaze ca de exemplu oxigenul, SO22, H, H22S, HCl, ClS, HCl, Cl22etc.etc.


61/67

AplicaAplicattii aleii ale spectrometrieispectrometriei dede fluorescenfluorescentata

--analizaanaliza calitativacalitativa sisi cantitativacantitativa aa cationilorcationilorsisi anioniloranionilor;;

--analizaanaliza calitativacalitativa sisi cantitativacantitativa aa unorunorcompusicompusi organiciorganici;;

--determinareadeterminarea structuriistructurii conformationaleconformationale aa proteinelorproteinelor;;

--analizaanaliza ADNADN--uluiului;;--studiulstudiul cineticiicineticii proceselorproceselorde transferde transferprinprin membrane;membrane;

--studiulstudiul cineticcinetic alal reactiilorreactiilorenzimaticeenzimatice;;

--metodametoda de control inde control in ingineriaingineria geneticagenetica;;

--metodemetode imunochimiceimunochimice dede analizaanaliza sisi diagnozadiagnoza;;

--studiulstudiul proliferariiproliferarii celulelorcelulelorii apoptozeiapoptozei;;

--etc.etc.

61


62/67

Analiza triptofanului-triptofanul are un maxim de absorbtie la 290 nm si un maxim de emisie

aproximativ la 345 nm.

-triptofanul este sensibil la mediul inconjurator-maximul de emisie oferainformatii privind gradul de modificare al proteinelor.

-masurarea spectrului de emisie in domeniul 305450 nm permite

studiul produsilor fluorescenti rezultati prin reactii Maillard (maxim de

emisie la 440 nm) .

Analiza riboflavinei-riboflavina se degradeaza in lumina UV la doi noi compusi: lumicrom si

lumiflavina cu maxime de emisie intre 444479 nm si 516522 nm.

-reducerea intensitatii fluorescentei la circa 525nm reflecta

fotodegradarea riboflavinei.

Analiza vitaminei ASpectrul de excitatie al vitaminei A inregistrat intre 250 si 350 nm pentru

un maxim de emisie setat la 410 nm da informatii privind dezvoltarea

structurii globulare proteina grasimi (in procesul de coagulare a

laptelui de ex.)


63/67

Determinarea speciilor anorganiceDeterminarea speciilor anorganice

Me

N

CH2

HOOC

O CH2CH2

CH2

CH2

CH2

HOOC

HOOC

HOOC

N

N

O

O

O

COOH

Fura-2pentruCa+2


64/67

0,005Acid benzoicV

0,0022,2-metilendibenzotiazol

Zn

0,055-metil-1,10-fenantrolinRu

0,9Acid carminicMo

0,018-hidroxichinolinMg

0,01Triazinil stilbexonCr

0,2CalceinCa0,0005DibenzilmetanB

0,02Rodamin BAu

0,0003Saliciden-o-aminofenolAl

Sensibilitatea(ppm)

Reactivul organicElementul

Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentruSensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentruunele metale cu reactivi organiciunele metale cu reactivi organici


65/67

Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru uneleSensibilitatea determinrilor fluorimetrice pentru unele sspeciipecii

anorganiceanorganicen prezenn prezena unor reactivia unor reactivi organiciorganici

B, Be, Sb,ioni

colorai10Verde-BenzoinZn2+

F-, PO43-,Zr0,1470400FlavinolSn4+

Mg0,25803708-

hidroxichinoli

naLi+

NH32Albastru3652-(o-hidroxifenil)-

benzoxazolCd2+

Be, Sb0,04450370BenzoinB4O72-

Be,Co,Cr,Cu,

Fe, Ni, PO43-,

Th, Zr0,001500470

Complex al Al cu

alizarina de

RuF-

Be, Co, Cr, Cu,

F-, NO3-, Ni,

PO43-, Th, Zr

0,0007500470Alizarina de

rubiniuAl3+

Fluorescen

AbsorbieInterferene

Sensibilitatem/mL

Lungime de und, nm

Reactiv organicIon


66/67

AplicaAplicaii farmaceuticeii farmaceutice

Sensibilitatea determinrilor fluorimetrice a unorSensibilitatea determinrilor fluorimetrice a unor mmedicamenteedicamente

0,020515390pH = 11Tetraciclin

0,002450350pH = 1Chinin

0,010345275pH = 11Procain

0,500440265pH = 11Fenobarbital

0,100440250FericianurMorfin

0,100546490pH = 13Extrogen

0,100350285pH = 1Codein

0,001355280CHCl3/HOAcAspirin

Sensibilitatea

ppm

Lungimea de undde emisie

nm

Lungimea de undde excitare

nm

Condiii delucru

Substana


67/67

AplicaAplicaii pe probe biologiceii pe probe biologice-- studiulstudiul proteinelorproteinelor-- determinareadeterminarea glucozeiglucozei ((utilizandutilizand

reactivulreactivul tetraciclintetraciclin europium)europium)

--

determinareadeterminarea

vitaminelorvitaminelor

AplicaAplicaiile pe produsele alimentareiile pe produsele alimentare-- determinareadeterminareaVVB1B1 dindin painepaine,, laptelapte,, cerealecereale-- determinareadeterminarea seleniuluiseleniului-- determinareadeterminarea sterolilorsterolilor dindin macaroanemacaroane

AnaliaProbelorBiologice 4 Spectrometria 2013

Documents

Transcript of AnaliaProbelorBiologice 4 Spectrometria 2013