IMUNOLOGIE I

I. REACTII ANTIGEN-ANTICORPII. IMUNOSEROLOGIE

III. REACTII DE AGLUTINARE

I. REACTII ANTIGEN-ANTICORP

INTRODUCERE

Imunologia este stiinta care se ocupa cu studiul proceselor de aparare. Termenul de imunitate are ca subanteles in sens foarte larg “rezistenta”, sistemul imun aparand in evolutia biologica a organismelor pentru a le proteja de agenti patogeni. Modalitatile de contact cu microorganismele sunt variate ca atare sunt necesare variate tipuri de raspunsuri imune astfel incat apararea sa fie eficienta. Nivelele de interventie in apararea imuna se impart in doua mari categorii: apararea imuna nespecifica si apararea imuna specifica sau adaptativa.

Principalele diferente intre cele doua tipuri de raspuns imun ar fi ca apararea imuna adaptativa raspunde inalt specific unui agent patogen particular si ca reexpunerea imbunatateste raspunsul astfel ca trasaturile principale ale raspunsului imun adaptativ sunt specificitatea si memoria.

Componentele apararii imune nespecifice sunt:

bariera epiteliala – tegumentele si mucoasele constituie bariere fizice impotriva raspandirii agentilor patogeni

inflamatia - proces de aparare si limitare a extensiei agentului patogen

fagocitoza - proces de aparare contra agentilor patogeni particulati pe care fagocitele ii digera enzimatic

mediatori solubili ai apararii nespecifice:

o sistemul complementului – grup de componente serice nespecifice ce mediaza fagocitoza, controleaza inflamatia si interactioneaza cu anticorpii, avand rol major in eliminarea substantelor straine;

o citokine – grup mare de molecule (interferoni, interleukine, factori de crestere, chemokine, TNF, TGF, etc) cu rol in semnalizarea intercelulara in timpul raspunsurilor imune.

Apararea imuna specifica implica doua etape majore:

1. recunoasterea antigenului

2. raspunsul imun umoral sau celular pentru eradicarea acestuia

Antigenul (Ag) este o substanta de origine endogena sau exogena capabila sa induca un raspuns imun care consta in stimularea si proliferarea limfocitelor si in sinteza unor molecule de recunoastere – anticorpi (Ac) sau receptori celulari ce se combina specific in vivo sau in vitro cu Ag declansator.

Anticorpii sunt proteine sintetizate ca parte a raspunsului imun la o substanta straina (Ag) si care se leaga specific la Ag. Situsul de combinare al unui anticorp cu antigenul se afla in portiunea Fab a moleculei, zona hipervariabila. Combinarea se face pe principiul cheie-broasca. Legaturile cu antigenul sunt de tip necovalent (legaturi de hidrogen, forte Van der Waals, elctrostatice si hidrofobe), reversibile. Multiple legaturi intre Ac si Ag asigura intensitatea interactiunii Ag-Ac.

Interactiunea antigen-anticorp in gel sau solutii constituie baza metodelor imunochimice cantitative utilizate in diagnosticul imunologic de laborator. Aceasta reactie de legare este guvernata de legea masei care in acest caz consta in aceea ca antigenul liber [Ag] si anticorpii liberi [Ac] interactioneaza reversibil pentru a forma complexe [Ag-Ac]. Relatia intre antigenul liber si cel legat in complexe cu anticorpi este determinata de constanta de echilibru sau de afinitate Ka care este egala cu raportul intre constantele de asociere K1 si disociere K2 conform formulei:

[Ag] + [Ac] K1↔K2 [Ag-Ac]

Ka = K1/K2 = [Ag-Ac]/ [Ag] [Ac]

Valoarea constantei Ka depinde de intensitatea legaturilor Ag-Ac si, pentru ca toate antiserurile contin populatii de Ac cu variate capacitati de legare, valoarea Ka pentru un ser este o masura a valorii medii a intensitatii de legare pentru toate populatiile de anticorpi prezente. Adaugarea unei cantitati mari de antigen la o cantitate cunoscuta fixa de anticorpi conduce la formarea unei cantitati mari de complexe [Ag-Ac]. La o anumita concentratie de antigen, jumatate din situsurile de legare ale anticorpilor devin saturate astfel ca [Ag-Ac]= [Ac]. La echilibru, rata de asociere si cea de disociere sunt constante, astfel ca numarul de complexe Ag-Ac care se formeaza este egal cu al celor care se disociaza.

Tipuri de reactii imunologice in vitro

In functie de modul de evidentiere al reactiei in vitro, exista interactiuni Ag-Ac cu rezultat vizibil direct – reactiile de precipitare sau aglutinare sau interactiuni al caror rezultat este vizibil doar prin marcarea Ac:

fluorocrom – imunofluorescenta izotopi – dozare radioimunologica enzime – dozare imunoenzimatica

In functie de rezultatul final cuantificat, testele antigen-anticorp pot fi clasificate in primare, secundare si tertiare: evidentiere reactie Ag-Ac, evidentiere manifestari secundare (precipitare, floculare, aglutinare, fixare complement), respectiv evidentiere efecte biologice (ex: efectele biologice ale activarii complementului, cum ar fi opsonizarea, chemotaxia, fagocitoza).

Reactiile primare – teste de evidentiere a recunoasterii specifice a Ag de catre Ac. Teste cantitative includ imunofluorescenta, RIA, alte metode imunoenzimatice. In general aceste metode necesita fie antigen purificat, fie marcarea cu radioizotopi, fluorescenta sau enzimatica a anticorpului, sau implica o metoda de separare a complexelor Ag-Ac de Ag, Ac liberi din solutie.

Reactiile secundare – includ reactiile de precipitare in solutie sau gel, aglutinarea directa sau hemaglutinarea si fixarea complementului.

Reactiile tertiare – includ opsonizarea, fagocitoza, chemotaxia, aderenta imuna, degradarea celulara.

Factori ce influenteaza masurarea reactiilor antigen-anticorp sunt:

afinitatea – cu cat este mai mare afinitatea anticorpului pentru antigen, cu atat este mai stabila reactia;

aviditatea – reactia intre antigene multivalente si anticorpi multivalenti este mult mai stabila si mai usor de detectat;

raportul Ag-Ac: marimea complexelor Ag-Ac este corelata cu concentratia de Ag si de Ac;

forma fizica a Ag – un Ag particulat va fi depistat prin reactii de aglutinare, un Ag solubil va fi depistat prin reactii de precipitare.

Reactiile Ag-Ac sunt specifice si reversibile.

Reversibilitatea: complexul Ag-Ac poate fi disociat de caldura, acidifierea mediului (pH<3) sau aportul de ioni in cantitate mare.

Specificitatea: Ag este capacitatea acestuia de a reactiona specific numai cu receptorii solubili (Ac) sau membranari a caror productie a fost indusa de stimulul antigenic. Cunoasterea unuia dintre reactanti (Ag sau Ac ) permite identificarea celuilalt. Din punct de vedere al terminologiei folosite, specificitatea este un termen aplicabil conditiilor in vivo, in timp ce pentru conditiile in vitro se foloseste termenul alternativ de antigenitate. Specificitatea se refera la proprietatea unui situs combinativ al unui anticorp de a reactiona specific cu un singur determinant antigenic, sau la proprietatea unei populatii de anticorpi de a reactiona cu doar un tip de antigen. In general exista un grad inalt de specificitate in reactiile antigen-anticorp. Anticorpii pot distinge diferentele intre structura primara, secundara si tertiara a unui antigen.

Antigenele se clasifica in doua categorii importante: antigene complete, cele mai multe de natura proteica, capabile sa induca un raspuns imun celular si/sau umoral; antigene incomplete sau haptene, substante cu greutate moleculara mica, incapabile sa declanseze un raspuns imun daca nu sunt cuplate cu o molecula mare cu structura complexa, denumita purtator sau carrier.

Afinitatea este intensitatea reactiei intre un singur determinant antigenic si un singur situs combinativ al unui anticorp. Este rezultatul sumei intre toate fortele de atractie si de respingere ce exista intre determinantul antigenic si situsul combinativ.

Aviditatea este termenul utilizat pentru descrierea intensitatii legaturilor in totalitate intre un antigen cu multiplii determinanti antigenici si anticorpi multivalenti. Deci afinitatea se refera la intensitatea legaturii intre un determinant antigenic si un situs combinativ al unui anticorp, in timp ce aviditatea se refera in general la intensitatea legaturilor intre antigene si anticorpi multivalenti.

Crossreactivitatea se refera la capacitatea unor anticorpi de a se combina cu mai mult de un determinant antigenic sau la capacitatea unei populatii de anticorpi de a reactiona cu mai mult de un antigen. Crossreactivitatea apare deoarece antigenul crossreactiv are epitopi comuni cu antigenul imunizant sau pentru ca are epitopi cu structura asemanatoare unui antigen imunizant (plurispecificitate).

II IMUNOSEROLOGIADefinitie: domeniul imunologiei ce se ocupa cu studiul interactiunilor Ag-Ac in vitro.Componente esentiale: reactantii imunologici

1. ANTIGENELE2. SERURILE IMUNE

Reactantii imunologici sunt produse biologice – Ac, Ag, hematii, complement – ce sunt utilizate pentru determinari calitative si cantitative de Ag si Ac. Reactivii imunochimici contin anticorpi sub diferite forme: Seruri antiproteine plasmatice

o Polispecifice – contin Ac fata de mai multe antigene – obtinute prin imunizarea animalelor cu gamaglobuline umane

o Monospecifice – contin Ac fata de o singura proteina – se obtin prin imunizarea animalelor cu antigene foarte pure; se folosesc ca atare in determinari imunologice de tip reactii de precipitare, sau marcate fluorescentsau enzimatic pentru metode imunofluorescente sau imunoenzimatice.

o Anticorpi monoclonali Imunoplaci pt determinarea cantitativa a proteinelor umane – seruri monospecifice inglobate

in gel de agar in scopul determinarii cantitative de antigene

III. REACTII DE AGLUTINARE

Termenul de aglutinina este folosit pentru a descrie anticorpii care aglutineaza antigenele particulate, non-solubile. Anticorpii completi sunt cei de tip IgM care se leaga la determinantii antigenici ca pentamer si induc aglutinarea acestor antigene. Anticorpii incompleti sunt de tip IgG, se leaga la determinanti antigenici ai eritrocitelor dar nu pot determina aglutinarea. Cand antigenul utilizat este un eritrocit, vorbim despre reactii de hemaglutinare.Toti anticorpii pot

teoretic sa aglutineze antigene particulate, dar datorita polivalentei, anticorpii de tip IgM reprezinta clasa cea mai eficienta de aglutinine. Pentru anticorpii de tip IgG este necesar un adjuvant de tipul albuminei in reactie, al carui rol este sa reduca distanta intre celulele rosii, permitand anticorpilor de tip IgG sa lege punti intre celule.

Aglutinarea este rezultatul formarii unei retele deAg si Ac intr-un numar suficient de mare care sa permita vizualizarea cu ochiul liber. Reactiile de aglutinare sunt sensibile, pot detecta cantitati mici de Ac. Nu sunt metode cantitative, procedand insa la efectuarea de dilutii, se poate insa realiza dozarea semicantitativa.

Clasificare teste de aglutinare:

1. Teste directe sau active – particulele de reactie sunt purtatoare ale Ag specific (hematii, leucocite, trombocite, bacterii, toxoplasma, etc).

2. Teste indirecte sau pasive – particule de reactie incarcate cu un determinant Ag artificial fixat pe suprafata particulei (hematii, particule latex, microcristale de colesterol).

Aglutinarea directa: particulele purtatoare ale determinantului Ag sunt puse in contact cu Ac specifici in mediu lichid salin. Ac se combina cu Ag si formeaza o retea de aglutinare. Reactia se poate desfasura in tuburi de reactie sau pe placi de sticla sau de opalin.

Aplicatii practice ale aglutinarii directe sunt:o Determinarea grupelor sanguineo Identificarea aglutininelor la rece la 40

o Diagnosticul mononucleozei infectioaseo Diagnosticul salmonelozei

Aglutinarea indirecta: Ag solubil este fixat pe particule variabile, suspensia de particule este pusa in contact cu serul de cercetat la fel ca in cazul aglutinarii directe.

Aplicatii practice:o Diagnosticul sifilisului – Ag cardiolipidic fixat pe microcristale de colesterol in

suspensie coloidala – reactie pe lama.o Diagnosticul sifilisului prin testul de hemaglutinare a Treponemei pallidum (TPHA) –

Ag treponemic este fixat pe hematiio Diagnosticul tiroiditei autoimune- Ac anti-tiroglobulina: tiroglobulina este fixata pe

hematiio Identificare factor reumatoid – IgG sau IgM modificati; reactia Waaler-Rose sau

latex-aglutinareaAglutinarea artificiala – consta in utilizarea unui artificiu tehnic pt a provoca aglutinarea (cel mai adesea directa) a Ag particulate, de catre Ac ce nu pot aglutina spontan.

o Utilizarea de medii macromoleculare – albumina bovina, ser uman sau dextran.o Incubarea hematiilor cu enzime proteoliticeo Adugarea unei antiglobuline – test Coombs

Aglutinarea inversa – identificare antigene si nu anticorpi – Ac specifici sunt fixati pe hematii.

Teste calitative de aglutinare sunt utilizate in demonstrarea prezentei unui Ac sau a unui Ag. Anticorpii sunt mixati cu antigenele particulate si un test pozitiv este indicat de aglutinarea Ag particulat.

De exemplu se pot mixa eritrocitele unui pacient cu anticorpi in scopul determinarii grupei sanguine sau se amesteca Er cu grupa cunoscuta cu serul unui pacient primitor pentru a determina prezenta sau nu de Ac anti – Er in serul acestuia.

Teste cantitative de aglutinare utilizate pentru a masura nivelul de Ag particulate. In acest tip de teste se fac dilutii seriale pe o proba si apoi se adauga un numar fix de Er sau bacterii sau alte Ag particulate. Dilutia maxima ce produce aglutinare vizibila constituie valoare titru.In figura de mai jos, test de hemaglutinare cantitativa.

Ocazional, daca este mare concentratia de Ac (dilutii joase), nu apare aglutinare apoi daca proba este diluata, apare aglutinarea (vezi pacientul 6 in schema de mai sus). Lipsa aglutinarii la concentratii mari de Ac poarta numele de efect prozone. Lipsa aglutinarii la concentratii mari se datoreaza excesului de Ac care determina formarea de complexe mici care nu se aglomereaza in aglutinate.

Aplicatii ale testului de aglutinare:

a. Determinarea grupelor sanguine

Hemaglutinarea este de rutina folosita pentru tiparea grupelor sanguine – mixare Er pe lamela cu Ac anti_A sau anti_B si daca Ag este prezent, apare aglutinare pe lama.

b. Investigarea infectiilor bacteriene – de exemplu, cresterea de 4 ori a titrului de Ac fata de o bacterie anume este considerate titru semnificativ si indica o infectie cu acel tip de bacteria.

Aglutinarea bacteriana – este folosita pentru depistarea de Ac anti bacterieni in diagnosticul infectiei. Prezenta antigenelor bacteriene in organism determina raspuns de tip imunoglobuline specific. Punerea in contact a serului pacientului cu dilutii seriale de Ag bacteriene al presupusei infectii, determina prezenta sau nu a Ac in serul de cercetat

Aspecte practice – desi testul este usor de facut, este numai semicantitativ.

Hemaglutinarea pasiva

Testul de aglutinare lucreaza numai cu Ag particulate. Cu toate acestea, este posibila acoperirea Er cu un Ag solubil (ex: viral, polizaharid, haptena) si apoi sa se foloseasca Er acoperite de Ag solubil pentru a testa/determina prezenta de Ac specifici, anti-antigen solubil (vezi figura de mai jos). Acest test se numeste hemaglutinare pasiva, se lucreaza exact ca testele de aglutinare. Este util pentru detectia Ac anti-Ag solubile si pt detectia Ac anti-virali.

De-a lungul anilor s-a trecut de la Er la utilizarea unor particule sintetice cum ar fi particulele de latex.

Aglutinarea cu latex – anticorpii sunt atasati pe support de latex ce serveste ca marker pentru detctarea reactiei Ag-Ac. Fiecare particula de latex cu dimensiune de aproximativ 1 micron, poate fi incarcata cu mii de molecule de Ac. Particulele de latex-Ac formeaza o suspensie laptoasa si in contact cu proba de cercetat ce contine antigenul cautat, se formeaza agregate vizibile de complexe Ag-Ac. Figura de mai jos ilustreaza evenimentele asociate reactiei de aglutinare associate cu particulele de latex.

Latex aglutinarea se face de obicei pe lame de sticla sau pe suprafete de carton special tratate, utilizand volume mici de particule de latex si serul de cercetat. In laboratoarele clinice testul este folosit pentru detectarea de Ag microbiene solubile direct in ser sau lichidul cefalorahidian sau pentru identificarea unor Ag bacteriene din culturi.

Metodele sunt atractive prin rapiditate si sensibilitate, putand detecta nivele de Ag de ordinal nanogramelor/ml.

. Testul antiglobulinic – testul Coomb’s

1. Testul Coomb’s direct – Cand Ac se leaga la Er nu determina intotdeauna aglutinare datorita excesului de Ag sau de Ac sau in cazul modificarilor electrice la nivelul Er ce impiedica reactiile de linkare. Acesti Ac care se leaga la Er dar nu determina aglutinare se numesc Ac incompleti – definitie functionala si nu una care sa sugereze structura diferita a Ac. Pt a fi detectati Ac non-aglutinanti de pe suprafata Er se adauga un al doilea Ac indreptat impotriva Ac de pe Er. Acest Ac anti-imunoglobulina poate cross-linka Er si determina aglutinarea = test Coomb’s direct.

2. Testul Coomb’s indirect – detecteaza prezenta de Ac antir-Er prezenti in ser. Presupune incubarea Er cu probe de ser, spalarea lor pt indepartarea Ac nelegati si apoi adaugarea unui al doilea Ac anti-imunoglobulina care va depista Ac legati pe suprafata Er si va cross-linka celulele.

Aplicatii practice – detectarea Ac anti – Rh – in general Ac anti-Rh nu aglutineaza Er. Astfel Er copilului cu Rh+ nascut din mama Rh- care are Ac anti-Rh, pot fi acoperite cu acesti Ac. Pt a verifica se face un test Coomb’s direct. Pt a verifica prezenta Ac anti-Rh in sangele mamei se face testul Coomb’s indirect.

Inhibitia hemaglutinarii

Testul de aglutinare poate fi modificat pt a fi folosit la masurarea Ag solubile. Acest test este numit test de inhibitie a hemaglutinarii – masoara capacitatea unui Ag solubil de a inhiba aglutinarea unor Er acoperite cu Ag de catre Ac. In acest test, o cantitate fixa de Ac fata de un Ag este amestecata cu o cantitate fixa de Er acoperite cu Ag. Se adauga cantitati variabile din serul de cercetat care este investigat pt detectarea prezentei Ag. Daca proba contine Ag, Ag solubil va competitiona cu Ag de pe suprafata Er impiedicand aglutinarea.

Prin dilutii seriate se masoara cantitatea de Ag in proba necunoscuta prin titrare. Cuantifica in general Ag solubile. Metoda este larg utilizata in clinica pentru a determina daca un pacient a fost expus la o anumita infectie virala (ex: rubeola) sau nu sau pentru teste de sarcina (HCG, Ac anti HCG). Daca serul pacientului contine Ac anti-virali, acestia vor interactiona cu ag viral si inhiba hemaglutinarea.

Aplicatii practice:

Dg serologic boli infectioase: febra tifoida, salmonella, Brucella

Determinare Ac specifici tisulari in BAI

Detectarea prezentei epitopilor antigenic pe celule

Tipizarea sangelui

Dg infectiilor virale; aglutinarea bacteriana