241

APOPTOZA

12

12.1. Scurt istoric Termenul de moarte celulară programată a apărut în anii ’60

(Locksin şi Williams, 1964), iar cel de apoptoză a fost introdus în articolele ştiinţifice moderne de către Kerr, Wiyllie şi Currie (1972), pentru a descrie o formă de moarte celulară distinctă faţă de necroză.

Termenul de apoptoză era folosit încă din Grecia antică, cu sensul de “decădere din testament” şi aceasta a rămas etimologia acceptată în ştiinţele biomedicale. Prima menţionare a termenului αποπτωσισ (= apoptosis) se pare că i-a aparţinut lui Hypocrates din Cos, părintele medicinei (aprox. 460 – 370 î.Chr.), care l-a utilizat în pasajul 35: 376 al cărţii Mochlicon, un tratat despre reducerea entorselor. Traducerea textuală înseamnă “micşorarea oaselor”, dar contextul medical în care apare termenul în cartea Mochlicon este mai ilustrativ decât citatul individual. Capitolul 35 tratează cauzele gangrenei provocată de tratamentul fracturilor cu bandaje, aşa cum se relatează în traducerea engleză (Mochlicon, The University Press, Aberdeen, 1928). În concluzie, termenul de apoptoză a fost inventat pentru a descrie modificările structurale ale ţesuturilor (eroziunea osoasă) şi moartea celulară.

După Hypocrates, termenul apoptosis apare şi în alte scrieri medicale ale antichităţii. De notat faptul că Galen (129 – 201 d. Chr.) a extins semnificaţia medicală a termenului în “căderea crustelor” şi această utilizare a fost apoi tradusă ca “ad crustas resolvendas” în textele medicale romane, cum ar fi “Obstretics” de Soranus. Pentru posteritate, Galen şi alţi autori de articole medicale din Roma antică şi-au dovedit geniul, intuind rolul apoptozei în vindecarea rănilor şi în inflamaţie.

În 1885 apăreau primele diagrame ale apoptozei şi unii cercetători observau pe insecte moartea ţesuturilor aflate în metamorfoză. Din diverse motive, ideea unei morţi celulare fiziologice, cu importanţă medicală şi

242

biologică, nu a avut rezonanţă până în urmă cu câteva decenii, când s-a observat că în gerontologie, teratologie, în bolile neurodegenerative şi în stările de imunodeficienţă, ca şi în infarctul miocardic sau accidentele vasculare cerebrale (stroke), pierderile de celule constituie un factor de limitare a bolii, în timp ce în multe forme de cancer scăderea răspunsului celular la semnalele morţii reprezintă un factor major în răspândirea celulelor tumorale.

De ce a trecut atât de mult timp până când apoptoza a ajuns în prim planul cercetării ştiinţifice? Poate pentru faptul că ideea conform căreia viaţa are nevoie de moarte pare paradoxală, dar cu toate acestea “sinuciderea” celulară s-a dovedit a fi esenţială pentru supravieţuirea unui organism.

12.2. Apoptoza şi moartea celulară programată Conceptul funcţional de moarte celulară programată presupune

participarea activă a celulei la propria sa moarte (sinuciderea celulară), prin activarea unui program genetic, apoptoza fiind implicată în organogeneză, în menţinerea homeostaziei tisulare şi în imunitate, dar şi în multe stări patologice. Caracteristicile morfologice uniforme observate la celulele apoptotice provenite de la organisme diferite sugerează faptul că există un mecanism comun, conservat pe scara evoluţiei, care declanşează moartea celulară programată. Apoptoza excesivă sau, dimpotrivă, absenţa ei poate avea implicaţii patologice majore (de exemplu, într-o serie de afecţiuni neurodegenerative, cum ar fi boala Parkinson, se înregistrează un procent ridicat de celule apoptotice, în timp ce scăderea ritmului apoptozei poate conduce la cancer). Una din caracteristicile importante ale apoptozei este susceptibilitatea la intervenţia terapeutică, putând fi modulată de agenţi farmacologici diverşi, ceea ce oferă speranţe pentru obţinerea de tratamente noi, mai eficace.

Apoptoza este definită prin modificări funcţionale şi morfologice caracteristice. Astfel, volumul celulelor apoptotice se micşorează, dimensiunile nucleului se reduc, în timp ce cromatina se condensează, mitocondriile se sparg şi eliberează citocromul c. ADN-ul celular este degradat la nivelul situsurilor de legătură internucleozomale, rezultând fragmente de ADN egale (formate din 180 de perechi de baze). Proteinele din membrana celulară dezvoltă legături transversale, astfel încât membrana devine mai rigidă. Fosfatidilserina, fosfolipidul care în mod normal se află orientat către interiorul membranei plasmatice, este expusă acum la

suprafaţă, fiind recunoscută de receptorii celulelor fagocitare. Pe suprafaţa membranei apar vezicule. Integritatea membranei celulare se menţine pentru un timp, dar, în final, membrana se fragmentează. Celulele se desprind unele de altele şi sunt înlăturate înainte de apariţia moleculelor pro-inflamatorii. Durata de viaţă a celulelor apoptotice este de câteva ore, astfel încât, în secţiunile tisulare se regăseşte un procent scăzut de celule apoptotice. Apoptoza afectează de obicei celule individuale, iar distribuţia lor în ţesut este aleatorie.

În schimb, necroza este un mod pasiv de moarte celulară, care implică frecvent grupuri masive de celule şi un răspuns inflamator important. Atât apoptoza, cât şi necroza pot apare în acelaşi timp în acelaşi ţesut, în funcţie de intensitatea factorilor declanşatori (Fig. 12.1).

Fig. 12.1 – Modificări structurale în apoptoză şi necroză

243

244

În tabelul următor apoptoza şi necroza sunt prezentate comparativ:

Caracteristici şi mecanisme

patologice Apoptoza Necroza

Modelul morţii celulare Celule singulare Grupuri mai mari

de celule Dimensiunea celulelor Contracţie, fragmentare Balonizare

Membrana plasmatică

Continuitatea păstrată, neregularităţi ale membranei, fosfatidilserina exprimată la suprafaţă

Membrană netedă, liză timpurie

Mitocondriile

Permeabilitate membranară crescută, conţinutul (citocrom c, apaf-1) eliberat în citoplasmă, structură relativ conservată

Balonizare, modificări structurale

Alte organite Contracţie, corpusculi apoptotici Balonizare, dezmembrare

Degradarea ADN

Fragmentare, clivaj internucleozomal, eliberarea capetelor 3’, ADN în citoplasmă

Difuză, aleatorie

Degradarea celulară Fagocitoză, absenţa inflamaţiei Inflamaţie, invazia

macrofagelor Stimuli generali

Semnale endogene şi intercelulare, procese patologice Procese patologice

Stimuli specifici

Lipsa factorilor de creştere (NGF, IL-2), legarea activatorilor morţii (citokine - TNFα, limfotoxine, ligandul Fas, TRAIL) la receptori de suprafaţă, toxice celulare (hormoni, radiaţii, ischemie medie, creşterea oxidanţilor celulari), lezarea ADN

Toxine, ischemie severă, radiaţii

Procese celulare

Reacţii în cascadă (activarea caspazelor, a endonucleazelor internucleozomale, necesită sinteze proteice, ATP)

Independentă energetic, depleţie de ATP, fără sinteze proteice

245

Apoptoza poate fi consecinţa absenţei factorilor de supravieţuire sau a expunerii la factori nocivi, letali. Necesarul de factori de supravieţuire (de exemplu, factorii de creştere neuronali; interleukina-2, esenţială pentru mitoza limfocitelor) depinde de tipul de celulă, de statusul funcţional al celulei sau de prezenţa unor stimuli letali, cum ar fi:

- creşterea nivelului oxidanţilor în interiorul celulei; - lezarea ADN-ului de către oxidanţi sau alţi agenţi: radiaţiile

ultraviolete, razele X, chimioterapia; - molecule care se leagă la receptori specifici de pe suprafaţa

celulei şi semnalizează iniţierea programului de apoptoză; printre aceşti activatori ai morţii celulare se numără: • TNF-α (factorul de necroză tumorală α), care se leagă la receptorul TNF; • limfotoxina (TNF-β), se leagă tot la un receptor TNF; • ligandul Fas (FasL), care se leagă la receptorul Fas (CD95)

Apoptoza necesită expresia sau supresia anumitor gene. Endonucleazele, transglutaminazele tisulare şi proteazele sunt activate. Inhibiţia ARNm sau sintezele proteice pot provoca sau bloca apoptoza, în funcţie de echilibrul între factorii letali şi protectivi într-o anumită celulă.

Există două cauze principale care pot declanşa apoptoza: 1. Moartea celulară programată este necesară pentru dezvoltarea

normală, ca şi mitoza; iată câteva exemple: - resorbţia cozii mormolocilor de broască în timpul metamorfozei

se produce prin apoptoză; - formarea degetelor fătului necesită îndepărtarea, prin apoptoză, a

ţesutului dintre ele; - îndepărtarea endometrului uterin la începutul menstruaţiei se

face prin apoptoză; - formarea conexiunilor optime între neuronii cerebrali necesită

eliminarea prin apoptoză a celulelor în plus. 2. Moartea celulară programată intervine în distrugerea celulelor

care reprezintă o ameninţare pentru integritatea organismului: - una dintre căile prin care limfocitele T citotoxice omoară celulele

infectate viral este inducerea apoptozei; - în cazul scăderii răspunsului imun mediat celular, celulele

efectoare trebuie îndepărtate, pentru a preveni atacarea componentelor proprii ale organismului; limfocitele T citotoxice induc apoptoza şi chiar propria lor distrugere; defectele apărute în mecanismele apoptotice sunt asociate cu bolile autoimune, cum ar fi lupusul eritematos şi artrita reumatoidă (Fig. 12.2);

Fig. 12.2 – Implicarea celulelor T citotoxice în apoptoză - leziunile genomului celular pot provoca anomalii de dezvoltare

embrionară şi malformaţii sau pot determina transformarea malignă; celulele răspund la lezarea ADN-ului prin creşterea producţiei de p53, un inductor important al apoptozei; mutaţiile apărute în gena p53 produc o proteină anormală, fiind frecvent semnalate în cancer;

- radioterapia şi chimioterapia utilizate în cancer induc apoptoza anumitor tipuri de celule canceroase.

12.3. Controlul biochimic şi genetic al apoptozei

246

Căile apoptotice includ un senzor care detectează semnalul de inducţie a morţii celulare, o reţea de transducţie a semnalului şi un mecanism efector. Procesul apoptotic poate fi divizat în trei faze funcţionale distincte: faza de inducţie – se referă la o anumită modificare produsă în mediul celular, care conduce la activarea apoptozei prin mecanisme receptoare şi de transducţie a semnalului; faza de execuţie – cuprinde procesele intracelulare care rezultă în urma apoptozei; faza de degradare – include evenimentele asociate “punctului fără întoarcere” (point of no return).

247

12.3.1. Inductori apoptotici Gena p53 p53 este o genă tumorosupresoare, ale cărei mutaţii constituie cele

mai frecvente modificări genetice în cancerul uman şi, de asemenea, joacă un rol deosebit în procesele benigne: de exemplu, expresia sa este crescută în moartea neuronală indusă de ischemia cerebrală experimentală, iar la nivelul timocitelor, p53 intervine în apoptoza determinată de radiaţii şi de medicamente care lezează ADN-ul. Modul de acţiune al p53 este complex. p53 este implicată în apoptoza declanşată de absenţa factorilor de supravieţuire. p53 scade transcripţia genelor antiapoptotice (bcl-2) şi o creşte pe cea a antagoniştilor (bax). Factorii externi de supravieţuire sau stimularea expresiei Bcl-2 protejează celulele de moartea indusă de p53.

Cercetările recente s-au axat pe stabilirea rolului p53 în oprirea ciclului celular în faza G1, precum şi pe implicarea sa în apoptoză. Este cunoscut faptul că p53 poate fie să regleze proliferarea celulară, fie să inducă apoptoza, în funcţie de circumstanţe. p53 interacţionează cu gena Rb (genă tumorosupresoare, de susceptibilitate la retinoblastom). Acţiunea apoptotică a p53 poate compensa absenţa genei Rb funcţionale, prevenind astfel transformarea malignă.

Proteina Rb împiedică progresia ciclului celular din G1 în S, prin inhibarea membrilor familiei E2F de factori transcripţionali, blocând astfel expresia multor gene implicate în faza S. La nivelul cristalinului în dezvoltare, gena Rb determină oprirea proceselor de creştere celulară şi evoluţia spre diferenţierea finală.

Studii efectuate pe şoareci deficienţi în gena Rb au arătat că, în acest caz, celulele continuă să intre în faza S; totuşi, existenţa genei p53 active determină evoluţia celulelor spre apoptoză. Astfel de şoareci au o dezvoltare oculară anormală (microoftalmie), dar nu dezvoltă tumori. Şoarecii deficienţi în p53, dar cu o funcţionare optimă a Rb au o dezvoltare oculară normală. Şoarecii cu ambele deficienţe nu pot fi studiaţi, deoarece mor în timpul gestaţiei, dar efectul absenţei ambelor gene poate fi obţinut pe şoareci transgenici pentru genele E6 şi E7 ale virusului Herpes, care inactivează p53 şi Rb. Astfel de şoareci dezvoltă tumori oculare. Prin urmare, în absenţa Rb acţiunea apoptotică a p53 este esenţială, datorită activităţii sale tumorosupresoare. Funcţiile ambelor gene sunt strâns legate de evenimentele ciclului celular din faza G1. Gena Rb este legată de tranziţia G0/ G1. p53 este capabilă să inducă oprirea în G1 şi apoptoza. Razele X şi alţi agenţi care lezează ADN-ul cresc nivelul p53 printr-un mecanism posttranslaţional. Creşterea p53 stopează ciclul în G1.

248

Familia proteinelor Bcl-2 Proteinele Bcl-2 reprezintă o clasă importantă de reglatori ai căilor

apoptotice şi cuprinde atât membrii care stimulează supravieţuirea celulară (Bcl-2, Bcl-XL), cât şi membrii pro-apoptotici (Bax şi Bik). Expresia genei Bcl-2 este crescută în celulele B maligne. De asemenea, s-a demonstrat că este activată în majoritatea limfoamelor non-hodgkiniene, precum şi în condiţii benigne, cum ar fi hipertrofia foliculară a nodulilor limfatici şi a amigdalelor. În multe tipuri de celule – limfocite, fibroblaşti, neuroni, celule hematopoietice – expresia Bcl-2 întârzie sau chiar blochează apoptoza. În aceleaşi celule, scăderea reglării prin Bcl-2 poate stimula apoptoza. Proteina Bcl-2 este asociată membranelor, în celulele intacte fiind localizată în învelişul nuclear, precum şi la nivelul membranelor reticulului endoplasmic şi mitocondriei. Bcl-2 este înrudită cu o serie de proteine virale, aparţinând adenovirusurilor sau virusului Epstein-Barr. Anumite gene funcţionează ca şi Bcl-2 în inhibarea apoptozei; altele (Bax, Bcl-XS) se opun acţiunii Bcl-2 şi promovează apoptoza. Se pare că apoptoza este reglată nu numai de Bcl-2, ci şi de raportul dintre Bcl-2 şi Bax, în celulele unde acestea coexistă. Formarea heterodimerilor Bcl-2/Bax constituie un “reostat” pre-programat în interiorul celulelor, determinând extinderea apoptozei. Bcl-2 îşi poate exercita acţiunea anti-apoptotică prin îndepărtarea radicalilor liberi oxidativi. Bcl-2 nu poate bloca toate formele de apoptoză: apoptoza indusă prin TNF nu este afectată de Bcl-2. Bcl-2 acţionează sinergic cu o serie de oncogene (de exemplu, c-myc) în reglarea apoptozei.

Oncogena myc Oncogena myc pare să activeze un program genetic comun, care

poate determina atât diviziunea, cât şi moartea celulară. Prezenţa sau absenţa semnalelor adiţionale (cum ar fi factorii externi de supravieţuire sau Bcl-2) poate determina destinul celulei: expresia necontrolată a myc stimulează proliferarea celulară în prezenţa factorilor de creştere, dar în celulele deficiente în aceşti factori induce apoptoza. Myc activează transcripţia p53, iar inducţia morţii celulare prin myc presupune intervenţia p53.

Pentru a explica rolurile aparent contradictorii al myc în proliferare şi apoptoză au fost propuse câteva modele. Unul dintre ele este “modelul conflictului”, în care myc apare ca un promotor al proliferării. În prezenţa mitogenilor (factori care influenţează creşterea şi diferenţierea celulară), nu există nici un conflict între acţiunea myc şi alte semnale primite de celule. Atunci când mitogenii sunt absenţi sau când este administrat un citostatic,

249

apare un conflict între semnalele de proliferare provenite de la myc şi alte semnale, de încetare a proliferării. Acest conflict pare să declanşeze apoptoza. Rolurile myc în proliferare şi în apoptoză sunt strâns legate. Myc este un reglator transcripţional care acţionează printr-un domeniu transactivator amino-terminal, implicat atât în proliferare, cât şi în apoptoză. Nivelul expresiei myc se corelează atât cu capacitatea proliferativă, cât şi cu susceptibilitatea la apoptoză. În final, myc formează prin heterodimerizare un complex activ cu o proteină partener, numită max, complex care intervine atât în proliferare, cât şi în apoptoză. Un alt model este cel al “semnalului dual”, în care myc activează simultan proliferarea şi căile apoptotice.

12.3.2. Mecanismele efectorii ale apoptozei Mecanismele apoptotice includ trei componente principale:

proteazele morţii (caspazele), moleculele adaptor CED-4/Apaf-1 şi membrii familiei Bcl-2. Caspazele reprezintă braţul executor al mecanismelor apoptotice. CED-4/Apaf-1 par să joace un rol critic în conversia pro-caspazelor în caspaze active prin interacţiuni fizice directe. Familia Bcl-2 include atât membrii pro-, cât şi antiapoptotici, care se influenţează reciproc pentru a echilibra balanţa între diferite condiţii de mediu.

Caspazele O familie de proteaze cisteinice, denumite caspaze, joacă un rol

important în mecanismele morţii celulare. Există mai multe caspaze clonate şi caracterizate la mamifere şi o mare parte dintre ele sunt implicate în procesele apoptotice. Ele sunt sintetizate în celule ca precursori inactivi compuşi din patru domenii distincte: un domeniu amino-terminal, o subunitate mare (20 kDa), o subunitate mică (10 kDa) şi o regiune de legare între cele două domenii, flancată de un rest aspartat. Activarea fiecărei caspaze este indusă de clivajul proteolitic dintre domenii, constând în îndepărtarea pro-domeniilor şi a regiunilor de legare şi asamblarea celor două subunităţi într-un complex enzimatic activ. Caspazele pot fi împărţite în iniţiatori şi efectori. Două cascade caspazice principale au fost definite în celulele mamiferelor. Activarea pro-caspazei-8 necesită cuplarea cu proteina adaptor FADD (Fas associated death domain, proteina asociată domeniului morţii al Fas), prin intermediul DED (death effector domain, domeniul efector al morţii), în timp ce activarea pro-caspazei-9 necesită mai

250

mulţi factori, incluzând Apaf-1, citocromul c şi ATP. Diferite caspaze de iniţiere mediază seturi distincte de semnale. De exemplu, caspaza 8 este asociată cu apoptoza prin receptorul Fas, iar caspaza-9 este implicată în moartea indusă de agenţi citotoxici. Un semnal pro-apoptotic determină activarea unei caspaze de iniţiere, care la rândul ei, activează o caspază efector, cum este caspaza-3, ceea ce conduce la dezasamblarea celulară. Acest model explică cum semnale apoptotice distincte induc aceleaşi modificări biochimice şi morfologice caracteristice apoptozei. Un mecanism potenţial de control al activării caspazelor de iniţiere poate implica blocarea interacţiunilor dintre pro-caspaze şi activatorii lor.

Căile apoptotice Calea receptorilor morţii este declanşată de membrii unei

superfamilii de receptori pentru factorii de necroză tumorală (TNFR). Receptorii morţii sunt receptori celulari de suprafaţă, care transmit semnalele apoptotice iniţiate de liganzi specifici. Ei joacă un rol important în apoptoză şi pot activa cascada caspazică în câteva secunde de la ataşarea ligandului. Inducţia apoptozei prin acest mecanism este deci foarte promptă. Printre cei mai bine caracterizaţi receptori ai morţii se află CD95 (sau Fas), TNFR1 şi receptorii DR4 şi DR5 ai TRAIL (TNF related apoptosis-inductive ligand, ligandul care induce apoptoza înrudit cu TNF).

CD95/Fas are trei roluri principale: - anihilarea celulelor infectate viral, mediată de celulele T citotoxice; - distrugerea celulelor T activate la sfârşitul răspunsului imun; - distrugerea celulelor inflamatorii şi imune în situsurile

“privilegiate” din punct de vedere imun (camera anterioară a ochiului, testicule).

Ligandul pentru CD95 (CD95L sau FasL) este un trimer, care, prin asocierea cu receptorul, determină trimerizarea acestuia. Ca urmare, are loc o grupare intracelulară a regiunilor din receptor care alcătuiesc domeniile morţii (DD). Aceasta permite proteinei adaptor FADD, să se ataşeze la receptor prin interacţiunea dintre domeniile omoloage. Proteina FADD conţine şi un domeniu efector al morţii (DED), care permite legarea pro-caspazei-8 la complexul proteină FADD – receptor CD95 (Fig. 12.3).

Fig. 12.3 – Complexul FasL - CD95 – FADD – pro-caspază 8 Pro-caspaza-8 (cunoscută şi ca FLICE) se asociază cu FADD prin

intermediul propriului domeniu efector al morţii, care odată recrutat de FADD, este imediat clivat pentru a produce caspaza 8. Complexul de proteine – CD95, FADD şi pro-caspaza 8 – care declanşează apoptoza este cunoscut ca DISC (death- inductive signaling complex, complexul semnalizator care induce moartea). Activarea caspazei 8 poate fi blocată prin recrutarea unui omolog degenerat al caspazei, c-FLIP.

Calea mitocondrială este utilizată mai ales în cazul unor stimuli externi sau leziuni interne, cum ar fi lezarea ADN. Aceste căi diferite de răspuns converg la nivelul mitocondriei, prin activarea unui membru proapoptotic al familiei Bcl-2. Spre deosebire de Bcl-2, care rămâne mereu ataşat la membranele intracelulare, alţi membrii ai familiei, incluzând Bax, Bad, Bim şi Bid, se mişcă între citosol şi organite. Formele citosolice reprezintă grupul de proteine inactive, dar gata de acţiune. Semnalele proapopotice direcţionează aceste proteine către mitocondrie, unde se va

251

decide soarta celulei. Activarea membrilor proapoptotici se poate face prin proteoliză, defosforilare sau alte mecanisme. Membrii pro- şi anti-apoptotici ai familiei Bcl-2 se întâlnesc la suprafaţa mitocondriei, unde vor competiţiona pentru reglarea ieşirii citocromului c printr-un mecanism care este încă discutat. Dacă factorii pro-apoptotici au câştig de cauză, o gamă largă de molecule va fi eliberată din compartimentul mitocondrial. Dintre acestea, cel mai important este citocromul c, care se asociază cu Apaf-1 şi cu pro-caspaza 9 (şi, probabil, şi cu alte proteine) pentru a forma apoptozomul. Proteinele de şoc termic acţionează la nivele multiple în această cascadă pentru a modula apoptoza.

Cele două căi converg la nivelul activării caspazei-3. Activarea caspazei-3 şi funcţionarea sa ulterioară sunt antagonizate de către proteinele IAP, care la rândul lor sunt antagonizate de proteina Smac/DIABLO eliberată din mitocondrie. În aval de caspaza-3, cascada apoptotică se ramifică, ducând în final la dezmembrarea controlată a celulei (Fig. 12.4).

Fig. 12.4 – Căile apoptozei

252

Rolul mitocondriei în apoptoză Mitocondria joacă un rol important în reglarea morţii celulare. De

exemplu, membrii anti-apoptotici ai familiei de proteine Bcl-2, cum sunt Bcl-2 şi Bcl-XL sunt localizaţi în membrana mitocondrială externă şi acţionează în sensul promovării supravieţuirii celulare. Alţi membrii pro-apoptotici ai familiei Bcl-2, cum sunt Bad şi Bax îşi mediază efectele prin intermediul mitocondriei, fie prin interacţiunea cu Bcl-2 şi Bcl-XL, fie prin interacţiunea directă cu membrana mitocondrială (Fig. 12.5).

Fig. 12.5 – Rolul mitocondriei în apoptoză

Mitocondria are posibilitatea de a promova apoptoza prin eliberarea

citocromului c. Acesta, împreună cu Apaf-1 şi ATP, formează un complex cu pro-caspaza 9, numit apoptozom, care determină activarea caspazei 9 şi a cascadei caspazice (Fig. 12.6).

253

Fig. 12.6 – Formarea apoptozomului, activarea caspazei 9 şi declanşarea

cascadei apoptotice Se pare că Bax şi Bad, ca şi alte proteine din familia Bcl-2, pot

forma pori prin membrana mitocondrială externă, determinând pierderea potenţialului de membrană şi efluxul citocromului c şi al AIF (factorul de inducţie al apoptozei). În schimb, Bcl-2 şi Bcl-XL acţionează în scopul prevenirii formării porilor. Heterodimerizarea Bax sau Bad cu Bcl-2 sau Bcl-XL inhibă aceste efecte protectoare.

12.3.3. Modificări nucleare în timpul apoptozei Unul din markerii apoptozei îl constituie clivajul ADN în unităţile

nucleozomale. Degradarea ADN-ului în nucleii celulelor apoptotice apare într-o serie de căi consecutive activării caspazelor şi se desfăşoară în câteva etape:

1. Inactivarea enzimelor implicate în reparaţia ADN. Enzima poli (ADP-riboză) polimeraza (PARP) a fost prima proteină identificată ca fiind un substrat al caspazelor. PARP este implicată în repararea leziunilor ADN şi funcţionează prin catalizarea sintezei de poli (ADP-riboză), prin legarea de rupturile lanţurilor ADN şi prin modificarea proteinelor nucleare. Caspaza 3 clivează PARP, împiedicând astfel repararea leziunilor ADN.

254

2. Inactivarea enzimelor implicate în replicarea celulară. ADN topoizomeraza II este o enzimă nucleară esenţială pentru replicarea ADN şi reparare. Caspazele pot inactiva această enzimă, determinând leziuni ADN.

3. Degradarea proteinelor structurale nucleare. Lamina este o proteină intranucleară care contribuie la menţinerea formei nucleului şi mediază interacţiunile dintre cromatină şi membrana nucleară. Degradarea laminei de către caspaza 6 determină condensarea cromatinei şi fragmentarea nucleară, observată în celulele apoptotice.

4. Fragmentarea ADN. Fragmentarea ADN în unităţile nucleozomale este provocată de o enzimă numită CAD (DN-aza activată de caspaze). În mod normal, CAD există sub forma unui complex inactiv cu ICAD (inhibitorul CAD sau factorul 45 de fragmentare al ADN). În timpul apoptozei, ICAD este clivat de caspaze, incluzând caspaza 3, pentru a elibera CAD. Deoarece CAD este o DN-ază cu activitate specifică intensă (comparabilă sau chiar mai puternică decât DN-aza I şi DN-aza II), apare o fragmentare rapidă a ADN-ului nuclear (Fig. 12.7).

Fig. 12.7 – Fragmentarea ADN în procesul apoptotic

255