Microbiologie generală - Lucrări laborator Conferenţiar dr. Marian Jelea

TEHNICA ÎNSĂMÂNŢĂRII MICROORGANISMELOR

ÎNSĂMÂNŢARE: trecerea pe medii de cultură a microorganismelor din diverse surse (apă, sol, aer, produse patologice, produse alimentare etc.) în vederea cultivării şi izolării lor în culturi pure.

Microorganismele se cultivă pe medii de cultură în scopuri diferite:

pentru examinarea caracterelor în vederea identificării lor: culturale; morfologice; biochimice; serologice;

pentru a le conserva; pentru prepararea vaccinurilor; pentru a le inocula la animale în vederea preparării serurilor imune; pentru determinarea patogenităţii; pentru folosirea lor în diverse activităţi industriale.

În timpul executării însămânţărilor trebuie să se ţină seama de următoarele reguli:

se execută în faţa unui bec de gaz; se evită mişcarea altor persoane în preajma celui ce lucrează; se interzice să se vorbească; lucrările se execută rapid, urmărindu-se un contact minim între

materialul de însămânţat şi aerul din încăpere; se va evita atingerea instrumentarului cu care se execută însămânţarea

de orice obiect nesteril; cât timp recipientele sunt deschise acestea se menţin într-o poziţie cât

mai oblică, cu gura în imediata apropiere a flăcării becului de gaz.

Tipuri de însămânţări:

cu pipeta Pasteur sau pipeta gradată; cu ansa; prin înţepare; în cutii Petri (înainte sau după solidificarea mediului).

1

Microbiologie generală - Lucrări laborator Conferenţiar dr. Marian Jelea

1. Însămânţarea cu pipeta PasteurEprubetele cu mediile ce urmează a fi însămânţate se aşează într-un stativ la îndemâna

mâinii stângi a executantului. Se recomandă ca întotdeauna să se însămânţeze perechi de medii şi anume un mediu lichid şi unul solid.

Materialul de însămânţat se aşează în faţa executantului, lângă becul de gaz, iar la îndemâna mâinii drepte trebuie să se găsească stativul cu anse, cu pipete Pasteur, cu spatule de flambare şi un vas cu soluţie dezifectantă pentru pipetele folosite.

Se ia în mâna dreaptă pipeta Pasteur (între degetul mare şi cel mijlociu), se flambează extremitatea prin care se aspiră, apoi i se rupe vârful şi se trece de câteva ori prin flacără.

În mâna stângă se ia eprubeta cu materialul ce urmează a fi însămânţat.Cu degetele mic şi inelar al mâinii drepte se scoate dopul, se flambează gura eprubetei

şi se introduce prin flacără vârful pipetei în eprubetă. Se aspiră o cantitate mică din materialul de însămânţat. Se scoate pipeta din lichid, se

flambează gura eprubetei şi se închide cu dopul de vată. Se pune eprubeta cu materialul de însămânţat în stativ.

Se ia eprubeta cu mediul lichid ce urmează a fi însămânţat. Se scoate dopul, se flambează gura eprubetei, se introduce pipeta cu materialul de însămânţat, se lasă să curgă, oprind câteva picături. Se scoate pipeta din eprubeta cu mediul lichid, se flambează gura eprubetei şi se închide cu dopul. Se pune eprubeta cu mediul lichid însămânţat înapoi în stativ.

Se ia eprubeta cu mediul solid înclinat. Se deschide, se flambează şi se introduce pipeta oprindu-se vârful în dreptul extremităţii superioare a mediului înclinat şi se însămânţează lăsând materialul să se prelingă pe suprafaţa mediului de sus în jos. Se scoate pipeta din eprubetă, se flambează şi se închide eprubeta, aşezându-se apoi în stativ.

Pipeta cu care s-a executat însămânţările se va introduce în vasul dezinfectant.

2. Însămânţarea cu ansaSe ia din stativ cu mâna dreaptă ansa de însămânţare şi se sterilizează în flacăra

oxidantă a flăcării becului de gaz (în vârful flăcării) acul ansei prin încălzire la roşu, iar tija prin flambare, de trei ori succesiv.

Se aşteaptă câteva secunde pentru răcirea ansei.Se deschide eprubeta cu materialul de însămânţat şi se flambează gura eprubetei.Se ia cu ansa o cantitate mică de cultură microbiană, prin raclare.Se închide apoi eprubeta, flambându-i mai întâi gura la flacără.Se introduce ansa cu materialul de însămânţat în eprubeta cu mediul lichid. Se agită

acul ansei în mediul lichid. Se scoate ansa din eprubeta care se flambează, se închide şi se aşează în stativ.

Fără a se flamba ansa, se trece la însămânţarea mediului solid înclinat. Însămânţarea pe mediul solid înclinat se poate efectua în două moduri: se plimbă vârful acului în zig-zag pe suprafaţa mediului, pornind din lichidul de

condensare (de la bază) spre partea superioară a mediului; se clăteşte vârful acului în lichidul de condensare, se scoate ansa, se închide

eprubeta cu dopul de vată (asigurând sterilitatea prin flambarea eprubetei) şi apoi se întinde lichidul din eprubetă pe suprafaţa mediului prin înclinarea eprubetei.

Vârful umed al ansei se sterilizează prin aducere la roşu, introducându-l mai întâi în partea inferioară (rece, reducătoare) a flăcării becului de gaz, până se usucă. Apoi se ţine în partea superioară (caldă, oxidantă) a flăcării până la înroşirea întregului fir. Tija ansei se trece apoi de câteva ori prin flacără. Ansa sterilă se aşează în stativ.

2

Microbiologie generală - Lucrări laborator Conferenţiar dr. Marian Jelea

3. Însămânţarea prin înţepareAcest tip de însămânţare se realizează în eprubete cu mediu solid drept (agar solidificat

vertical). Se efectuează cu acul drept.După ce acul a fost încărcat cu materialul de însămânţat (din eprubeta cu mediu

lichid), acesta se introduce în profunzimea mediului drept, pe linia mediană.În timpul însămânţării eprubeta cu mediul drept se ţine vertical, cu deschiderea (gura)

în jos, însămânţarea făcându-se cu acul, de jos în sus. Pe parcursul efectuării însămânţării se vor respecta aceleaşi reguli de menţinere a

sterilităţii acului şi eprubetelor cu medii ca şi în cazul tehnicilor prezentate anterior.

4. Însămânţarea în cutii PetriAcest tip de însămânţare se execută pe suprafaţa mediilor solide turnate în cutii Petri.Mediul solid (de ex. geloza simplă) se lichefiază pe baia de apă şi apoi se răceşte la 45-50 0C.

Se toarnă apoi, în condiţii de sterilitate, în cutii Petri sterile, în aşa fel ca să se obţină un strat de 4-5 mm grosime.

Însămânţarea în cutii Petri se poate efectua în două moduri: înainte de solidificarea mediului; după solidificarea mediului.

Însămânţarea în cutii Petri înainte de solidificarea mediului se realizează astfel: după turnarea mediului în cutie, înainte de solidificarea acestuia, se execută

însămânţarea prin pipetarea unei cantităţi (câteva picături) din materialul de însămânţat (cu pipeta Pasteur sau cu pipeta gradată); de obicei materialul de însămânţat este diluat în apă de robinet sterilă sau în ser fiziologic);

se omogenizează bine mediul prin rotirea cu atenţie a cutiei Petri pe masa de laborator; trebuie avut în vedere ca mediul nutritiv să nu ajungă pe capacul cutiei.

Însămânţarea în cutii Petri după solidificarea mediului se realizează astfel: după turnarea mediului în cutiile Petri se aşteaptă solidificarea acestuia; se

recomandă introducerea cutiilor Petri cu medii în incubator, la 280C, timp de o oră, pentru eliminarea excesului de apă şi a lichidului de condens;

din materialul de însămânţat (lichid) se prelevează o cantitate cu o pipetă Pasteur sau cu o pipetă gradată, respectând regulile de păstrare a sterilităţii materialelor şi a ustensilelor;

întredeschizând cutia Petri (doar atât cât este necesar pentru introducerea pipetei) se lasă o picătură pe suprafaţa mediului, în apropierea marginii cutiei;

pipeta, cu restul de material se introduce în vasul cu lichid sterilizant; picătura cu materialul de însămânţat se împrăştie cu ajutorul ansei, executând fie

linii în zig-zag, fie linii perpendiculare una pe alta; întinderea picăturii se mai poate realiza, pe toată suprafeţa mediului, cu ajutorul

unei pipete Pasteur îndoită la flacără (spatulă Drigalski), sau a unei baghete din sticlă cu forma literei „L”, prin rotirea cutiei pe masă, sau pe un dispozitiv special, sub forma unui platou circular rotativ.

Indiferent de modul în care a fost efectuată însămânţarea, cutiile Petri se pun la incubat cu capacul în jos, pentru ca apa de condensare să cadă în capac. În cazul în care cutiile sunt aşezate cu capacul în sus, apa de condensare de pe capac ajunge pe suprafaţa agarului antrenând microorganismele,coloniile se spală şi confluează, ne mai obţinându-se colonii izolate.

3

Microbiologie generală - Lucrări laborator Conferenţiar dr. Marian Jelea

4