Manual

Preparatul microscopic permanentPAGE 6(3) Prep. microscopic fix

Etapele realizarii preparatului microscopic permanentExista mai multe metode prin care putem obtine preparate pentru analiza celulelor/tesuturilor la microscopul optic si anume:

preparate microscopice fixe (permanente), preparate microscopice proaspete, frotiuri si amprente.Preparatul histologic permanent

Este folosit in clinica, laboratorul de anatomie patologica, medicina legala, cercetare si in scop didactic.

Obiectul de examinat trebuie sa fie subtire si transparent, el se monteaza intre lama port-obiect si lamela intr-un mediu de fixare transparent.

Pentru a seciona o pies anatomic (un organ sau un fragment din acesta), aceasta se include ntr-o substan care i d proprieti noi de omogenitate i elasticitate (parafina, celoidina).

Tehnica histologic cuprinde o serie de operaii; unele sunt obligatorii, altele facultative n funcie de materialul prelucrat i scopul urmrit. n cazul cel mai complex, succesiunea operaiilor cuprinde 5 etape majore: recoltarea, fixarea, secionarea, colorarea i montarea ntre lam i lamel, celelalte etape decurg din necesitatea realizrii acestora.

RECOLTAREA

Recoltarea este unul din actele cele mai delicate ale tehnicii datorit faptului c esuturile sunt fragile. Sunt importante folosirea de instrumente fine, locul recoltrii, orientarea, dimensiunile fragmentelor recoltate (acestea sunt n funcie de fixator). n general, grosimea pieselor de fixat variaz ntre 5-8 mm. Dac grosimea piesei este potrivit, celelalte dimensiuni nu au importan pentru fixare.

Recoltarea poate fi biopsica (de la subiectii vii) sau necropsica (de la cadavre). FIXAREA

Fixarea trebuie fcut ct mai repede dup recoltare. Fixarea oprete procesul de descompunere al esuturilor dup scoaterea din organism. In acest scop fixarea omoar celulele, pstrnd pe ct posibil structura lor din timpul vieii. In acest scop se utilizeaz fie soluii fixatoare simple (de cele mai multe ori), fie amestecuri (mai rar). Exemple de soluii fixatoare: formolul (30-40% formaldehid n ap) (nu se folosete pentru citologie), picroformolul acetic (amestecul Bouin), lichidul Zenker (bun fixator universal). Cu ct fixatorul este mai bun cu att este nevoie de timp mai puin pentru fixare.

Oprirea fixrii: se face splarea piesei fixate ntr-un curent de ap sau alcool n exces, dup caz. Piesa poate fi introdus ntr-un scuor de tifon sau se pot folosi vase speciale pentru splat piese.

Deshidratatrea. Necesitatea operaiei de deshidratare deriv din neamestecarea apei cu parafina, apa trebuie scoas din esuturi i apoi esuturile trebuie mbibate cu alt lichid. Dac n acest caz se folosete alcoolul (la rndul lui nemiscibil cu parafina) i acesta va trebui scos din piesa i nlocuit cu al treilea lichid, miscibil cu parafina. Pentru deshidratare s-au recomandat o serie de reactivi ca: alcoolul etilic, acetona, piridina etc.

ndepartarea alcoolului (clarificarea): se fac trei bi n benzen, toluen sau xilen. Benzenul este de preferat ntruct ntrete cel mai puin piesele.

Includerea n parafin este metoda cea mai folosit n lucrul curent, cu excepia sistemului nervos i a ctorva cazuri speciale. Aceast etap const n impregnarea i montarea piesei n parafin. n histologie se folosete o parafin cu punct de topire de 50-54(C.

Turnarea blocurilor: dup includerea n parafin piesele trebuie montate n blocuri de parafin pentru a putea fi ulterior secionate. Pentru formarea acestor blocuri se folosesc tvie metalice i bare metalice speciale numite bare Leuckardt sau simple forme de hrtie. Barele Leuckardt se folosesc n mod curent ntruct cu ele se poate varia mrimea blocului n funcie de mrimea piesei de inclus. Piesa mbibat cu parafin se ia cu o pens din termostat i se pune pe o bucat de faian ntre barele Leuckardt i se toarn parafin. Piesa trebuie s aib faa care ne intereseaz ndreptat n jos. Dup rcire la temperatura camerei se scutur barele cu blocul de parafin i acesta se va desprinde (va avea forma unui paralelipiped cu una din fee scobit).

SECIONAREAPentru secionare se folosete microtomul de parafin (modelul cel mai folosit este Minot).

Lipirea blocului de port-obiect: piesa se fixeaz la microtom n urmtorul fel: port-obiectul se ncalzete la aproximativ 50(C, se apas blocul pentru ca s se prind, apoi se las s se rceasc. Blocul se fixeaz de port-obiect cu faa opus celei unde se gsete piesa.

Sectionarea blocurilor: mecanismul roat-biel-suport al microtomului se pune n micare i suportul (port-obiectul) nainteaz la fiecare micare vertical cu ci microni vrem (se poate ajusta pasul la valoarea dorit folosind micrometrul aparatului). n mod curent grosimea seciunilor se fixeaz la aproximativ 5(m.Lipirea pe lam a seciunilor

Albumina Mayer: se ia cu degetul o pictur mic de albumin Mayer (albumin ou + glicerin + formol, 1:3:1) i se ntinde pe lam n strat foarte subire. Se las cteva minute pentru uscare.

ntinderea panglicii pe ap cald. Se ia panglica cu dou pense i se pune pe suprafaa apei ntr-un cristalizor (cu faa dinspre cuit pe ap); panglica se depliseaz, se ntinde. Cu ajutorul a dou ace se ntinde fiecare cut i se desface panglica n pri mai mici. Dup ntindere se introduce lama n apa, se pune sub o seciune i se ridic, alternativ, seciunile pot fi trase pe lam cu vrful unui ac.

Uscare pe stativ (n aer liber sau ntr-un termostat).

Deparafinarea: seciunile pieselor ntinse pe lam nu pot fi colorate n aceast stare, lichidele n care sunt dizolvai coloranii neptrunzndu-le. De aceea pentru colorare parafina trebuie scoas din esut, deci vom deparafina i apoi hidrata seciunile (pentru c majoritatea coloranilor sunt solubili n ap).

Hidratarea: se realizeaz ndeprtarea solventului organic folosind alcool, apoi se face o hidratarea ntr-o baie de ap.

La trecerea prin diferite vase lamele vor fi uor agitate prin ridicri uoare i cufundate din nou n vas; la trecerea dintr-un pahar n altul, lamele vor fi scurse i terse uor de lichid.

COLORAREAColorarea se realizeaz ntruct imaginile din preparatele colorate produse prin absorbie sunt mult mai uor de interpretat dect imaginile de difracie date de preparatele necolorate. Metoda de colorare depinde de natura fixatorului si de tesuturile pe care se aplica.

Coloranii sunt de obicei soluii apoase de colorant, cei mai utilizai sunt hematoxilina si eozina.

Deshidratarea este necesar deoarece esuturile mbibate n ap apar opace.

ndeprtarea alcoolului (clarificarea): lamele se in n xilen, toluen sau xilen pn ce seciunile devin transparente (de unde i numele operaiei). Aceti solveni scot i ultimele urme de ap din seciuni.

MONTAREA NTRE LAM I LAMEL Peste seciunea ntins pe lam se pun 1-2 picturi de balsam de Canada, apoi se adaug deasupra lamela, soluia de balsam trebuie s se ntind uor i astfel piesa nu se desface. Dup aplicarea lamelei se apas n centrul acesteia cu vrful unei pense, cu o presiune foarte mic, spre a nu rupe seciunea, care este n general foarte fragil. n urma acestei operaii rezult preparate durabile (fixe sau permanente).

port-obiect metalic, mobil

mecanism roat-biel-suport

micrometru ( ((m)

bare Leuckardt

tav

termostat

56(

pies ( 1 cm

8 ore

(3 bi)

I

II

III

piesa ( 1 cm

8 ore

benzen/ toluen/ xilen

(3 bi)

98(

70(

8-12 ore

alcool etilic - concentraie cresctoare

(3 bi)

ap sau alcool

min.

24 ore

recipient suficient de mare nct s poat cuprinde piesa i de 20-40 de ori volumul su de lichid

Microtomul de parafin

Cristalizor coninnd piesa n lichidul fixator

cuit

panglic plisat de seciuni

cristalizor vopsit n negru n interior pentru ca seciunile s fie mai uor vizibile; se ine ntr-o baie de ap

ap

30-35(C

lama

parafin

lama

(trecere)

benzen/ toluen/ xilen

(solveni ai parafinei)

1 min.

III

II

I

(trecere)

alcool 96(

concentraie descresctoare

2 min.

III

II

I

hidratare

ore

ap de robinet

(splare)

10 min.

hematoxilin

min. ( 1 or

ap de robinet

(splare)

2-3 min.

eozin

min. ( 1 or

(trecere)

alcool etilic

(concentraie cresctoare)

min.

alcool absolut

96(

(baie)

benzen/ toluen/ xilen

lama

se aplic lamela n

unghi de 45( si se apas

picatur de balsam de Canada

preparat microscopic

lam + lamel (balsam de Canada)