Microscopie optica

PAGE - 2 -(2) Notiuni teoretice de fluorescenta

Noiuni teoretice de fluorescen

Fluorescenta este un fenomen specific pentru anumite tipuri de molecule biologice/nebiologice in care se observa ca dupa ce primesc energie luminoasa au capacitatea de a reflecta aceasta energie luminoasa.

Fluorescenta si fosforescenta sunt doua fenomene fizice ale procesului de luminiscenta, prin care o serie de molecule sunt capabile sa emite radiatii luminoase.

Fluorescenta se caracterizeaza prin emisie de radiatie luminoasa intre doua stari energetice ce au acelasi numar de electroni nepereche. Fosforescenta reprezinta emisia de radiatie luminoasa a moleculelor excitate conditionata de trecerea lor din starea de triplet in starea de singlet (trecere intre doua stari energetice la care numarul de electroni se modifica).

Radiatia luminoasa emisa de diferite substante are diferite valori ceea ce determina diferite culori ale fluorescentei. Timpul de injumatatire este cuprins intre 10-3 secunde si cateva minute, in emisia de fosforescenta; fluorescenta prezinta un timp de injumatatire relativ scurt: 10-9-10-4 secunde. Dupa intreruperea sursei de iluminare, intensitatea fluorescentei moleculelor incepe sa scada.

Relatia dintre fluorescenta si structura chimica

O serie de structuri chimice au capacitate mare de a emite fluorescenta. Solventul are o influenta mare asupra fluorescentei. Este importanta si concentratia ionilor de hidrogen (pH-ul). Fluorescenta naturalaO serie de substante iluminate in UV emit in mod natural la o lungime de unda mai mare, adica in vizibil. Din aceasta clasa de substante deosebim: vitamina A cu o fluorescenta verde; vitamina B2 cu o fluorescenta albastruie; porfirinele cu o fluorescenta rosie etc.Fluorescenta indusa (secundara)

Alte substante biologice capata o fluorescenta secundara prin cuplare cu coloranti (fluorocromi) capabili de a emite lumina fluorescenta, sau prin tratament chimic adecvat ce faciliteaza formarea unor grupari fluorocrome.

Astfel, tratamentul cu acid sulfuric concentrat determina o fluorescenta a testosteronului, coriofosfina O provoaca fluorescenta ADN-ului (in verde) si ARN-ului citoplasmatic (in rosu).

Alte exemple:

derivatii de cofeina care sunt specifici pentru lipide;

rhodamina B specifica pentru unele proteine;

acridinoranjul pentru acizii nucleici: ADN (fluorescenta verde) si ARN (fluorescenta rosie).

Exemple de fluorocromi:

izotiocianat de fluoresceina;

acidul dietil naftalen-sulfonic;

rhodamina B;

calcofluor.

Microscopul de fluorescenta (MF)

Microscopul de fluorescenta foloseste surse de lumina in UV reprezentate de lampi cu vapori de mercur (Hg) sau de cadmiu (Cd).

Alcatuirea microscopului de fluorescenta:

- lampa cu vapori de Hg/Cd;

- dispozitiv metalic cu sistem de ventilatie, sistem de reflectare a razelor, sistem de focalizare reglabil si un suport cu lacasuri pentru filtre;

- dispozitiv aprinzator realizeaza alimentarea lampii (trimite in lampa cateva secunde un curent de inalta tensiune ce vaporizeaza Hg din tub).

http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/5/55/Fluorescence_microscop.jpgPentru studii de microscopie in fluorescenta se pot utiliza microscoape obisnuite la care se schimba dispozitivul condensator (condensator cu lentile de cuart). La acestea se folosesc surse mobile de UV care au lampi cu vapori de Hg.

In cazul folosirii condensatorului pentru fond intunecat, pentru imersia dintre condensator si lama se folosesc ulei de imersie sintetic sau glicerina pura ne-fluorescenta.

Pentru studii de microscopie in fluorescenta preparatele biologice se monteaza pe lame subtiri de sticla ne-fluorescenta sau pe lame de cuart.

Pentru microscopia in fluorescenta se folosesc doua categorii de filtre (acestea au rolul de a dirija fasciculul luminos):

filtre de excitatie - retin o parte din radiatiile emise de sursa, lasand sa treaca radiatiile cu lungimea de unda care excita fluorocromul (lumina pentru fluorocrom),

filtre de baraj opresc lumina primara ce vine de la sursa, lasand sa treaca lumina emisa de fluorocrom.

Fasciculul este dirijat prin filtre de excitatie care selecteaza radiatiile, apoi urmeaza un filtru de baraj.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26880/figure/A1738/?report=objectonlyAplicatiile fluorescentei in biologia celulara

Aceasta tehnica se bazeaza pe specificitatea foarte mare a acestor metode, de asemenea sensibilitatea metodelor este foarte mare permitand identificarea unor molecule prezente in cantitati foarte mici.

Aplicatiile fluorescentei in biologia celulara - exemple: evidentierea acizilor nucleici, a citoscheletului etc. Aplicatia cea mai frecventa si mai importanta este legata de testele de imunofluorescenta, in care substantele fluorescente servesc ca trasor pentru moleculele de imunoglobulina-anticorp.

IMUNOFLUORESCENA

Imunofluorescenta reprezinta ansamblul de metode care permit localizarea oricarui tip de molecule in celula (antigeni - Ag) prin utilizarea anticorpilor (Ac) marcati fluorescent.

Imunofluorescenta directa: Ag + Ac specific marcat fluorescentI. Se realizeaza sinteza de anticorpi avand specificitatea dorita (exemplu: anticorpi anti-tubulina)

II. Molecule organice capabile de fluorescenta se leaga covalent de anticorpi ( anticorpi fluorescenti.

III. Anticorpii marcati sunt adaugati antigenului corespunzator si se obtine o reactie specifica antigen-anticorp, insotita de colorarea si evidentierea complexului.

Imunofluorescenta indirecta: Ag + Ac specific + Ac secundar marcat fluorescentNu foloseste anticorpi marcati, ci recurge la un ser anti-anticorpi:

I. Marcarea serului antiglobulinic (a anti-anticorpilor) cu fluorocrom, astfel acesta devine o suspensie fluorescenta utilizabila pentru evidentierea oricarui sistem antigen-anticorp;

II. Punerea in contact a anticorpilor cu antigenul omolog si obtinerea unui complex antigen-anticorp;

III. Adaugarea serului antiglobulinic marcat (a anti-anticorpilor) la complexul antigen-anticorp, urmata de colorarea specifica si evidentierea acestuia.

Metoda indirecta are marele avantaj de a fi rapida, deoarece nu necesita prepararea de antiseruri specifice marcate: un singur tip sau cel mult doua tipuri de seruri antiglobulinice marcate sunt suficiente pentru a studia numeroase sisteme antigen-anticorp diferite.

(desen pe plansa: Imunofluorescenta directa si indirecta pentru exemplul de mai sus)Imagini pe Internet:- Citoscheletul si nucleul in celula endoteliala arteriala bovina. Filamentele de actina sunt colorate in rosu, microtubulii cu verde, nucleii cu albastru.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:FluorescentCells.jpg- Una din primele linii celulare umane, celulele HeLa, aici cu coloratie pentru nuclei (albastru) http://www.bing.com/images/search?q=HeLa+cell&view=detail&id=04410833AADF2D7325C2AC5769896744A1C74521&first=151&FORM=IDFRIR- Citoscheletul de actina (in verde) din fibroblasti de embrioni murini, colorati cu faloidin marcata fluorescent http://www.bing.com/images/search?q=actin+cytoscheleton&view=detail&id=BC3AFF47B78C18199B3D1DC58633892A5F20793C&first=31&FORM=IDFRIR HeLa celule canceroase, numite dupa numele donatoarei HYPERLINK "http://en.wikipedia.org/wiki/Henrietta_Lacks" \o "Henrietta Lacks" \t "_blank" Henrietta Lacks, care a murit de cancer

Faloidina este o toxina extrasa dintr-o ciuperca extrem de otravitoare (Amanita phalloides) care impiedica depolimerizarea filamentelor de actina. Marcarea fluorescenta a faloidinei s-a dovedit foarte utila pentru studiul microscopic al actinei.