04 Microscopia electronică site - histology.ro · MICROSCOPUL ELECTRONIC Folosește un fascicul de...
Transcript of 04 Microscopia electronică site - histology.ro · MICROSCOPUL ELECTRONIC Folosește un fascicul de...
MICROSCOPIAELECTRONICĂ
• Înțelegereaprincipiuluidefuncționareamicroscopuluielectronicşicumneajutăînstudiulcelulei
• Recunoaştereauneiimaginiobţinuteprinmicroscopieelectronică
• Întelegereaprincipalelordiferenţefaţădemicroscopuloptic
• Descriereatipurilordemicroscoapeelectronice,precumşiaaltortipuridetehnici,înruditecumicroscopia,carepermitobţinereadedetaliipânălanivelatomic
OBIECTIVELELUCRĂRIIPRACTICE
0,1mm
0,2μm
OCHIULUMAN
MO
ME
0,002nm
REZOLU
ȚIE
2 µm
10 µm
10 nm https://www.fei.com/image-gallery/80S-Ribosome/
https://www.diag2tec.com/plasmos/
Ochiulumandetecteazălungimideundă între~ 400-800nm.
Microscopulopticpoatedetectaolungimedeundade200nm.
Microscopulelectronicpoateajungelaorezolutiede2pm
MICROSCOPULELECTRONIC
Foloseșteunfasciculdeelectroniînloculunuifasciculdelumină.StudiulcelulelorcuajutorulMEapermis,înanii1950-1970,identificareaorganizăriicelulelorșiaorganitelorcelulare
Poateficaracterizatfolosindu-seaceiașiparametricașipentruMO:• Putereademărire→aproximativ1.000.000x• Rezoluție∼ 0,002nm(variabilădependentădetensiuneade
accelerareaelectronilor,devitezăacestora)
MICROSCOPULELECTRONIC- PRINCIPIUDEFUNCŢIONARE
• FormareaimaginiiînMEdepindedeinteracțiuneaelectronilordinfluxcunucleeleșielectroniiatomilordinpreparat(probă)
• Celuleleșițesuturilenuaucontrast,motivpentrucaresefolosescpentrupregătireaprobeisăruridemetalegrele,careseleagăselectivdediversemolecule(fosfolipide,proteine,etc)pentruacreștecontrastulînpreparat
• Cuajutorulmicroscopuluielectronicputemexaminastructuricelularedemicidimensiuni,denumiteultrastructuri (complexemacromoleculareșiorganite)
Interacțiuneaelectronilorcuprobainfluențeazăcomportamentulelectronilor
TRANSMISIE REFLEXIEREFRACȚIE
DIFRACȚIE ABSORBȚIE ÎMPRĂȘTIERE
• Microscop electronicdetransmisie – detectează electroniitransmiși prin probă• Furnizează detalii derezoluție înaltă (∼ 0,2nm)
• Microscop electronicdebaleiaj (scanning)– detectează electronireflectați deprobă• Furnizează detalii alesuprafeței probei analizate (∼ 50nm)
TIPURIDEMICROSCOAPEELECTRONICE
PRINCIPIULDEFUNCȚIONAREALME
MEconstădintr-uncilindruvidatîncaresuntaccelerațielectroniiextrașidintr-unfilament (deregulădetungsten) prinaplicareauneitensiunideacceleraredeordinulsutelordemiidevolți.Oseriedelentileopto-electronicefocalizeazăfascicululdeelectronicaretreceprinprobășiestevizualizatpeunecranfluorescentsauestecaptatdeundetectorelectronic.
MICROSCOPULELECTRONICDETRANSMISIE
FoloseșteunfasciculdeelectroniînloculunuifasciculdeluminăPentrufocalizareaelectronilorîntr-unfasciculcoerentsefolosesc lentileelectromagneticeamplasateîntr-oincintă vidată
PutereademărireșirezoluțiasuntdependentedevitezadeaccelerareaelectronilorînincintavidatăaME.
LENTILĂ CONDENSOR
FILAMENT –sursă de electroni
LENTILĂ OBIECTIV
LENTILĂ PROIECTOR
Ecran fosforescent/Detector electronic
Secțiuni prin celulepe o grilă (ø 3mm)
Fascicululdeelectroni,controlatdelentileelectromagnetice,treceprintr-ofeliefoartesubţiredeţesut• electroniicaretrec(„transmiși”)suntproiectați
peunecranfluorescent(sauînregistrațidecameredigitalespeciale),generândpuncteluminoase
• ultrastructurilecelularecareau„respins”electroniidatoritănucleelordemetalegrelelegați,vorcreaumbrepeecranulcaptator
MICROSCOPULELECTRONICDETRANSMISIE
ETAPELEOBŢINERIIPREPARATULUIPENTRUMEDETRANSMISIECLASICĂ
MO MERecoltare(biopsie,necropsie) Recoltare(doarbiopsie)
Fixare(fizică,chimică) Fixare(fizică/chimică)
Includere(parafină) Includere (răşini epoxidice)
Secționare(microtom) Secționare(ultramicrotom)
Montare(lamă,lamelă) Montare(grilădecupru)
Colorare(coloranți) Contrastare(săruridemetalegrele)
RECOLTAREA
• Biopsie – prelevare dețesut viu
•Culturi celulare
FIXARE
• esteobligatoriepentruME(nusepotexaminacelulevii)• trebuiefăcutăînainte(înculturacelulară)sauimediatdupărecoltareațesutuluiprinbiopsie
• trebuiefăcutăfoarterapiddupărecoltare- oricedegradarelanivelmolecular/celularvafiredatădemicroscop
FIXAREA
• FIZICĂ – prin înghețare rapidă - vitrificare (azot lichid, la - 190°C)• CHIMICĂ
• Glutaraldehidă (timp de fixare rapid – 5 secunde, putere depenetrare scăzută în țesut – 0,5mm)
• Tetraoxid de osmiu (OsO4) – numită postfixare, permiteconservarea fosfolipidelor (vizualizarea membranelor)
• aldehidele și agenții oxidanți (OsO4) acționează prinformarea de legături covalente cu grupările funcționale alemacromoleculor din celule/țesuturi
INCLUDEREA
• Includerea încorporează piesa de țesut într-o materie solidă,potrivită pentru a obține secțiuni cât mai subțiri (50-100 nm),care pot fi examinate la microscop (electronii o pot străbate)
• Este precedată de deshidratare pentru a înlocui apa și a permitematerialului de includere, o rășină hidrofobă epoxidică, săpătrundă în probă
Țesut
SECȚIONAREA
• Secționarea serealizează cuunaparat special(ultramicrotom)pentru aobține secțiuni subțiri de0,04– 0,1µm
Piesadețesutesteinclusăînepon Secționareasefacelaultramicrotom Pieseleserecolteazăpeapașiapoisemonteazăpeogrilă
SECȚIONAREA- CONTRASTARE
grilă
CONTRASTAREA(ME)
• EsteechivalentăcolorăriipentruMO;estenecesarăpentruaputeadiscriminadiferitecomponentealepreparatului
• Sefacecusăruridemetalegrele(citratdeplumb,acetatdeuranil,etc),alecărornucleeseleagădeanumitecomponentedinpreparat,blocândtrecereaelectronilor
• Depunereametalelorgrelenuestespecificădarestereproductibilăastfelîncâtcreștereacontrastuluiserealizeazăconsecventpeanumitestructuri
• secțiunenecontrastată
CONTRASTAREA(ME)
• secțiunecontrastată
IMAGINILEDEMICROSCOPIEELECTRONICĂAPARÎNALB,NEGRUŞITONURI DEGRI
• moleculele careleagă mulținucleigrei (deosmiu,uraniu,plumb,fier ș.a.)vor producedispersia e- – zoneelectronodense (întunecate)
• moleculele carenuleagănucleigrei vor permitetrecerea e- – zoneelectronoclare
INTERPRETAREAIMAGINILOR
INTERPRETAREAIMAGINILOR
Cromatinăcondensată
Nucleu
ImaginedeMETaunorcelule(încercuitecuroșu,laputeredemărirescăzută(veziscarademărire)
Cromatinăcondensată
Detaliualimaginiiprecedente(veziscarademărire).Insertulroșuestemărit înimagineaurmătoare
Detaliualuneizonedecitoplasmădinimagineaprecedentă.Încentruseobservăuncentriol
Centriol
PUTEREMAREDEMĂRIRE
ME– PUTEREMAREDEMĂRIRE
Nano Lett., 2012, 12 (12), pp 6453–6458
molecula de ADN
Pasde2,4nmalspiraleideADN- A
CONTRASTARENEGATIVĂ
• Contrastareanegativăsefolsoseșteinspecialpentrustucturiproteice(peretecelular,filamente,complexemacromoleculare)pestecareseadaugăunvolumfoartemicdesoluțiedecontrastarecareseusucă.Electroniivortreceprinstructurileproteicecarenuleagăsoluțiadecontrastaresivorfireflectațiacoloundeeaseacumuleaza-lamargineapreparatului
Contrastare pozitivă Contrastare negativă
CONTRASTARENEGATIVĂ
100 nm
E. coli negatively stained with 1% Uranyl acetateCourtesy of Alexander MironovTaken by Tecnai microscopehttps://www.fei.com/image-gallery/
• Escherichia coli -imagine MET obținutăprin contrastarenegativă
CONTRASTARENEGATIVĂ
100 nm
Alberts B at al. Molecular biology of the cell / 6th ed. 2015
• Imagine MET obținutăprin contrastarenegativă a filamentelor de actină
CONTRASTARENEGATIVĂ
• Ce tehnică demicroscopieelectronică afost folosită pentruaobține această imagine?
CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE
Probelebiologiceaflateînsoluțiesuntpusedirectpeogrilășiscufundateînazotsauetanlichid.Seformeazăastfelopeliculăde apăvitrificată(fărăcristale)careconțineproba.AcestegrilesuntvizualizateînMET cudispozitivespecialedemenținereconstantăatemperaturiila-190⁰C.
Contrastulînacesteprobeestescăzutfiindgeneratdoardeatomiicomponențiaiprobelorbiologice.Imaginilesuntachiziționateautomatșiprelucrateșianalizate cuajutorulunorsofturispeciale.
Aceastătehnicăa primitpremiulNobelptChimiein2017
CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE
https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2017/press-release/
• Probele biologice suntvitrificate directpe grilăși vizualizate în condițiidetemperatură scăzută(-190°C)în MET
CRIO-ELECTRONO-MICROSCOPIE/TOMOGRAFIE
ER - galbencis C - verdecis V - verde deschismedial C - magentamedial V - roztrans C - albastru trans V - albastru deschisTGN - violetAlte membrane și ribozomi - gri
eLife 2017;6:e32493 DOI: 10.7554/eLife.32493
MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ
• Oferăimaginitridimensionalealesuprafețelorcelulelor,țesuturilor,organisme
• Acelașiprincipiualinteracțiuniiunuifasciculdeelectronicuoprobăcaretrebuieacoperităcuunstratsubțiremetalic(pentrustabilitateșicontrast)
• Imagineaesteformatădeelectroniireflectațidepesuprafațapreparatuluișicolectațideundetector
REFLECTAȚI (SEM)
MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ
Fire de păr
stereocili
Cili și mivrovilihttps://microscopy.stanford.edu/
Alberts B at al. Molecular biology of the cell. 6th ed. 2015
http://www2.optics.rochester.edu/
MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJ
https://www.fei.com/image-gallery/
CourtesyofDr.MarkMcClendon,NorthwesternUniversityTakenbyQuantaSEMmicroscopeMagnification:8,000XSample:EmbryonicNerveCellDetector:SEVoltage:3kVVacuum:2e-3PaHorizontalFieldWidth:20umWorkingDistance:6Spot:3
• Celule nervoase crescuteîn cultură
https://www. fei.com
MICROSCOPIAELECTRONICĂDEBALEIAJorganismmicroscopicdinapetermale acarian colorat digital
ÎNGHEŢARE- FRACTURARE
• Permite vizualizarea suprafețelor rezultate prin clivajulanumitor structuri (ex:clivajul membranei celulare)• Seîngheață celulele• Seintroduc într-ocameră vidată și selovesc cuuncuțit• Celulele sefracturează inzonele hidrofobe (unde gheațanus-aformat)
• Serealizează unmulaj metalic (Au,C)alsuprafeței expuse înurma clivajului – serealizează oreplică asuprafeței
• Seexaminează această replică metalică laMET
ÎNGHEŢARE- FRACTURARE
Startul extracelular
Startul citoplasmaticMembrana plasmatică
Cuțitproteine Fața internă a stratului extracelular (fața E)
Fața externă a stratului citoplasmatic (fața P)
http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/proceuc/c8.7x4.freeze.fracture.jpg
TEHNICĂ REZULTAT
PRINCIPIIC
ONSTRU
CTIVE
COLORAREVS.CONTRASTARE
• Cusubstanţe chimice,deobicei acizisau baze
- Coloranţii acizi seleagă desubstratacidofil (sarcini +)- Ex.EOZINĂ – uncolorantroz,decisubstratul bazic careîl leagă vaapărea colorat în roz
- Coloranţii bazici seleagă desubstratbazofil (sarcini -)- Ex.HEMALAUN – uncolorantviolet,deci substratul acidcareîl leagă va ficolorat violet
• Componentelecelularecareleagăsăruridemetalegrelevorblocatrecereaelectronilor,apărândîntunecate peimagini
• Restulcomponentelorvorfimaimultsaumaipuţinpermeabilepentrufluxuldeelectroni,carevortraversapreparatulşivorajungelaecranuldecaptură,producândunzonemailuminoase
ColorareaMO ContrastareaME
CARESUNTNIVELURILEDEDETALIEREALEUNEICELULE?
(MICROŞINANO)
• MOoferădetaliidespreformageneralăacelulelor,nucleuşicâtevadetaliidespreorganite(folosindmetodespecifice).
• MEoferădetaliidespreorganite,membranacelularăsaumoleculelecomponente(pânălanivelatomic)
• Putem“vedea”structurachimicaauneimolecule?- cristalografiacurazeX- spectroscopiaderezonanțămagneticănucleară- microscopuldeforțăatomică(MFA)- măsoarăinteracțiuneadintreunsenzorșiatomiidinpreparat
Metode de vizualizare a (macro)moleculelorTehnică Rezultat InterpretareCristalografiacurazeX(radiațieelectromagneticăculungimedeundă0,01-10nm)
-model de difracție
https://www.jic.ac.uk/staff/david-lawson/xtallog/summary.htm
un model de structură terțiară/cuaternară
modelare bioinformatică
Spectroscopiaderezonanțămagneticănucleară (radiațieelectromagneticăîndomeniulundelorradio)
spectru de rezonanță al atomilor de C, H sau al grupelor funcționale
https://www.exova.com/sectors/pharmaceuticals/material-sciences-testing/nmr-spectroscopy/
Microscopiadeforțăatomică
-”harta”interacțiunilordintreatomiimoleculeloruneisuprafețeșiunscanner
www.creative-biolabs.com/drug-discovery/therapeutics/atomic-force-microscopy.htm
Microscopie opticaSecțiune de 1µm
Microscopie electronicaSecțiune de 100 nm
MO ME40x
www.intechopen.com
5000x
Ob. 20x 20.000x
http://www.drjastrow.de/EMAtlasE.html
MO ME
REZUMAT• PregătireapreparatuluipentruMOşiME(detransmisie)treceprinetapeasemănătoare
• CuajutorulMOputemvizualizastructura componentelordinpreparat- organizareaţesuturilorînfragmentuldeorgan,componentetisulare(cepermitidentificareatipuluideţesut),tipuricelulare
• CuajutorulMEputemvizualizaultrastructura componentelordinpreparat- detaliilanivelcelular:organitecelulare,organizareamembranelor
• Existămetodecarenepermitidentificareaatomilorșiaranjamentullorînstructuriterțiare/complexemacromoleculare
CARACTERISTICĂ MICROSCOPULOPTIC
MICROSCOPULELECTRONIC
Spectrulelectromagnetic
FOTONI ELECTRONI
spectrulvizibil760nm÷ 390nm
electroni~0,004nm
Lentile(sistemedemodulareaundelor)
sticlă electromagnetice
Putereaderezoluție 0,2µm (200nm) 0,002nm (2pm)
Putereademăriremaximă x2.000 x10.000.000
Imagineaesteprodusădeosursăderadiații
sursădeluminăalbă/UV/LASER sursădeelectroni
Mediuldeexaminare aer vid
Proiecțiaimaginii directăochiuluman/filmfotografic/camerevideodeînaltărezoluție
indirectăecranfluorescent/film/camerevideodeînaltă
rezoluție
Imaginicolorate decelemaimulteori nu
Anexa 1
CARACTERISTICĂ MICROSCOPUL OPTIC MICROSCOPUL ELECTRONIC
Preparatulexaminat
celule fixate sau vii doar celule fixate
Fixarea diverse substanțe(uzual formaldehidă)
*
crio-fixare
GlutaraldehidăOsO4
*
crio-fixare
Includere (consitență)
parafină / înghețare rășini (plastic) / vitrificare
Grosimea secțiunii ~ 5 µm ~ 50 nm
Obținerea contrastului
coloranți / fluorocromi metale grele
Suport pentru preparat
lama de sticlă grilă de cupru