virusurile fcute de crenguta

CARACTERE GENERALE ALE VIRUSURILOR

Definiie

Se estimeaz c exist peste 400 de virusuri distincte care infecteaz omul, iar spectrul manifestrilor clinice, epidemiologice i patogenice care rezult n urma infeciilor virale este foarte vast.

Virusurile sunt unice n cadrul agenilor infecioi. Caracteristicile majore care le difereniaz de celelalte microorganisme sunt:

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hdimensiunea redus (20-300 nm) care le permite s traverseze filtrele bacteriologice pstrndu-i infeciozitatea

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hgenomul viral posed un singur tip de acid nucleic, fie ADN (dezoxiribovirusuri), fie ARN (ribovirusuri)

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hsunt total dependente de celula vie, fie eucariot, fie procariot, pentru replicare i existen

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hnu posed ribozomi sau aparat propriu de sintez a proteinelor, mitocondrii sau surs proprie de energie, deci sunt metabolic inerte n afara celulei gazd

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hdei unele virusuri posed enzime propri ca, de pild, ARN sau ADN polimeraza, ele nu pot amplifica i reproduce informaia n propriul genom n absena celulei gazd.

Virionul (corpusculul elementar sau viral) reprezint unitatea viral infecioas intact, inert n afara celulei gazd.

Virusurile pot parazita celule umane, vegetale, bacteriene, fungice, parazitare i ale insectelor.

Morfologie

Dimensiune

Unitatea de masur a dimensiunii virale o reprezinta nanometrul (1nm=10-9 m).

Virusurile cu importan clinic au dimensiuni cuprinse ntre 20-30 nm (picornavirusuri) pn la 300 nm (poxvirusuri). Ele sunt vizibile numai prin microscopie electronic. n contrast, bacteriile au aproximativ 1000 nm iar eritrocitele 7500 nm n diametru.

Metodele de msurare a dimensiunii virionilor sunt:

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hultrafiltrarea care este o filtrare prin membrane de colodiu cu pori de mrime cunoscut,

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hobservarea la ME n comparaie cu particule de referin, de dimensiuni standard (particule de latex),

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hultracentrifugarea datorit corelaiei ntre rata de sedimentare i dimensiunea virionilor.

Forma

Prin examinare la ME, virionii prezint o diversitate de forme: sferic (v.gripale, v.paragripele, adenovirusurile), paralelipipedic (poxvirusurile), de cartu (v.rabic), de bastona (v.mozaicului tutunului, fagii filamentoi), de spermatozoid (bacteriofagii) etc.

Structura

Cunoaterea structurii virusurilor reprezint o etap important n identificarea acestora.

Structura de baz, obligatorie, a virionului o reprezint nucleocapsida constituit dintr-un miez (core) de acid nucleic = genomul viral, protejat (nconjurat) de un nveli proteic numit capsid.

Virusurile formate numai din nucleocapsid se numesc virusuri nenvelite sau neanvelopate (nude).

Virusurile care prezint pe lng nucleocapsid i un nveli extern lipoproteic, derivat din membrana citoplasmatic a celulei gazda, peplos sau anvelopa se numesc virusuri nvelite (anvelopate).

a) Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de acid nucleic, fie ADN fie ARN (niciodata ambii acizi nucleici !) care conine ntreaga informaie genetic necesar replicrii virusului i care reprezint suportul infeciozitii virusului.

Molecula acidului nucleic (indiferent dac este ADN sau ARN) poate fi simplu spiralat (ss) sau dublu spiralat (ds), liniar sau circular, continu sau segmentat.

Acidul nucleic al tuturor virusurilor ADN, cu excepia parvovirusurilor, este ds (hepadnavirusurile au ADN parial ds cnd nu sunt in timpul replicrii).

Acidul nucleic al tuturor virusurilor ARN, cu excepia reovirusurilor, este ss.

n cazul virusurilor ARNss, genomul conine acid nucleic care poate fi cu polaritate pozitiva (+), caz n care poate aciona direct ca ARNm (mesager) n interiorul celulei infectate, sau poate fi cu polaritate (-), caz n care trebuie transcris de o enzima asociat virusului, ARN-transcriptaza, ntr-un ARN cu polaritate (+) = imaginea in oglinda.

Mrimea genomului viral se coreleaz cu mrimea capsidei sau anvelopei. Astfel

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hvirusurile mari au un genom de dimensiuni mari care conine cteva sute de gene i codific un numr relativ mare de proteine (poxvirusurile, herpesvirusurile, etc)

SYMBOL 183 \f "Symbol" \s 10 \hvirusurile mici au un genom de dimensiuni reduse care conine doar 3 sau 4 gene i codific un numr mic de proteine.

b) Capsida viral este un nveli format din numeroase uniti proteice numite capsomere.

Aceste capsomere sunt, de obicei, proteine de dimensiuni mici care se autoasambleaza n structuri capsomerice mari iar in final se asambleaz sub forma capsidei virale.

Capsomerele individuale pot fi puse n eviden prin microscopie electronic. Fiecare capsomer trebuie s posede o anumit structur chimic ce i permite s se asambleze cu capsomere asemntoare pentru a forma o structur complex cum este capsida.

Cea mai simpla structura care poate fi construita n acast manier este simetric i include 2 tipuri de simetrie a capsidelor:

*helicoidala (helicala), cu aspect tubular

*icosaedrica, cu aspect sferic.

Tipurile nesimetrice de capside sunt reprezentate de:

*capside cu simetrie binar (icosaedric-helical)

*virusurile cu organizare complex

Funciile capsidei:

1. asigura forma caracteristic virionului

2. protejeaz acidul nucleic viral

3. la virusurile nenvelite, fixeaza virionul de receptorii specifici de pe celula gazd.

c) Peplosul sau anvelopa reprezint o membran cu structur similar membranei citoplasmatice a celulei gazd. Aceast membran conine lipide, proteine i lipoproteine.

Pe suprafaa acestei membrane se gsesc formaiuni specifice virale, codificate de virus:

1. spiculi (peplomere) de natur glicoproteic. Au funcia de adsorbie i penetrare n celula gazd.

Exemple:

*hemaglutinina (HA) = rol n ataarea virusurilor la celula gazd ; confer virusurilor proprietatea de a liza hematiile diverselor specii animale

*neuraminidaza (N) = faciliteaz parunderea virusurilor n celul

2. factori de fuziune. Se gasesc sub forma inactiv (FO) iar sub aciunea proteazelor celulei gazd se scindeaz genernd forme active (F1,F2). Au funcia de iniiere a infeciei.

3. proteina M (matrix) cptuete faa intern a anvelopei (frecvent la virusurile ARN cu polaritate negativ).

La unele virusuri, faciliteaz asamblarea, iar la altele, asigur meninerea formei (exemplu: rhabdovirusuri)

Funciile nveliului:

a) asigur ataarea virusurilor anvelopate (nvelite) la celula gazd

b) de protectie - Rolul protector al nveliului viral este anihilat de tratamentul cu solveni lipidici (eter, cloroform, sruri biliare), rezultnd inactivarea particulei virale. Permite clasificarea virusurilor in:

-eter-sensibile = virusurile nvelite

-eter-rezistente = virusurile nenvelite

Proteine funcionale-enzime

Numarul de gene care constituie genomul unor virusuri este redus, de aceea sinteza proteinelor enzime codificate de virus este limitat. Sinteza lor este important pentru replicarea genomului viral.

Exemple:

1. replicaze sau transcriptaze virale = ARN-polimeraze ARN-dependente prezente la virusurile ARN cu polaritate negativ (-).

2. reverstranscriptaza (ADN-polimeraza ADN-dependent) sau integraza, prezent la retrovirusuri .

1.4. Taxonomie. Clasificarea virusurilor

Taxonomia viral actual desparte ribovirusurile (genom ARN) de dezoxiribovirusuri (genom ADN). In aceste diviziuni, virusurile se grupeaz (de la simplu la complex) n tulpini, specii, genuri, subfamilii i familii, dup criteriul nrudirii n secvena nucleotidelor din genom.

Familia este desemnat cu sufixul VIRIDAE. Apartenena la o familie presupune o origine comun i caractere comune care nu se ntalnesc la alte grupuri de virusuri.

Subfamilia este denumita cu sufixul VIRINAE.

Genul este denumit cu sufixul VIRUS i este constituit din specii care au n comun caracterele familiei dar au i particulariti proprii care le diferentiaz de alte grupuri de virusuri ce aparin aceleiai familiii.

Specia se exprima fr sufix, denumirii de "virus" adugndu-se numele ntreg. Este definit ca fiind grupuri de tulpini virale care se deosebesc ntre ele prin prezena unor gene ce codific aceste deosebiri dar au asemnri genomice i antigenice.

Criterii taxonomice1. Proprietile virionului: dimensiuni, form, prezena peplosului

2. Proprietatile genomului: tipul de acid nucleic (ADN sau ARN), numrul de spire (simplu sau dublu spiralat = s.s / d.s), liniar sau circular (L / C), sensul de transcriere sau polaritatea (pozitiv, negativ sau ambele = ambisens), dimensiunea genomului.

3. Replicarea viral: strategia replicarii, transcripie, translaie, modificari posttranslaionale, asamblarea i eliberarea virionilor progeni.

4. Proprietaile proteinelor virale: numr, secvena de aminoacizi, greutate molecular, funcie (transcriptaze, reverstranscriptaze, hemaglutinine, neuraminidaze )

5. Proprietati fizico-chimice: stabilitate termic, rezistena la pH, radiaii, detergeni, solveni.

6. Proprietati biologice: spectrul gazdelor naturale ( bacterii, plante, animale vertebrate sau nevertebrate) i experimentale, tropism celular, transmisie prin vector, relaii serologice.

1.5. Replicarea (multiplicarea) viral

Virusurile prezint un nalt grad de parazitism intracelular i sunt inerte metabolic pn cnd infecteaza o celul susceptibil. n celula gazd, virusurile se replic redirecionnd mecanismele biochimice ale celulei spre formarea de componente pentru noi particule virale.

Genomul viral

Virusurile mari au, de obicei, acid nucleic cu greutate molecular crescut i care are capacitatea de a codifica un numr mare de proteine; de aceea, aceste virusuri codific un numr mare de enzime implicate n replicarea lor.

Virusurile mici au un acid nucleic cu greutate molecular scazut i un potenial de codificare limitat, de accea codific doar unele din proteinele lor structurale i utilizeaz cel puin cteva enzime ale celulei gazd, pentru propria replicare.

Replicarea virusurilor parcurge urmatoarele secvene:

1. recunoasterea celulei gazd

2. adsorbia (ataarea ) virusului de celula gazd

3. penetrarea (ptrunderea) virusului n celula gazd

4. decapsidarea virusului

5. sinteza macromolecular

a) biosinteza ARNm precoce i a proteinelor precoce = proteine-enzime

b) replicarea genomului viral

c) biosinteza ARNm tardiv i a proteinelor tardive = proteine structurale

6. eliberarea virionilor progeni din celula gazd

1.Recunoaterea celulei gazd

Pentru a infecta o celul, virusul trebuie, n primul rnd, s recunoasc celula care i permite replicarea. Acest proces este realizat datorit existenei unor situsuri receptor-specifice (de natur proteic) situate pe suprafaa extern a particulei virale. Aceste situsuri reacioneaz specific cu receptori corespunztori (de natur glicoproteic sau glicolipidic) de pe suprafaa celulelor "int". Astfel, prin aceast interaciune precis de tip "cheie-broasc" se explic faptul c anumite virusuri prezint tropism pentru anumite gazde i pentru anumite esuturi ale gazdei respective.

2.Ataarea virusului de celula gazd

Ataarea virusurilor este specific i implic legarea situsurilor receptor-specifice de receptorii specifici aflai pe membrana citoplasmatic a celulei gazd.

a) Structurile de ataare ale virusului pot fi:

*capsomerele capsidei, prezente la virusurile neanvelopate

*glicoproteinele, ce reprezint proiecii ale nveliului viral, la virusurile anvelopate.

b) Receptorii specifici de pe membrana citoplasmatic a celulei gazd sunt constitueni normali ai acesteia.

Exemple de proteine virale de ataare = tabel pag. 450 - Murray

Multiplele interaciuni dintre proteinele virale de ataare i receptorii celulei gazd, ataeaza ferm virusul de celula gazd. Aceste interaciuni pot reprezenta mecanismul tragaci (declanator) n urma cruia este eliberat nucleocapsida n celula gazd.

3. Penetrarea sau ptrunderea virusului n celula gazd (internalizarea)Dup ataarea la celula gazd, virusul trebuie s penetreze membrana celular extern i s elibereze genomul viral n mediul intracelular, pentru replicare. Penetrarea se poate realiza prin 3 mecanisme, n funcie de structura virusului:

fuziunea nveliului viral la membrana celular extern, cu eliberarea ulterioar a acidului nucleic viral,

viropexia (pinocitoza) - internalizarea ntregului virion i fuziunea ulterioar cu o membran intern vacuolar, pentru eliberarea acidului nucleic viral

penetrarea direct - virusurile lipsite de membran lipidic par s treac direct prin membrana citoplasmatic extern.

Fuziunea este mecanismul de internalizare folosit de paramyxovirusuri (v. rujeolic) (Fig. 2. 3. - L. Collier, J. Oxford, pag. 21). Aceste virusuri posed o "protein de fuziune" ce mediaz fuziunea ntre lipidele virale i ale membranei celulei gazd.

Viropexia (Fig. 2.3. - L. Collier, J. Oxford, pag. 21) se bazeaz pe existena la nivelul membranei celulelor de mamifere a unei proteine (clathrina) care este implicat i n ptrunderea unor molecule eseniale (substane nutritive, hormoni) n celule.

4. Decapsidarea i migrarea acidului nucleic la locul replicrii.

Decapsidarea const n ndeprtarea sau distrugerea capsidei virale astfel nct genomul viral s devin accesibil mecanismelor de transcripie i translaie. n multe cazuri, penetrarea i decapsidarea se produc sub forma unui proces unic. Astfel, n cursul traversrii membranei citoplasmatice, unele virusuri sufer alterri la nivelul structurii capsidei, aceste alterri facilitnd intrarea acidului nucleic n citoplasm.

n cazul virusurilor lipsite de anvelop, se poate produce fuziunea cu lizozomi, astfel nct decapsidarea se realizeaz prin enzimele lizozomale.

5. Sinteza macromolecular. Biosinteza componenilor virali

6. Eliberarea virusului din celula gazd.

n urma proceselor descrise mai sus, se realizeaz maturarea i se pun premizele eliberrii noii particule virale din celula gazd. Aceast din urm etap se poate realiza prin dou mecanisme : eliberarea prin nmugurire i eliberarea prin liz celular.

In cazul virusurilor eliberate prin nmugurire, o parte din proteinele virale sunt transportate la nivelul membranei celulare externe a celulei gazd, iar alte proteine structurale virale se cantoneaz la nivelul membranei celulare interne. Proteinele i acidul nucleic se asambleaz i proemin prin membrana celular. Aceast proeminen ("mugure") este apoi desprins i un nou virion este eliberat. Adesea, n cazul virusurilor eliberate prin nmugurire, procesul descris mai sus se repet succesiv, astfel nct o celul gazd elibereaz valuri succesive de noi particule virale.

Eliberarea prin liz celular presupune asamblarea complet a virionului n citoplasma celulei gazd i eliberarea sa prin liz i moartea celulei respective.

1.6. Relaia virus-organism gazd.

Interaciunile ntre virus i celula gazd sunt de o deosebit importan, n sensul c ele pot influena 3 aspecte eseniale :

- producerea infeciei

- tipul de infecie

- efectul final (deznodmntul) asupra gazdei.A. Factorul viral - patogenitate, virulen

Termenul de patogenitate se refer la gradul de severitate al bolii cauzate de un microorganism n comparaie cu cele cauzate de alte microorganisme (de ex. patogenitatea virusului rabic este mai mare dect cea a virusului rujeolic).

Termenul de virulen se refer la gradul de severitate al bolii cauzate de o tulpin n comparaie cu alte tulpini ale aceluiai microorganism. Adesea virulena sau absena acesteia la un microorganism pot fi dependente de porini extrem de reduse ale genomului. Altfel spus, o atenuare a virulenei se poate obine n unele cazuri printr-o mutaie punctiform. Aceste aspecte sunt de mare importan pentru prepararea vaccinurilor specifice precum i din punct de vedere epidemiologic i terapeutic.

Un alt factor viral important l constituie doza infectant care uneori joac un rol important, n sensul c o concentraie ridicat de virus poate determina o mbolnvire chiar atunci cnd virulena nu este ridicat.

Efectul citopatic

Multe virusuri distrug celula n care se replic genernd uneori aspecte caracteristice att in vivo ct i in vitro, desemnate ca efect citopatic.

Liza celular. n unele cazuri, sub influena proteinelor virale precoce (enzime) sinteza unor componente celulare poate fi afectat (oprit sau modificat). De asemenea, n cursul replicrii active a unor virusuri, se pot produce acumulri intracelulare de proteine capsidale care pot determina o inhibiie a biosintezei proteice virale i celulare. n consecin se produce moartea celular urmat de liz cu eliberarea unui numr mare de virioni.

Fuziunea celular. Proteinele de fuziune implicate n ptrunderea unor virusuri n celul pot cauza i formarea de celule gigante multinucleate (sinciii). n aceste cazuri, virionii trec de la o celul la alta fr a necesita liza celular.

Corpii de incluziune. Incluziunile pot fi localizate intranuclear i / sau intracitoplasmatic. Natura lor este diferit n funcie de agentul infectant :

- agregate de virioni maturi

- modificri degenerative, etc.

Modificarea antigenelor suprafeei celulare. Inducerea sintezei unor antigene celulare modificate este valabil mai ales n cazul virusurilor eliberate prin nmugurire. La suprafaa celulei infectate apar astfel antigene codificate de genomul viral care funcioneaz ca veritabili markeri i expun celulele respective atacului sistemului imun al gazdei.

B. Factori legai de gazd

Celulele pot fi infectate cu condiia existenei receptorilor specifici membranari (vezi "Internalizarea").

n cazul ptrunderii virusului n celula "int", el trebuie s se replice activ pentru a produce infecia, fapt ce nu se poate realiza dect cu condiia ca mediul celular intern s fie propice iniierii primului ciclu replicativ. Elementele implicate la acest nivel nu sunt nc pe deplin elucidate dar se pare c temperatura i activitile biochimice celulare sunt de importan major. n condiii suboptimale, replicarea viral poate fi totui iniiat rezultnd ns particule virale incomplete cu capacitate sczut de a infecta alte celule.

Ali factori legai de organismul gazd sunt :

- Vrsta - poate influena att susceptibilitatea la anumite infecii ct i evoluia acestora

- Statusul imun

- Anumite stri fiziologice particulare (ex. sarcina)

- Sexul

- Starea de nutriie

- Afeciuni asociate .

Cu alte cuvinte, ptrunderea virusului n organism nu presupune ntotdeauna infecie, iar infecia viral nu presupune ntotdeauna boal.

1.6.1. Ci de ptrundere a virusurilor n organism

Principalele ci de intrare a virusurilor n organism sunt :

A. Tractul respirator . Infeciile virale cu poart de intrare respiratorie sunt foarte frecvente i, n general, contagiozitatea acestora este extrem de ridicat datorit capacitii de diseminare a particulelor virale infectante de la o gazd la alta pe cale aerian. Aceste aspecte sunt favorizate de aglomerrile umane i de anotimpurile reci.

De menionat c, n unele cazuri, poarta de intrare nu coincide cu organul sau esutul "int". Astfel, n cazul virusului varicelic, dei calea de intrare este tractul respirator, inta principal este reprezentat de tegument

B. Tractul gastro-intestinal. Virusurile cu aceast poart de intrare sunt desemnate i ca virusuri cu transmitere fecal-oral, infeciile respective fiind, de regul, asociate cu condiii de igien defectuoas.

C. Tractul genito-urinar este calea de intrare a agenilor cu transmitere sexual. i n aceste cazuri poarta de intrare nu poate fi ntotdeauna identificat cu localizarea i manifestrile infeciilor respective (ex. virusul hepatitei B, HIV).

D. Calea cutaneo-mucoas. n general, tegumentul constituie o barier eficient n calea infeciilor bacteriene i a unor infecii virale. Totui, unele virusuri sunt capabile s traverseze acest obstacol producnd fie infecii mai mult sau mai puin localizate la acest nivel (v. papilloma, v. herpes simplex) fie infecii generalizate.

1.6.2. Tipuri de infecii virale

n funcie de extindere deosebim :

A. Infecii localizate

B. Infecii generalizate

Aceast clasificare este desigur rigid, motiv pentru care este necesar meniunea c n multe cazuri infecia viral intereseaz cu precdere un anumit organ sau esut (pentru care virusul respectiv posed o afinitate crescut = tropism) afectnd ns n paralel i alte organe i esuturi ale aceluiai organism.

A. Infecii localizate.

n general este vorba de infecii ale suprafeelor epiteliale : tegument (poxvirusuri, papillomavirusuri), conjunctiv, membrane mucoase ale tractului respirator, gastrointestinal i genital. Dei replicarea viral este adesea restrns la aceste localizri, efectele pot fi de tip general (v. paragripale).

B. Infecii generalizate

Dei mecanismele patogenetice ale unor infecii virale generalizate nu sunt pe deplin elucidate, desfurarea lor parcurge, de obicei urmtoarele etape :

- Ptrunderea virionilor n organism - se produce, de obicei printr-o suprafa epitelial ; la acest nivel are loc o replicare viral limitat.

- Migrarea virionilor ctre ganglionii limfatici regionali - la acest nivel, o parte dintre virioni sunt neutralizai de macrofage

- Ptrunderea virionilor restani n snge - se realizeaz astfel viremia primar care poate determina simptome clinice (febr, stare general alterat)

- Pe cale sanguin virionii ajung la ficat, splin, mduva osoas - la aceste nivele se reia replicarea viral, rezultnd un mare numr de virioni care eliberai n snge vor determina:

- Viremia secundar

- Pe cale sanguin virionii ajung la "organul int" (cel pentru care virusul prezint tropism) - la acest nivel se vor produce principalele simptome ale bolii.

n alte cazuri, infeciile generalizate se produc urmnd o cale mai direct i mai rapid pn la organul int (de exemplu n cazul injectrii directe n torentul sanguin).

n funcie de evoluie deosebim :

A. Infecii acute nepersistente (autolimitante)

B. Infecii persistente (latente)

C. Infecii insidioase cu evoluie letal

# B i C sunt desemnate ca infecii cronice.

Termenul de infecie cronic desemneaz situaia n care virusul este produs continuu n organism, cu sau fr integrarea ADN-ului viral n genomul celulei gazd.

A. Infecii acute nepersistente (autolimitante)

Majoritatea infeciilor virale acute se rezolv spontan (ex. hepatita A, gripa). Cu excepia cazurilor de interesare a sistemului nervos (ex. poliomielita), sechelele sunt rare. n unele situaii, pot aprea complicaii severe sau chiar decese. Patogeneza unora dintre aceste complicaii nu este pe deplin elucidat dar reaciile de tip autoimun ar putea juca un rol important.

B. Infecii persistente (latente)

n unele cazuri, virusul poate persista n organism datorit persistenei ADN-ului viral (virusuri ADN, retrovirusuri care formeaz ADN complementar n cursul replicrii). ADN-ul viral poate fi integrat n genomul celulei gazd sau poate fi prezent sub form episomal (molecul separat de ADN-ul gazdei). Evoluia ulterioar a acestui tip de infecie depinde n mare msur de rspunsul imun al gazdei. Acest tip de infecii virale cronice :

pot s fie asimptomatice,

pot s se reactiveze periodic genernd episoade cu manifestri clinice de boal,

virusul infectant poate s nu fie decelabil n perioadele asimptomatice, fiind ns decelabil n cursul episoadelor de reactivare,

unele dintre aceste infecii pot genera afeciuni maligne.

C. Infecii insidioase cu evoluie letal

Acest tip de evoluie caracterizeaz ageni desemnai ca "slow" virusuri. n aceste cazuri este implicat mecanismul de "toleran imun" care reprezint incapacitatea sistemului imun de a recunoate celulele infectate de virus ca fiind "non-self". Anticorpii care sunt produi n cantitate redus sunt ncorporai n complexe antigen-anticorp. Aceste complexe imune formeaz depozite renale care stau la baza evoluiei letale tardive a acestor infecii.

1.6.3. Rspunsul imun n infecii virale

Rspunsul imun face parte dintre mecanismele de aprare a organismului fa de agenii infectani (Tabel ....)

bel..... Mecanisme de aprare antiviral.

Tip de aprareMecanismExemple

Aprare nespecificBarier fizic

Bariere chimice

Factori umorali

Factori celulari-tegument, mucoase ;

- acizi grai, pH acid, mucus

- complement, lizozim, interferoni, proteine de faz acut

(proteina C reactiv, beta 2- microglobulina)

- flora asociat, celule NK

Aprare specific (Rspuns imun)Anticorpi

Citotoxicitate mediat celular, activarea macrofagelor

Rspunsul imun apare ca urmare a stimulrii celulelor imunocompetente la contactul cu ageni strini de organism i care sunt recunoscui ca atare ("non-self"). Agenii "non-self" sunt antigene i prezena lor n organism declaneaz n mod normal un rspuns specific din partea celulelor imunocompetente.

Celulele imunocompetente sunt :

-limfocitele T (T-helper, T-suppressor, T-citotoxice) - implicate n rspunsul imun de tip celular

-limfocitele B (responsabile de sinteza anticorpilor) - implicate n rspunsul imun de tip umoral.

Aceste celule, pe lng abilitatea de a face distincia ntre componentele proprii organismului (structuri "self") i antigene ("non-self"), posed aa-numita memorie imunologic. Conform acesteia, la un al doilea contact cu un antigen ntlnit anterior, se declaneaz un rspuns imun eficient. Acest mecanism st, de altfel, la baza imunizrilor specifice prin vaccinare.

A. Limfocitele B - Imunitatea specific umoral.

Limfocitele B prezint la suprafaa lor molecule de anticorpi care reacioneaz la contactul cu antigenele specifice. Acest contact este favorizat de prezena unor celule dendritice cantonate n ganglionii limfatici i n splin (APC - "antigen-presenting cells") care alturi de macrofge i monocite realizeaz o prelucrare a antigenului respectiv aducndu-l la o form mai recognoscibil pentru anticorpii prezeni pe limfocitele B. De fapt, aceste procese au un grad nalt de specificitate, bazndu-se pe complementaritatea dintre anticorp i receptorul specific pentru acesta.

n urma "ntlnirii" limfocitele B prolifereaz genernd o clon de celule cu aceeai specificitate antigenic.

La acest proces particip i limfokinele secretate de limfocitele T-helper. Acestea sunt stimulate tot de antigenul "prelucrat", pe baza existenei antigenelor de histocompatibilitate clasa II situate pe suprafaa APC.

Multe dintre celulele unei astfel de clone se difereniaz n celule efectoare (plasmocite) care secret cantiti crescute de anticorpi ce se vor combina n mod specific cu antigenul respectiv. Cantitatea de anticorpi secretat este controlat de limfocitele T (vezi mai jos).

Tipurile de anticorpi (imunoglobuline) secretai de limfocitele B sunt : imunoglobuline clasa A (IgA), clasa M (IgM), clasa G (IgG), clasa D (IgD) i clasa E (IgE). Fiecare clas de Ig este secretat de o clon celular diferit de plasmocite. n cazul infeciilor virale se pare c doar IgA, IgM i IgG ar prezenta importan.

Structura i funciile imunoglobulinelor

O molecul de Ig poate fi compus din una sau mai multe uniti constituite din 4 lanuri polipeptidice : 2 lanuri "grele" ("heavy" - H) i 2 lanuri "uoare" ("light" - L) care sunt dispuse sub forma literei "Y"

n poriunile terminale ale celor dou "brae" ale acestei molecule se remarc o mare variabilitate a secvenelor aminoacidice. Aceste aa-numite "regiuni hipervariabile" confer specificitatea antigenic a moleculei de Ig.

O imunoglobulin specific poate aciona n mai multe moduri la contactul cu un virus. Principalele modaliti sunt :

1. Neutralizarea - se produce prin combinarea moleculei de anticorp cu virionul, combinare care are ca rezultat fie blocarea procesului de ataare indispensabil ptrunderii virusului n celul, fie interferarea procesului de transcripie a ARNm.

2. Citotoxicitatea celular anticorpo-dependent - se produce cu participarea complementului, prin combinarea ntre anticorp i antigenul viral exprimat la suprafaa unei celule infectate. Rezultatul este liza celulei infectate.

3. Opsonizarea - anticorpii se pot comporta ca opsonine prin combinarea cu virionii care determin creterea capacitii macrofagelor de a-i fagocita i distruge.

4. Activarea macrofagelor - macrofagele acoperite cu anticorpi specifici sunt activate (potenate) s distrug celulele infectate care exprim antigene virale cu aceeai specificitate.

B. Limfocitele T - imunitatea specific mediat celular

Maturarea limfocitelor T se produce la nivelul timusului unde ele dobndesc receptorii cu specificitate de antigen. Unele subpopulaii limfocitare T secret substane solubile (limfokine sau interleukine).

Principalele clase de limfocite T sunt :

1. Celule reglatoare - Acestea fie stimuleaz, fie inhib activitatea altor tipuri de limfocite T sau B. Ele sunt desemnate ca limfocite T-helper i T-suppressor sau CD4 i, respectiv, CD8 (n funcie de markerii de suprafa identificai cu anticorpi monoclonali).

2. Celule citotoxice - acestea joac un rol important n infeciile virale, avnd capacitatea s recunoasc antigene virale la suprafaa celulelor infectate. Modul de aciune este prin liza celulei infectate.

3. Celule NK (natural killer) - alturi de celulele citotoxice i de macrofage, celulele NK acioneaz prin distrugerea celulelor care exprim antigene (ex. celule infectate, celule maligne, etc).

Interferon

Interferonii (IFN) sunt un grup de substane de natur glicoproteic ce prezint proprieti antivirale, antitumorale i imunomodulatoare.

Activitatea antiviral a acestui grup de substane se bazeaz pe inhibarea multiplicrii virale prin blocarea translaiei ARNm viral i / sau prin degradarea preferenial a acestuia.

La om exist 5 tipuri de IFN : alfa, beta, gamma, tau I omega. Genele codante pentru sinteza acestora sunt situate pe cromozomul 9 (interferonii alfa, beta, tau I omega) I, respectiv pe cromozomul 12 (interferonul gamma).

Din punct de vedere biochimic, IFN-alfa I -beta sunt monomeri cu structuri asemntoare, iar IFN-gamma are structur homodimeric (compus din dou uniti monomerice identice. IFN-tau I -omega au structuri asemntoare cu IFN-alfa.

Sinteza de IFN in vivo este stimulat, n principal, de virusuri, alturi de substane polinucleotidice, antigene, etc. Producia de IFN-alfa I -beta are loc n majoritatea celulelor organismului, n timp ce sinteza IFN-gamma a fost evideniat, pn n prezent doar n anumite tipuri de celule (limfocitele T CD8+, celulele NK).

Mecanismul de aciune antiviral al IFN (alfa, beta, gamma) este similar I este legat de prezena unor receptori IFN-specifici situai la nivelul majoritii membranelor celulare.

Efectul antiviral este dat prin intermediul sintezei proteice induse de formarea complexului receptor-IFN care migreaz intracitoplasmatic (se internalizeaz). De altfel, majoritatea efectelor IFN, prin intermediul proteinelor I enzimelor a cror sintez o induc, sunt efecte de tip antiproliferativ viral I celular. La acestea se adaug I efectele antineoplazice realizate prin represarea unor oncogene.

Aciunea antiviral a enzimelor IFN-induse se produce prin mecanisme variate :

- interferarea (blocarea) replicrii virale prin clivarea ARNdc (dublu catenar),

- blocarea translaiei I, deci, implicit blocarea sintezei proteinelor virale, - liza celulei gazd cu blocarea posibilitii de infectare a altor celule,

- scderea rezervelor de triptofan celular cu inhibarea creterii celulare,

- inhibarea revers-transcriptazei (acest efect a fost recent evideniat n cazul IFN-tau care are capacitatea de a inhiba revers-transcriptaza HIV).

Aplicaiile IFN n terapia antiviral s-au extins ncepnd cu anii '80. Rezultate bune s-au obinut n infecii cronice cu HTLV, papillomavirusuri, virusuri hepatitice, etc.

1.7. Chimioterapia antiviral

Proprietatea majora a virusurilor este de a se multiplica n celula vie, astfel nct, n aplicarea chimioterapiei antivirale trebuie avute n vedere doua aspecte eseniale:

aciunea selectiv asupra virusului situat intracelular

absena toxicitii pentru celula gazd.

Chimioterapicele antivirale utilizate n prezent acioneaz la unul sau mai multe nivele ale multiplicarii virale:

1. inhib iniierea infeciei (prin prevenirea atarii la receptorul celulei gazd) i decapsidarea

2. inhib sinteza acizilor nucleici (ADN sau ARN), intervenind n biosinteza componentelor virale

3. inhib ARNm, afectnd sinteza proteinelor structurale i asamblarea corect a virionului progen

4. inhib polimerazele virale

5. inhib reverstranscriptaza.

Inhibitori ai iniierii infeciei virale AMANTADINA i RIMANTADINA sunt amine ciclice (Rimantadina este un compus alfa-metilat al Amantadinei). Acioneaz n special asupra virusurilor gripale tip A (virusurile gripale tip B si C nu sunt sensibile). Se administreaza pe cale oral.

Mecanisme de aciune: inhib ptrunderea i decapsidarea virusurilor gripale tip A sau inhib asamblarea viral. In vivo i in vitro s-au selectat mutani rezisteni.

Indicaii : Amantadina se administreaza profilactic fa de infeciile cu virus gripal tip A. Dac se administreaza cu 48 de ore naintea debutului, simtomatologia clinic se reduce cu 50-90%.

Indicatiile principale sunt:

-indivizi cu imunodepresie

-indivizi nevaccinai cu risc crescut de infecie

-indivizi alergici la urmele de ovalbumin din vaccinul antigripal.

Reacii adverse:

Amantadina : tulburri nervoase, insomnii, iritabilitate, delir.

Rimantadina este mai puin toxic.

Inhibitori ai sintezei acizilor nucleici (analogi nucleozidici) ADENIN-ARABINOZID (VIDARABINA sau ARA-A) este un analog al adenozinei. Se administreaz intravenos sau ca unguent.

Mecanismul de actune: inhib att sinteza ADN-ului viral ct i al celulei gazd, dar ADN-ul viral este de 6-12 ori mai sensibil. Scade fosforilarea nucleozidelor de ctre enzimele celulare i se ncorporeaz n structura ADN.

Indicaii: (actioneaza asupra herpesvirusurilor si poxvirusurilor)

-scade mortalitatea n encefalita herpetic

-keratita herpetic

-indivizi cu imunodepresie la care atenueaz formele severe de varicel i herpes-zoster

Reacii adverse:

-greuri, vrsaturi, tranzit digestiv accelerat

-tulburri nervoase (parestezii, convulsii)

-rar: trombocitopenie sau leucopenie.

Se evit administrarea n insuficiena renal.

ACYCLOVIR (ACV) reprezint un analog al guanosinei (ZOVIRAX sau ACICLOGUANOSINA). Efectul antiviral este limitat numai la virusul herpes simplex i virusul varicelo-zosterian.

Este convertit n compus monofosforilat numai de ctre o enzim codificat de virus (timidinkinaza). Medicamentul este activ numai la acyclovir trifosfat fiind activat selectiv si eficient de timidinkinaza viral, care adiioneaz numai primul grup fosfat, n continuare fosforilarea fiind realizat de enzimele celulare. Adiia primului grup fosfat este o etap absolut indispensabil pentru activarea acyclovirului si reacia are loc numai n celulele infectate (de aici specificitatea aciunii). Inhib ADN polimeraza viral i sinteza de ADN viral n care se ncorporeaz. Are toxicitate scazut pentru celul. Se administraz oral (per os), intravenos sau ca unguente.

Indicaii:

-indivizi cu imunodeficiene, infectai cu virusul herpes simplex tip 1 i 2 i virusul varicelo-zosterian

-la pacienii cu transplante de maduv previne boala, atenueaz simtomele, scurteaz durata i reduce eliminarea de virus

-complicaii oculare herpetice

Dei este un medicament activ n herpesul primar, nu are efect asupra herpesului recurent, fiind inactiv asupra virusului latent.

Reactii adverse:

-se administreaza cu precautii la bolnavii cu afeciuni renale

-la bolnavii de SIDA pot aprea mutante rezistente deficiente n timidinkinaze.

Un derivat al acyclovirului, activ att pe virusul herpes simplex ct i pe virusul cytomegalic, este GANCYCLOVIR-ul (derivat al guanosinei).

Mecanism de aciune: inhib sinteza ADN-polimerazei i a ADN-ului viral. Se administreaz intravenos.

Indicaii:

-infecii cu virus cytomegalic (retinit)

-la pacieni cu imunodepresie (SIDA)

-tratamentul herpesului rezistent la Acyclovir.

Reacii adverse: neutropenie reversibil i leucopenie.

FAMCYCLOVIR - analog al timidinei a dat rezultate bune in infecii cu virusul varicelo-zosterian, fiind mult mai activ decat Acyclovir-ul.

RIBAVIRIN - derivat al guanosinei.

Are un spectru antiviral larg, actionnd asupra unor virusuri ADN dar i ARN.

Mecanism de aciune:

-inhib sinteza de ADN i ARN, prin scderea guanosin-trifosfatului intracelular

-inhib iniierea sintezei de ARNm

-inhib sinteza de ARN-polimeraz viral.

Se administreaz oral, intravenos, ca aerosoli.

Indicaii:

- n febra de Lassa reduce mortalitatea i scade viremia

- tratamentul infeciilor cu virusurile gripale tip A si B, virusul sinciial respirator (la copii), virusul rujeolic. n toate aceste cazuri, atenueaz simptomatologia, scade eliminarea virusului.

Reacii adverse:

-anemie dup administrare intravenoas

-conjunctivit i rash dup administrare ca aerosoli.

IDOXIURIDIN (IUDR) este un derivat halogenat al deoxiuridinei, ce acioneaz asupra virusurilor ADN.

Mecanism de aciune:

Se substituie timidinei rezultnd un ADN ce sintetizeaz proteine virale alterate.

Indicaii:

- in keratita herpetic, sub form de soluii oftalmice aplicate local.

Reacii adverse: toxicitate relativ crescuta.

Inhibitori ai ARNm METISAZONA - activ mai ales asupra poxvirusurilor.

Mecanism de aciune:

- inhib sinteza ARNm tardiv deci previne sinteza proteinelor structurale i formarea virionilor infectani. Se administreaza oral.

Indicaii:

- profilaxia infeciei variolice (ATENIE: - nu are aciune terapeutic dup debutul bolii).

Inhibitori ai polimerazelor virale FOSCARNET(acidul fosfonoacetic) - analog al pirofosfatului (fosfat anorganic).

Mecanism de aciune:

- inhibitor specific al ADN polimerazei herpes virusurilor, fr aciune pe polimerazele celulare. Se ataeaz direct de situs-urile de legare ale pirofosfatului la ADN si ARN polimerazele virale (inhib legarea ADN-polimerazelor i a reverstranscriptazei de substrat). Se administreaz intravenos.

Indicaii:

-infecii herpetice din SIDA, rezistente la Acyclovir

-retinite determinate de virusul citomegalic n SIDA. Eficacitatea fa de HIV se exprim prin scderea antigenemiei i creterea numrului limfocitelor T (CD4-pozitive), dar fenomenele sunt tranzitorii.

Reacii adverse:

- perturbri ale funciilor renale

- perturbri ale echilibrului electroliilor (Ca, K, Mg)

-convulsii.

Se acumuleaz n organism i are efecte secundare toxice. Apariia mutantelor virale rezistente este relativ frecvent.

Inhibitori ai reverstranscriptazei ZIDOVUDINE (RETROVIR, AZIDOTIMIDINA = AZT- analog pirimidinic sintetic care inhib retrovirusurile (inhib replicarea HIV in vitro i amelioreaz simptomatologia bolnavilor n stadiile precoce ale bolii).

Mecanism de aciune:

- este substrat pentru timidinkinaz pe care o convertete n compui inhibitori ai reverstranscriptazei i ntrerupe elongaia AND viral n cursul replicrii. Se administreaz oral.

Indicaii:

- n infecii cu HIV

- la bolnavii cu SIDA determin o cretere a limfocitelor T (CD4-pozitive), scderea antigenemiei i creterea ratei de supravieuire.

Reacii adverse:

- febr, rash, granulocitopenie, anemie, tulburri nervoase.

Exist riscul apariiei mutantelor virale, mai ales n cazul utilizrii dozelor mici de medicament.

DIDANOZINA - analog al deoxiadenozinei.

Mecanism de aciune:

- inhib, prin competiie, reverstranscriptaza. Se administreaza oral.

Indicaii:

- infectia HIV.

Reacii adverse:

- nevralgii periferice, diaree.

Contraindicat la bolnavii cu risc de pancreatit.

2. Virusuri defective, viroizi, prioni

Virusurile defective sunt virusuri care nu se pot replica autonom, necesitnd prezena unui aa-numit virus "helper" pentru a putea infecta i a se putea replica n organismul infectat. Uneori infecia asociat virus "helper" - virus defectiv poate fi deosebit de sever. Se pare c n aceste cazuri aciunea virusului helper este potenat i efectele sale sunt amplificate de prezena virusului defectiv. n alte cazuri aceste asocieri nu par s evolueze diferit de infeciile unice cu virusul helper respectiv.

Recent s-au descoperit noi clase de ageni infecioi : viroizii i prionii. Este vorba de cele mai mici particule cauzatoare de mbolnviri, cunoscute pn n prezent. Viroizii afecteaz celulele vegetale i ei sunt compui dintr-o molecul nenvelit de ARN circular, monocatenar, covalent nchis cu lungimi reduse (200-300 nucleotide sau chiar mai puin). Cu toate acestea viroizii sunt capabili s se replice autonom.

Prionii difer att de virusuri ct i de viroizi prin faptul c nu conin acizi nucleici. Se pare c proteinele prionice sunt codificate de gene celulare. Exist aspecte care sugereaz c prionii ar putea fi implicai n afeciuni cum sunt maladia Creutzfeld-Jacob, kuru, etc.

3. Diagnosticul de laborator n infecii virale

Metodele principale ale diagnosticului de laborator al infeciilor virale sunt :

A. Examenul citologic

B. Microscopia electronic

C. Izolarea i cultivarea virusurilor

D. Decelarea de proteine virale

E. Metode serologice

F. Decelarea de material genetic

A. Examenul citologic

Constituie o metod rapid de diagnostic virusologic ce presupune identificarea efectelor produse asupra structurilor celulare. Desigur, metoda este aplicabil doar n cazul virusurilor care determin modificri caracteristice la nivelul celulelor infectate (efect citopatic). Astfel de modificri sunt, de exemplu :

-modificri morfologice

-liza celular

-vacuolizarea

-inducerea formrii de sinciii (conglomerate de celule fuzionate)

-formarea de incluziuni (modificri ale unor structuri celulare intranucleare sau intracitoplasmatice)

B. Microscopia electronic

Este o metod de detectare i identificare a unor virusuri, cu condiia ca numrul de virioni prezeni n proba examinat s fie suficient.

Prin adugarea de anticorpi specifici virali ntr-o prob se poate facilita detectarea i identificarea simultan a virusului, datorit producerii reaciilor specifice antigen-anticorp (imunomicroscopie electronic).

C. Izolarea i cultivarea virusurilor

O serie de virusuri pot fi introduse i cultivate n culturi de celule. Alegerea, pe de o parte, a produsului patologic i, pe de alt parte, a tipului de mediu celular de cultivare, sunt orientate de datele clinice i epidemiologice care contureaz un diagnostic preliminar, prezumptiv. n funcie de acesta, deci de agentul viral bnuit, se va alege de asemenea i momentul recoltrii produsului patologic (n concordan cu etapele mecanismului patogenic). De regul, momentul recoltrii trebuie s fie ct mai precoce (ct mai curnd dup debutul bolii), cu att mai mult cu ct anticorpii produi ca rspuns la infecie pot bloca detectarea virusului.

a. Cultivarea. Virusurile se pot cultiva n culturi de esuturi, pe ou embrionate sau prin inoculare la animale de expreien.

Pentru cultivarea virusurilor se folosesc diferite tipuri de culturi celulare :

-Culturi celulare primare - obinute din organe animale prin disociere enzimatic (tripsin, colagenaz) ; celulele sunt cultivate sub form de monostrat sau sub form de suspensie n medii de sintez mbogite cu factori de cretere (ser bovin).

-Culturi celulare secundare - obinute prin disocierea culturilor celulare primare cu tripsin, urmat de transfer sau pasaj.

-Tulpini celulare diploide - obinute prin cultivarea unui singur tip celular, apte de a suporta un numr finit de pasaje (transferuri) pn la constatarea unor modificri semnificative.

-Linii celulare - obinute prin cultivarea de celule tumorale sau de celule imortalizate sub aciunea virusurilor sau a unor substane chimice, apte de a suporta un numr infinit de pasaje fr a suferi modificri.

Exemple :

- Cultura primar de celule renale de maimu - cultivarea de othomyxovirusuri, paramyxovirusuri, unele enterovirusuri, unele adenovirusuri.

- Cultura de celule diploide fetale - cultivare de herpesvirusuri, picornavirusuri, adenovirusuri.

b. Detectarea. Detectarea i identificarea virusurilor n culturi celulare se face iniial prin observarea tipului de efectului citopatogen :

- moartea celular : rotunjire - degenerare - agregare - desprinderea de substratul (suportul) de cultur

- modificri histologice : incluziuni nucleare sau citoplasmatice, sinciializarea (celule gigante multinucleate formate prin fuziune celular)

- modificri celulare de suprafa : exprimare de antigene virale, hemadsorbie.

Pe baza tipului de cultur celular, a efectului citopatogen i a timpului de cretere viral se realizeaz indentificarea iniial n cazul multor virusuri.

Exist ns virusuri care nu pot fi detectate i identificate n acest mod deoarece ele fie nu produc efect citopatogen direct, fie cresc extrem de lent, fie nu cresc de loc n culturi de celule.

n cazul absenei efectului citopatogen direct, identificarea iniial n culturi de celule a unor virusuri se poate realiza pe baza unor efecte indirecte :

- Interferena heterolog - proces prin care replicarea unui virus interfereaz (inhib) replicarea unui alt virus ; n cultura celular, identificarea se va face pe baza absenei efectului ciotopatogen al virusului interferat.

- Hemadsorbia - celulele infectate cu anumite virusuri exprim antigene virale (hemaglutinine) care leag eritrocitele anumitor specii animale.

- Hemaglutinarea - prezena virusului determin aglutinarea eritrocitelor.

c. Interpretarea rezultatelor. De obicei, detectarea i identificarea unui virus ntr-o prob constituie un diagnostic de certitudine. Totui, rezultatele obinute prin aceast metod nu trebuie absolutizate i ele trebuie corelate cu contextul clinic i epidemiologic al cazului.

De asemenea, un rezultat negativ nu exclude neaprat infecia viral suspicionat (motive legate de recoltare, transport neadecvat al produselor patologice, prezena anticorpilor neutralizani n cazul recoltrii tardive a produsului patologic, etc) .

D. Decelarea de proteine virale

n cursul replicrii virale sunt produse proteine specifice care pot fi decelate prin metode :

-biochimice

-imunologice

-de biologie molecular.

- Metode biochimice - proteinele virale pot fi supuse electroforezei. Tiparele ("pattern-urile") electroforetice obinute pot fi apoi utilizate pentru identificarea prin comparare a diferitor virusuri. Detectarea unor enzime poate indica prezena unor tipuri sau genuri virale (exemplu : prezena revers-transcriptazei indic prezena unui retrovirus).

- Metode imunologice - Prin utilizarea de anticorpi specifici marcai pot fi identificate antigene virale prezente n produse patologice sau n culturi celulare. Marcarea anticorpilor se poate realiza cu substane fluorescente, radioactive sau cu enzime.

- Metode de biologie molecular - sunt folosite pentru decelarea i identificarea materialului genetic viral.

a) Sondele ADN marcate - constituie o metod sensibil i specific de detectare a unor genoame virale. Metoda se bazeaz pe complementaritatea ntre secvena sondei ADN i cea a unei regiuni specifice a genomului viral. Principiul este asemntor celui care st la baza detectrii antigenelor prin anticorpi specifici marcai.

Marcarea sondelor ADN se realizeaz cu nucleotide tratate radioactiv sau chimic.

b) Hibridizarea in situ - detectarea de secvene genomice virale specifice n biopsii de esuturi folosind sonde ADN

c) Tehnici de hibridizare de tip "dot blot" - au la baz tot utilizarea sondelor ADN i folosesc drept suport filtre de nitroceluloz.

-"Southern blot" - hibridizare ADN-ADN : ADN-ul viral este separat electroforetic, transferat apoi pe un filtru de nitroceluloz i apoi identificat pe baza mobilitii electroforetice specifice i prin hibridizare cu o sond ADN specific marcat

-"Northern blot" - hibridizare ARN-ADN : ARN-ul viral este separat electroforetic, transferat pe un filtru de nitroceluloz i detectat prin sond ADN specific marcat

d) Polymerase chain reaction (PCR) - are la baz mecanismul de replicare semiconservativ a ADN. Proba de analizat se incubeaz mpreun cu doi oligomeri ADN, complementari cu capetele unei secvene cunoscute a genomului viral, care, prin hibridizare vor servi drept "amorse" ("primeri") pentru ADN-polimeraza viral, determinnd copierea unui segment ADN.

Prin nclzirea probei se obine apoi denaturarea ADN (separarea celor dou catene), dup care prin rcire se faciliteaz hibridizarea amorselor la noul lan ADN. Fiecare copie se va comporta ca matri pentru sinteza de noi lanuri ADN. Procesul continu ciclic ducnd la o amplificare exponenial (milioane de copii) a secvenei ADN iniiale (originale).

Aceast tehnic este util mai ales pentru detectarea virusurilor n infecii latente sau cu secvene ale genomului viral integrate n genomul celulei gazd (retrovirusuri, herpesvirusuri, etc).

E. Metode serologice .

Sunt utile n cazul virusurilor ce nu pot fi cultivate n culturi celulare i n cazul infeciilor virale cu evoluie lent (de exemplu, virusurile hepatitice, HIV, arbovirusuri). De asemenea, serologia este util pentru stabilirea rspunsului imun n infecii virale.

Principalele tipuri de teste serologice folosite n diagnosticul infeciilor virale sunt :

1. Reacia de fixare a complementului

2. Reacia de hemaglutinoinhibare

3. Reacia de neutralizare

4. Imunofluorescena direct i indirect

5. Latex-aglutinarea ; Hemaglutinarea pasiv

6. Reaciile imunoenzimatice (ELISA - "enzyme-linked immunosorbent assay") ; Testele Western blot

7. Teste radioimune (RIA)

1. Reacia de fixare a complementului.

Serul este pus n contact cu antigen viral i complement n cantitate cunoscut. n cazul prezenei anticorpilor specifici n serul de cercetat, formarea complexelor antigen-anticorp va determina activarea i fixarea complementului. Prin adugarea de eritrocite marcate cu anticorpi anti-eritrocitari se determin prezena de complement liber (nefixat).

Rezultat negativ - prezena de complement liber (nefixat) tradus prin hemoliz

Rezultat pozitiv - absena complementului liber, datorit fixrii sale n complexele antigen viral-anticorp specific-complement, tradus prin absena hemolizei

2. Reacia de hemaglutino-inhibare i 3. Recia de neutralizare

Se deceleaz legarea anticorpilor specifici de virus. Acest proces blocheaz posibilitatea de legare a virusului la celule "martor" (eritrocite).

5. Latex-aglutinarea ; Hemaglutinarea pasiv

Deceleaz anticorpi sau antigene solubile.

Anticorpii specifici antivirali determin aglomerarea particulelor de latex acoperite cu antigene virale sau, invers, antigene solubile virale determin aglomerarea particulelor de latex acoperite cu anticorpi specifici.

n cazul hemaglutinrii pasive principiul este acelai, dar n loc de particulele de latex sunt utilizate hematii.

6. Reaciile imunoenzimatice

n cazul testelor de decelare a anticorpilor specifici antivirali, se utilizeaz antigene fixate pe un suport solid inert (nitroceluloz, polistiren, latex, etc). n contact cu serul de cercetat, aceste antigene vor fixa anticorpii specifici. Detectarea acestor anticorpi specifici antivirali se face prin adugarea unui anticorp anti-imunoglobulin uman, marcat prin legarea covalent cu o enzim (peroxidaza, fosfataza alcalin, etc). Se formeaz astfel un complex :

antigen - anticorp seric - anticorp antimunoglobulin uman - enzim.

Detectarea prezenei acestui complex (deci implicit a prezenei anticorpilor serici specifici antivirali) se face prin adugarea substratului enzimei respective i analiza spectrofotometric a intensitii culorii rezultate prin reacia enzim-substrat.

In cazul testelor ELISA de decelare a antigenelor virale, principiul reaciei este acelai cu excepia faptului c, pe suportul solid al reaciei, sunt fixai anticorpi specifici antivirali.

O variant a ELISA sunt testele Western blot. Proteinele virale sunt separate prin electroforez, ele migrnd conform greutii lor moleculare sau sarcinii electrice i fiind transferate (sub form de "pete"-"blot-uri") pe un suport solid inert (nitroceluloz). n contact cu serul de cercetat, aceste fraciuni proteice virale vor fixa anticorpii specifici. Vizualizarea acestor reacii antigen-anticorp se realizeaz prin adugarea de anticorpi antiimunoglobulin uman marcai enzimatic.

7. Teste radioimune.

Se utilizeaz anticorpi sau antigene marcate redioactiv pentru detectarea complexelor antigen-anticorp.

Att ELISA ct i RIA se pot realiza sub form de teste de captur antigenic, respectiv captur de anticorpi, dup cum s-a descris mai sus, sau sub form de teste competitive. n cazul testelor de tip competitiv, anticorpii din serul de cercetat sunt detectai (i pot fi cuantificai) pe baza competiiei lor cu anticorpi de sintez.