Post on 24-Jul-2015
LOGO
STUDIUL PRIVIND INFLUENŢA VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA
COMPOZIŢIEI CHIMICE A FRUNZELOR ŞI FRUCTELOR LA ŞASE
SOIURI ALE SPECIEI PRUNUS DOMESTICA L.
Dr. ing. BRICIU ALEXANDRU CIPRIAN
Prof. dr. PAMFIL DORU
UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ
CLUJ-NAPOCA
ŞCOALA POSTDOCTORALĂ
POSDRU/89/1.5/S/52432
www.themegallery.com
CUPRINS
1. Stadiul actual al cunoştiinţelor în domeniul strict al
temei de cercetare postdoctorale
2. Scopul şi obiectivele cercetării, materialul şi metoda
3. Rezultate şi discuţii
4. Concluzii
www.themegallery.com
INTRODUCERE
Virusul Plum pox este considerat cel mai devastator patogen viral al speciilor pomicole sâmburoase. Acest fapt se datorează scăderii calităţii fructelor şi pierderilor cauzate de căderile premature ale acestora.
În România, acest virus este răspândit în toate arealele de cultură ale prunului şi provoacă pierderi masive de producţie ( Zagrai şi colab., 2006).
Cele mai recente cercetări de mare amploare din Romania au fost coordonate de către dr. ing. Zagrai Ioan, cercetător la SCDP Bistriţa. Rezultatele au arătat o situaţie dramatică şi necontrolabilă în ceea ce privesc infecţiile masive cu Plum pox din ţara noastră.
Studierea impactului PPV-ului asupra compoziţiei chimice a prunelor are un caracter limitat la nivel global. În România singurele cercetări au vizat acţiunea virusului Plum pox asupra cantităţii de substanţă uscată, pH şi aciditate titrabilă, analize efectuate pe un număr de 26 de soiuri. Rezultatele studiului au arătat o scădere a cantităţii de substanţă uscată şi a pH-lui şi o creştere a acidităţii titrabile (Maxim, 2001).
www.themegallery.com
Simptomele provocate de virusul Plum pox
Plum pox este o boală foarte gravă producând simptome severe pe fructe,
frunze, sâmburi, uneori pe trunchi şi pe ramurile de schelet. Simptomele de
PPV sunt foarte evidente pe frunzele de primăvară ce se manifestă sub
forma unor decolorări de culoare verde deschis, pete clorotice, cercuri
concentrice, deformări ale frunzelor. În unele cazuri se constată o cădere
prematură a fructelor bolnave.
Prezenţa sau intensitatea simptomelor variază în funcţie de specie şi soi,
tulpina virală, starea fitosanitară a gazdei cu privire la alţi viruşi, sezon şi
locaţie. PPV influenţează într-o mică măsură vigoarea şi longevitatea
pomilor infectaţi.
www.themegallery.com
Simptomele provocate de virusul Plum pox
Simptome de PPV pe frunze de prun Atac de PPV pe fructe de prun
Atac de PPV pe fructe de piersic Simptome de plum pox pe fructe de cais
www.themegallery.com
Starea actuală a tulpinilor virusului Plum pox
Caracterizările serologice şi moleculare a izolatelor Plum pox virus (PPV)
efectuate de către cercetătorii din Europa Occidentală au permis stabilirea
apartenenţei izolatelor la diferite tulpini virale dar şi la identificatea unor
forme recombinate.
Cele 8 tulpini virale
ale PPV-ului
Suşa D (dideron) - Franţa
Suşa M (marcus) - Grecia
Suşa Ea (el amar) - Egipt
Suşa SoC (sour cherry) – Republica Moldova
Suşa SwC (sweet cherry) - Italia
Suşa PPV-Rec - Slovacia
PPV-W(winona) - Canada
PPV-T - Turcia
www.themegallery.com
Cercetările realizate asupra rezistenţei prunului la
Plum pox pe glob şi în România
Pe plan mondial există două direcţii în ceea ce priveşte dezvoltarea
rezistenţei prunului la PPV. Prima direcţie ar fi ameliorarea clasică, ce
exploatează rezistenţa naturală. Din păcate lipsa acestei rezistenţe
naturale a împiedicat obţinerea de soiuri rezistente la PPV prin
ameliorare clasică. A doua direcţie reprezintă utilizarea ingineriei
genetice în obţinerea de plante modificate genetic, rezistente la PPV.
Mirobolan BN 4Kr
Local de Dragăşani
soiul Jojo
Rezistenţă naturală
Linia transgenică C5
Rezistenţă genetică
www.themegallery.com
Cercetări privind studierea compuşilor fenolici şi a
activităţii antioxidante
Prunele conţin ceea mai mare cantitate de potasiu, fosfor, calciu şi
magneziu, fiind foarte bogate în compuşi fenolici, caracterizaţi ca
având o mare capacitate antioxidantă, mai mare decât portocalele,
merele sau strugurii (Sochor şi colab., 2010).
Compuşii fenolici naturali au continuat să atragă interesul unui număr
mare de cerectători în contextul unei scăderi a incidenţei la cancer şi
boli cardiovasculare (Long şi colab., 2001). Polifenolii s-au dovedit a fi
compuşi antimicrobiali naturali, fapt important pentru un organism
sănătos (Naidu, 2000).
Cele mai multe cercetări pe prun au vizat analizarea cantităţii de
polifenoli totali, activităţii antioxidante, pH-ul, aciditatea totală din
fructe (Gil şi colab., 2002; Cevallos-Casals şi colab., 2006).
www.themegallery.com
SCOPUL CERCETĂRII
Proiectul “Studierea influenţei virusului Plum pox asupra
compoziţiei chimice a frunzelor şi fructelor la şase soiuri ale
speciei Prunus domestica L.”abordează aspecte de mare
actualitate ce asigură acumularea de cunoştinţe avansate şi
rezultate ştiinţifice într-un domeniu de mare importanţă
ştiinţifică şi economică.
Având în vedere pagubele uriaşe produse de virusul Plum
pox culturii prunului prin diminuarea semnificativă a
producţiilor de prune din ţara noastră, modul de abordare
a problematicii propuse se justifică pe deplin şi se
încadrează în politica naţională în domeniu.
www.themegallery.com
OBIECTIVELE URMĂRITE
În cadrul prezentului proiect de cercetare postdoctorală am urmărit să determinăm dacă polifenolii au un rol în rezistenţa/sensibilitatea la nouă soiuri de prun privind infecţiile cu PPV.
Obiectivele secundare se referă la:
• diagnosticarea moleculară,
• diferenţierea tulpinilor PPV pentru fiecare soi în parte prin tehnicile RT-PCR şi PCR-RFLP,
• determinarea influenţei PPV-ului (tulpinilor D şi REC) asupra totalităţii polifenolilor, capacităţii antioxidante, pH-ului şi acidităţii titrabile.
www.themegallery.com
MATERIAL ŞI METODE
RT-PCR P1/P2
CP P1-PD/PM
NIb mD5/Mm3
PCR-RFLP
Rsa I Alu I
Tehnici de
laborator
utilizate
Totalitatea
polifenolilor (TP)
Folin-ciocalteu
Capacitatea
antioxidantă
DPPH
www.themegallery.com
REZULTATE ŞI DISCUŢII
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN RT-PCR A
CELOR 36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA
Diagnosticarea moleculară
Analizarea profilului electroforetic folosind amorsele P1/P2 pentru
identificarea prezenţei sau absenţei virusului la 12 probe; L-100pb
DNA Step Ladder.
Legendă:
I1-4=Iulia
C1-4=Carpatin
A1-4=Albatros 243 pb
L I1 I2 I3 I4 C1 C2 C3 C4 A1 A2 A3 A4
www.themegallery.com
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Diferenţierea moleculară a tulpinilor PPV-D şi PPV-M
Analizarea profilelor electroforetice folosind perechile de amorse P1/PD şi
P1/PM în vederea diferenţierii tulpinilor PPV-D şi PPV/M la 5 probe ce aparţin
soiurilor: Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva
P1PD P1PM
198 bp
L I C A D M L I C A D M
Legendă:
I- Iulia- 6/38
C- Carpatin-13/38
A-Albatros- 16/28
D-Diana-10/4
M-Minerva-12/1
www.themegallery.com
REZULTATE ŞI DISCUŢII
Detecţia tulpinii recombinate PPV-Rec
Prima apariţie privind recombinarea ARN-ului în PPV a fost raportată în fosta Iugoslavie
(izolatul 06) de către Cervera şi colab., (1993) şi în Slovacia (izolatul BOR-3) de către Glasa şi
colab., (2001). La noi în ţară studiile efectuate de către Zagrai şi colab. (2006, 2008) arată o
răspândire a tulpinii PPV-Rec în toate zonele de cultură a prunului. Aceste izolate PPV-Rec
prezintă o mare similaritate cu alte izolate recombinate raportate de Glasa şi colab. (2004)
împărtăşind acelaşi punct de recombinare. L 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C-
Analizarea profilului electroforetic folosind perechea de amorse mD5m/M3
în vederea identificării tulpinii PPV-REC la 5 probe ce aparţin soiurilor:
Iulia, Carpatin, Albatros, Diana, Minerva.
605 pb
L I C A D M
Legendă:
I- Iulia- 6/38
C- Carpatin-13/38
A-Albatros- 16/28
D-Diana-10/4
M-Minerva-12/1
www.themegallery.com
REZULTATE ŞI DISCUŢII
L 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 C+ C-
L I C A D M
Rezultatele analizelor moleculare la cele 36 de probe prelevate de la noua soiuri de
prun cultivate la Staţiunea de Cercetare şi Dezvoltare Pomicolă Bistriţa
Soiul
Variety
Tulpina
Strain
Iulia Carpatin Cacanska
Rana
Albatros Romaner Oneida Diana Minerva Ivan
free free free free free free free free free
PPV-D PPV-D PPV-D PPV-D PPV-
D+REC
PPV-
REC
PPV-
REC
PPV-REC PPV-REC
PPV-
REC
PPV-
REC
PPV-REC PPV-
REC
PPV-
D+REC
PPV-
REC
PPV-
REC
PPV-REC PPV-REC
PPV-
D+RE
C
PPV-
D+REC
PPV-
D+REC
PPV-
D+REC
PPV-
D+REC
PPV-
REC
PPV-
D+RE
C
PPV-
D+REC
PPV-REC
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN PCR-RFLP A CELOR
36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA
Diferenţierea moleculară a tulpinilor virale PPV-D şi PPV-M prin digestia
enzimatică cu enzima Rsa I
L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3
Diferenţierea tulpinilor virale cu ajutorul tehnicii PCR-RFLP,
utilizând enzima de restricţie RsaI (probele A1-3= Albatros,
R1-3= Romaner, C1-3= Carpatin), L- Ladder pUC 18 DNA
Msp I Digest
Legendă:
A1-3=Albatros
R1-3=Romaner
C1-3=Carpatin
REZULTATE ŞI DISCUŢII
61 bp
182 bp
243 bp
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA MOLECULARĂ PRIN PCR-RFLP A CELOR
36 DE PROBE RECOLTATE DE LA SCDP BISTRIŢA
Identificarea eventualelor mutaţii suferite de tulpinile virale la nivelul
situsului de restricţie al regiunii genei care codifică proteina capsidală
L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3 L A1 A2 A3 R1 R2 R3 C1 C2 C3
Produşii PCR digeraţi cu enzima de restricţie AluI
pentru probele A1-3= Albatros, R1-3= Romaner, C1-3=
Carpatin, L- Ladder pUC 18 DNA Msp I Digest
Legendă:
A1-3=Albatros
R1-3=Romaner
C1-3=Carpatin
REZULTATE ŞI DISCUŢII
61 bp
182 bp
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI VIRUSULUI
PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A
CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN
Analizarea celor doi parametri biochimici (pH şi TA) la fruzele de prun
recoltate de la cele nouă soiuri
În cazul celor nouă soiuri s-a constatat o scădere a valorilor
pH-ului şi o creştere a acidităţii titrabile la probele infectate în
comparaţie cu cele neinfectate. Cele mai mari diferenţe faţă de
proba neinfectată s-au obsevat la probele infectate cu tulpina REC,
dar mai ales la infecţiile mixte. Virusul Plum pox a influenţat
semnificativ pH-ul şi aciditatea, soiurile sensibile fiind mai
afectate decât cele tolerante.
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI VIRUSULUI
PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A
CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN
Conţinutul de polifenoli totali din frunzele de prun
Determinarea valorilor de polifenoli totali au fost re-calculate pe baza acidului galic
(GA), care au variat de la 768,9 la 994,0 mg GA • 100 g-1 (FW) şi oferă informaţii cu privire la
conţinutul de polifenoli din frunzele de prun (tab. 3).Valorile cele mai mari de polifenoli totali
au fost determinate la genotipul Iulia (PPV-D + REC-994,0 mg GA • 100 g-1 FW şi PPV-REC -
976,0 GA • 100 g-1 FW), iar cel mai mic nivel la soiul Albatros (PPV-D - 768,9 mg GA • 100 g-
1 FW şi PPV-REC - 782,5 mg GA • 100 g-1 FW).
Capacitatea antioxidantă a frunzelor de prun
Valorile capacităţii antioxidante au variat de la 131,9 la 285,8 mmol·L-1 de produs
vegetal proaspăt (FW). Cele mai mari valori ale capacităţii antioxidante au fost puse în
evidenţă la genotipul Iulia (PPV-D+REC- 285,8 mmol·L-1and PPV-REC - 272,8 mmol·L-1),
iar cele mai mici la genotipul Romaner (PPV-D + REC – 131,9 mmol·L-1) şi Carpatin (PPV-D
– 135,3 mmol·L-1).
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA
INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA
POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII
ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN
Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea antioxidantă a
frunzelor de prun.
0
200
400
600
800
1000
1200
0 50 100 150 200 250 300 350
Activitatea antioxidantă exprimată prin concentraţia Troloxului (mmol•L-1 )
Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmol•L-1 )
TP
ex
pri
ma
t p
rin
co
nţi
nu
tul d
e a
cid
ga
lic
(m
g G
A.1
00
g-1
)
TP
ex
pre
ss
ed
as
co
nte
nt
of
ga
llic
ac
id
(mg
GA
.10
0g
-1 )
Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea
antioxidantă a frunzelor de prun.
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA
INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA
POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII
ANTIOXIDANTE LA FRUNZELE DE PRUN
Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea antioxidantă a
frunzelor de prun.
Continuare
Între capacitatea antioxidantă şi cantitatea de polifenolic total (TP) s-a evidenţiat o
corelaţie pozitivă (r=0,71).
Valorile polifenolilor totali au fost mai mari la probele infectate faţă de cele free, mai
ales la soiurile tolerante. Acest lucru dovedeşte faptul că polifenolii pot avea un rol
important în rezistenţa/sensibilitatea soiurilor de prun la PPV.
Rezultatele noastre sunt în concordanţă cu literatura de specialitate (Gunen, 2005;
Honty, 2010), indicând faptul că polifenolii totali pot fi consideraţi markeri biochimici;
putând fi utilizaţi în diferenţierea soiurilor tolerante şi rezistente la PPV. Diferenţierea
tulpinilor D şi REC ne-a indicat faptul că cea mai mare influenţă a avut-o tulpina REC şi
infecţiile mixte (D+REC), mai ales la varietăţile sensibile.
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI
VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR
TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA
PRUNE
Determinarea valorilor pH-lui din prune
În cazul celor două soiuri s-a constatat o scădere a valorilor
pH-ului la probele infectate în comparaţie cu cele neinfectate. Cele
mai mari diferenţe faţă de proba neinfectată s-au obsevat la
probele infectate cu tulpina REC, dar mai ales la infecţiile mixte.
Virusul Plum pox a influenţat semnificativ pH-ul şi aciditatea,
soiurile sensibile fiind mai afectate decât cele tolerante.
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI
VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR
TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA PRUNE
Valorile pH-lui din prune la soiurile de prun studiate
Nr.crt.
No.
Soiul
Variety
pH-ul
1 Carpatin-Free 3,27
2 Carpatin-D+REC 3,17
5 Diana-Free 3,67
6 Diana-D+REC 3,45
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA INFLUENŢEI
VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA POLIFENOLILOR
TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA
PRUNE
Cantitatea de polifenoli totali şi capacitatea antioxidantă din
prune
În cazul prunelor, infecţia cu PPV a determinat o creştere a cantităţii
de polifenoli totali. Diferenţele dintre proba free şi cea infectată cu tulpina
D+REC sunt mai mari la soiul Carpatin, considerat a fi tolerant la acest virus.
Soiul Diana confirmă faptul că este sensibil deoarece cantitatea de polifenoli
totali este mai mică, neputându-se proteja împotriva infecţiei.
Valorile polifenolilor totali în cazul altor studii au variat de la 42.0
(soiul Wickson) la 109,2 mg/100g material proaspăt (soiul Black Beaut) (Gil şi
colab., 2002); 14–109 mg/100 g (Gil şi colab., 2002); 125–373 mg/100 g (Kim
şi colab., 2003). Aceste comparaţii ne indică faptul că soiurile studiate de noi
au un conţinut mai mic de polifenoli totali.
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA
INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX
ASUPRA POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A
CAPACITĂŢII ANTIOXIDANTE LA
PRUNE
Nr.crt.
No.
Soiul
Variety
Totalitatea polifenolilor
Total polyphenols
mg GA.100g
-1 FW
DPPH
mg Trolox.100g
-1 FW
1 Carpatin-Free 45,2 70,6
2 Carpatin-D+REC 74,0 82,6
3 Diana-Free 32,7 61,3
4 Diana-D+REC 37,2 67,1
www.themegallery.com
REZULTATE PRIVIND ANALIZAREA
INFLUENŢEI VIRUSULUI PLUM POX ASUPRA
POLIFENOLILOR TOTALI ŞI A CAPACITĂŢII
ANTIOXIDANTE LA PRUNE
Corelaţia dintre conţinutul polifenolilor totali (TP) şi capacitatea
antioxidantă a frunzelor de prun.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Activitatea antioxidantă exprimată prin concentraţia Troloxului (mmol•L-1 )
Antioxidant activity expressed as concentration of Trolox (mmol•L-1 )
TP
exp
rim
at
pri
n c
on
ţin
utu
l d
e
acid
galic (
mg
GA
.100g
-1 )
TP
exp
ressed
as c
on
ten
t o
f g
allic
acid
(m
g G
A.1
00g
-1 )
Între cantitatea de polifenoli totali şi activitatea antioxidantă (fig. 11) s-a stabilit
o corelaţie foarte pozitivă (r=0.95).
Rezultatele noastre sunt confirmate de literatura de specialitate, sugerând
faptul că cele două metode sunt cele mai recomandate a fi folosite în aceste analize.
Această corelaţie pozitivă dintre TP şi DPPH indică o posibilă asociere a acestora cu
rezistenţa la PPV. Acest fapt este confirmat şi în literatura de specialitate (Sochor şi
colab., 2010; Honty, 2010).
www.themegallery.com
CONCLUZII
În cazul studiului realizat pe frunzele şi fructe, rezultatele au dovedit faptul
că virusul Plum pox a determinat o scădere a valorilor pH-lui şi o creştere a
acidităţii titrabile la probele infectate în comparaţie cu cele neinfectate.
Valorile polifenolilor totali pentru probele infectate faţă de cele free au fost
mai mari la soiurile tolerante, în comparaţie cu cele sensibile. Aceste rezultate
confirmă faptul că polifenolii pot avea un rol important în
rezistenţa/sensibilitatea soiurilor de prun la virusul Plum pox.
În cazul frunzelor a fost stabilită o corelaţie pozitivă între activitatea
antioxidantă şi cantitatea totală de polifenoli (r=0.71). Rezultatele noastre sunt
în concordanţă cu literatura de specialitate (Gunen, 2005; Honty, 2010),
indicând faptul că polifenolii totali pot fi consideraţi markeri biochimici,
putând fi utilizaţi în diferenţierea soiurilor tolerante şi rezistente la PPV.
În cazul prunelor corelaţia dintre cantitatea de polifenoli totali şi
activitatea antioxidantă a avut o valoare foarte pozitivă (r=0.95).
Corelaţii pozitive au fost obţinute în literatura de specialitate şi
de către Gil şi colab.( 2002), Cevallos-Casals şi colab. (2006).
www.themegallery.com
CONCLUZII
Atât frunzele, cât şi fructele sunt potrivite pentru testarea
rezistenţei/sensibilităţii soiurilor de prun la virusul Plum pox.
Tehnicile moleculare RT-PCR şi PCR-RFLP s-au dovedit a fi foarte eficiente
în diagnosticarea şi diferenţierea tulpinilor virale, indicând o foarte bună
corelaţie. Toate izolatele diagnosticate ca fiind PPV-M în regiunea (Cter)CP s-
au dovedit a fi PPV-Rec în regiunea (Cter) Nib – (Nter)CP.
Diferenţierea tulpinilor D şi REC ne-a indicat faptul că cea mai mare influenţă
a avut-o tulpina REC şi infecţiile mixte (D+REC), mai ales la varietăţile sensibile.
LOGO