Metode de analiză a amidonului,

enzimelor și hidrolizatelor de amidon

Cercetător post-doctorand

Dr. Ing. Monica MIRONESCU

Tutore

Prof. Dr. Biol. Letiția OPREAN

Obţinerea produşilor de bioconversie enzimatică a amidonului

Amidon

Bioconversia enzimatică

Hidrolizate de amidon (siropuri de glucoză, maltoză)

Lichefiere Enzime de lichefiere

Gelatinizare

Zaharificare

Amidon lichefiat / MaltodextrineEnzime de zaharificare

Enzime de inversie

Surse de amidon:Cartof, porumb, grâu ...Reziduuri alimentare

Siropuri de fructoză

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode de analiză a amidonului

• Determinarea caracteristicilor fizico-chimice;

– Umiditatea, pH-ul, conținutul amidon, proteine, lipide, cenușa,

caracterul reducător;

– Determinarea capacităţii de îmbibare (de reținere a apei) a

amidonului;

– Determinarea solubilităţii amidonului la diverse temperaturi;

• Comportamentul reologic a amidonului și determinarea capacităţii

amidonului de formare a gelului;

• Analiza cromatografică a amidonului;

• Analiza microscopică a granulei de amidon

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0

1

2

3

4

5

6

7

8

pH la 20°C

porumb

cartof

0

2

4

6

8

10

12

Umiditate, %

%

porumb

cartof

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

Cenuşă, %

%

porumb

cartof

87

87,5

88

88,5

89

89,5

90

90,5

91

Amidon, %

%

porumb

cartof

Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Caracter reducător, %

%

porumb

cartof

Capacitatea de îmbibare a amidonurilor

Capacitatea de îmbibare, %Amidon

50oC 60oC 80oC 90oC

Porumb 2,2 ± 0,2 2,9 ± 0,16 11,9 ± 0,12 15,3 ± 0,18

Cartof 3,0 ± 0,15 18,0 ± 0,15 36,5 ± 0,14 100 -0,08

Comportamentul reologic• Curba de viscozitate

104

103

102

101

100

10-1

10-2

10-3

η, Pa.

s

T, °C

100

90

80

70

60

50

40

30

200 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100Time, s

I

II

IV

VIII

10-3

10-2

10-1

100

101

102

103

Pa·s

η

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

°C

T

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1.000sZeit t

Cerestar C*Gel

Anton Paar GmbH

Cerestar 25% 75°C 30s-1 1

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

Cerestar 25% 75°C 30s-1 2

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

Cerestar 25% 75°C 30s-1 3

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

Curbe de viscozitate pt. amidon porumb

10-3

10-2

10-1

100

101

102

103

104

Pa·s

η

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

°C

T

0 200 400 600 800 1.000sZeit t

Cerestar C*Gel

Anton Paar GmbH

Cerestar 25% 75°C 30s-1 2

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2

ST 24

η Viskosität

T Temperatur

Curbe de viscozitate pt. amidon porumb

Măsurători dinamice de viscozitate

10-8

10-7

10-6

10-5

10-4

10-3

10-2

10-1

100

101

102

Pa

G'

G''

10-2

0,1

1

10

102

103

Pa·s

|η*|

10-2

10-1

100

101

102

1/sKreisfrequenz ω

Rheoplus

Anton Paar GmbH

C*Tex 40% freq sweep winkel 0,5 2

CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

|η*| Betrag(Viskosität)

Remy B7 40% freq sweep winkel 0,5 1

CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

|η*| Betrag(Viskosität)

C*Gel 50% freq sweep winkel 0,5 7

CP 50-2

G' Speichermodul

G'' Verlustmodul

|η*| Betrag(Viskosität)

SEC

Analiza cromatografică a amidonului prin SEC

Detaliu separare

Separare după volumul hidrodinamic

Vh = f( Masa moleculară, conformaţie)Vh = [η]*M

- Coloana umplută cu un material (faza statică)- Eluentul (faza mobilă)- Proba (Componente cu M diferite)

SEC a amidonului de porumb

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Elution time, min.

RI o

utpu

t sig

nal (

volt)

Ib

1b

100

80

60

40

20

0

-20 IIb

IIIbIVb

Caracteristicile metodei: eluent DMSO; vol. injecţie 50 µl; temperatura 60oC; rata de curgere eluent 0,4 ml/min (Mironescu, 2007)

Analiza microscopică a amidonului

Granule de amidon de cartofi Granule de amidon de porumb

Analiza microscopică a amidonului30oC 60oC 70oC

90oC

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode de analiză a enzimelor amilolitice

• Metode de det. a activităţii enzimatice

– Principiul general de determinare: dozarea

substratului rămas sau a produşilor formaţi

Activitatea enzimatică

• UI =numărul de micromoli de substrat transformat sau de

produs rezultat pe minut în condiţii bine definite.

– când substratul este amidon (cu MM nedefinită), se produce

un amestec de oligozaharide

UI : numărul de micromoli de legături

hidrolizate pe minut.

Det. numărului grupărilor reducătoare

• A- metode colorimetrice;

• B- metode cromatografice;

• C- metode enzimatice;

• D- metode fizice;

• E- metode de dozare volumetrică.

Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice

• Metode ce folosesc 3 reactivi:– cupru alcalin

– fericianură alcalină

– 3,5 dinitrosalicilat alcalin (Metoda Miller)

• Tb. specificat sustratul folisit pt. det. activităţii enzimei:

– amidon nativ, amidon solubil, amiloză, dextrine limită

– compuşi speciali: pentazaharidul substituit la ambele capete cu

indol şi naftalen (INdp5)

Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice

• Determinarea activităţii enzimatice la α-amilaze

cu micrometoda cu cupru 2,2” bicinchoninate(Yook and Robyt, 2002)

– Substrat: amidon

– Citirea absorbţiei la 570 nm

– Etalon: maltoza

– UI: µl de legături glucozidice rupte pe minut

Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice• Determinarea activităţii α-amilazei exprimată în

Kilo Novo unit (KNU) (Legin,1998)

– Substrat: p-nitrofenil α-D–glucopiranozid (pNPG)

– măsurarea la 405 nm a p-nitrofenolului (pNP) eliberat de către

enzimă.

– O unitate de activitate α-glucozidazică = cantitatea de

enzimă care eliberează un µmol de pNP pe minut.

Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode fizice• Determinarea numărului de legături hidrolizate prin

măsurări de osmolaritate (Marchal,1999)

– Echivalentul de Dextroză (DE) :

DE= MMglucoză x 100 / MMmedie_ hidrolizat de amidon

– DE teoretic: DE= 0,18 x100/(dwkgapă / osm)

– Măsurarea osmometrică:

( )( )( )( )00

30

0

11018118

dwosmosmdwdwosmosmDE

m

om

−−⋅+−−

= −

Metode de analiză

1. Metode de analiză a amidonul

2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice

3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon

Metode fizice de analiză a amidonurilor

Siropuri de hidrolizate de amidon cu valori DE diferite

Unghiul de rotaţie specifică

15,1 162,8

18,8 168,3

25,2 159,8

32,8 152,6

36,7 146,8

41,8 139,9

48,8 130,0

55,2 105,8

67,2 97,0

Met. chimice de analiză a amidonurilor• Determinarea echivalentului dextroză DE

folosind metoda Luff -Schoorl

2Cu2+O + R – CHO Cu+2O + R - COOH

2Cu2+SO4 + 4KI- 2 Cu+I + I02 + 2K2SO4

l02 + 2 Na2S-42O3 2 Na2S-6

4O6 + 2 NaI-

0 5 10 15 20 25 30 350,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

SaccharoseD-GlucoseD-MaltoseDextran 5000Dextran 50.000Dextran 150.000Dextran BlauPullulanXanthan

DO

C-D

etek

tors

igna

le

Elutionsvolumen in mLTimpul de eluţie, min.

D-GlucozaD-MaltozaZaharozaDextran 5x103 DaDextran 5x104 DaDextran 1,5x105 DaDextran 106 DaPullulan 106 DaXanthan 1,2x106 Da

Inte

nsita

tea

sem

nalu

lui

DO

C

0 5 10 15 20 25 30 350,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

0 5 10 15 20 25 30 350,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

SaccharoseD-GlucoseD-MaltoseDextran 5000Dextran 50.000Dextran 150.000Dextran BlauPullulanXanthan

DO

C-D

etek

tors

igna

le

Elutionsvolumen in mLTimpul de eluţie, min.

D-GlucozaD-MaltozaZaharozaDextran 5x103 DaDextran 5x104 DaDextran 1,5x105 DaDextran 106 DaPullulan 106 DaXanthan 1,2x106 Da

Inte

nsita

tea

sem

nalu

lui

DO

C

Metode cromatografice de analiză a amidonurilor: SEC

Cromatograma obţinută la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi

monozaharide cu mase moleculare diferite. (Mironescu şi colab., 2004)

Condițiile de lucru:

‒eluent apa+tampon fosfat;

‒rata curgere 0,1 ml/min;

‒coloană TSK 50S

‒Vol. injecție 100 µl

SEC

y = -575376x + 8E+06R2 = 0,8684

5,0E+04

2,5E+05

4,5E+05

6,5E+05

8,5E+05

1,1E+06

11 11,5 12 12,5 13 13,5 14

Timpul de retenţie, min.

Mas

a m

olec

ulară.

Da

y = -1430,7x + 29132R2 = 0,9899

0,0E+00

1,0E+03

2,0E+03

3,0E+03

4,0E+03

5,0E+03

16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21

Timpul de retenţie, min.M

asa

mol

ecul

ară,

Da

BA

Curbele etalon obţinute la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi monozaharide cu mase moleculare diferite. A) Compuşi cu masă moleculară mare. B) Compuşi cu masă moleculară mică (Mironescu şi colab., 2004)

Det. DE și DP prin HPLC

• DE = DP1 + 0,63.DP2 +

0,4.DP3 + 0,18.DP4+

Caracteristicile metodei: eluent apă; vol. injecţie 100 µl; temperatura 96oC; rata de curgere eluent 0,5 ml/min (Mironescu et al., 2007)

DP1

DP2

DP3

DP4+