Metode de analiză a amidonului, enzimelor și hidrolizatelor...
Transcript of Metode de analiză a amidonului, enzimelor și hidrolizatelor...
Metode de analiză a amidonului,
enzimelor și hidrolizatelor de amidon
Cercetător post-doctorand
Dr. Ing. Monica MIRONESCU
Tutore
Prof. Dr. Biol. Letiția OPREAN
Obţinerea produşilor de bioconversie enzimatică a amidonului
Amidon
Bioconversia enzimatică
Hidrolizate de amidon (siropuri de glucoză, maltoză)
Lichefiere Enzime de lichefiere
Gelatinizare
Zaharificare
Amidon lichefiat / MaltodextrineEnzime de zaharificare
Enzime de inversie
Surse de amidon:Cartof, porumb, grâu ...Reziduuri alimentare
Siropuri de fructoză
Metode de analiză
1. Metode de analiză a amidonul
2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice
3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon
Metode de analiză a amidonului
• Determinarea caracteristicilor fizico-chimice;
– Umiditatea, pH-ul, conținutul amidon, proteine, lipide, cenușa,
caracterul reducător;
– Determinarea capacităţii de îmbibare (de reținere a apei) a
amidonului;
– Determinarea solubilităţii amidonului la diverse temperaturi;
• Comportamentul reologic a amidonului și determinarea capacităţii
amidonului de formare a gelului;
• Analiza cromatografică a amidonului;
• Analiza microscopică a granulei de amidon
Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH la 20°C
porumb
cartof
0
2
4
6
8
10
12
Umiditate, %
%
porumb
cartof
Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Cenuşă, %
%
porumb
cartof
87
87,5
88
88,5
89
89,5
90
90,5
91
Amidon, %
%
porumb
cartof
Caracteristicile fizico-chimice ale amidonurilor
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
Caracter reducător, %
%
porumb
cartof
Capacitatea de îmbibare a amidonurilor
Capacitatea de îmbibare, %Amidon
50oC 60oC 80oC 90oC
Porumb 2,2 ± 0,2 2,9 ± 0,16 11,9 ± 0,12 15,3 ± 0,18
Cartof 3,0 ± 0,15 18,0 ± 0,15 36,5 ± 0,14 100 -0,08
Comportamentul reologic• Curba de viscozitate
104
103
102
101
100
10-1
10-2
10-3
η, Pa.
s
T, °C
100
90
80
70
60
50
40
30
200 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100Time, s
I
II
IV
VIII
10-3
10-2
10-1
100
101
102
103
Pa·s
η
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
°C
T
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1.000sZeit t
Cerestar C*Gel
Anton Paar GmbH
Cerestar 25% 75°C 30s-1 1
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
Cerestar 25% 75°C 30s-1 2
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
Cerestar 25% 75°C 30s-1 3
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
Curbe de viscozitate pt. amidon porumb
10-3
10-2
10-1
100
101
102
103
104
Pa·s
η
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
80
°C
T
0 200 400 600 800 1.000sZeit t
Cerestar C*Gel
Anton Paar GmbH
Cerestar 25% 75°C 30s-1 2
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
C*Gel 25% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 1
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
C*Gel 50% 75°Cmit Pregelatinisation 30s-1 2
ST 24
η Viskosität
T Temperatur
Curbe de viscozitate pt. amidon porumb
Măsurători dinamice de viscozitate
10-8
10-7
10-6
10-5
10-4
10-3
10-2
10-1
100
101
102
Pa
G'
G''
10-2
0,1
1
10
102
103
Pa·s
|η*|
10-2
10-1
100
101
102
1/sKreisfrequenz ω
Rheoplus
Anton Paar GmbH
C*Tex 40% freq sweep winkel 0,5 2
CP 50-2
G' Speichermodul
G'' Verlustmodul
|η*| Betrag(Viskosität)
Remy B7 40% freq sweep winkel 0,5 1
CP 50-2
G' Speichermodul
G'' Verlustmodul
|η*| Betrag(Viskosität)
C*Gel 50% freq sweep winkel 0,5 7
CP 50-2
G' Speichermodul
G'' Verlustmodul
|η*| Betrag(Viskosität)
SEC
Analiza cromatografică a amidonului prin SEC
Detaliu separare
Separare după volumul hidrodinamic
Vh = f( Masa moleculară, conformaţie)Vh = [η]*M
- Coloana umplută cu un material (faza statică)- Eluentul (faza mobilă)- Proba (Componente cu M diferite)
SEC a amidonului de porumb
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Elution time, min.
RI o
utpu
t sig
nal (
volt)
Ib
1b
100
80
60
40
20
0
-20 IIb
IIIbIVb
Caracteristicile metodei: eluent DMSO; vol. injecţie 50 µl; temperatura 60oC; rata de curgere eluent 0,4 ml/min (Mironescu, 2007)
Analiza microscopică a amidonului
Granule de amidon de cartofi Granule de amidon de porumb
Analiza microscopică a amidonului30oC 60oC 70oC
90oC
Metode de analiză
1. Metode de analiză a amidonul
2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice
3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon
Metode de analiză a enzimelor amilolitice
• Metode de det. a activităţii enzimatice
– Principiul general de determinare: dozarea
substratului rămas sau a produşilor formaţi
Activitatea enzimatică
• UI =numărul de micromoli de substrat transformat sau de
produs rezultat pe minut în condiţii bine definite.
– când substratul este amidon (cu MM nedefinită), se produce
un amestec de oligozaharide
UI : numărul de micromoli de legături
hidrolizate pe minut.
Det. numărului grupărilor reducătoare
• A- metode colorimetrice;
• B- metode cromatografice;
• C- metode enzimatice;
• D- metode fizice;
• E- metode de dozare volumetrică.
Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice
• Metode ce folosesc 3 reactivi:– cupru alcalin
– fericianură alcalină
– 3,5 dinitrosalicilat alcalin (Metoda Miller)
• Tb. specificat sustratul folisit pt. det. activităţii enzimei:
– amidon nativ, amidon solubil, amiloză, dextrine limită
– compuşi speciali: pentazaharidul substituit la ambele capete cu
indol şi naftalen (INdp5)
Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice
• Determinarea activităţii enzimatice la α-amilaze
cu micrometoda cu cupru 2,2” bicinchoninate(Yook and Robyt, 2002)
– Substrat: amidon
– Citirea absorbţiei la 570 nm
– Etalon: maltoza
– UI: µl de legături glucozidice rupte pe minut
Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode colorimetrice• Determinarea activităţii α-amilazei exprimată în
Kilo Novo unit (KNU) (Legin,1998)
– Substrat: p-nitrofenil α-D–glucopiranozid (pNPG)
– măsurarea la 405 nm a p-nitrofenolului (pNP) eliberat de către
enzimă.
– O unitate de activitate α-glucozidazică = cantitatea de
enzimă care eliberează un µmol de pNP pe minut.
Det. numărului grupărilor reducătoare prin metode fizice• Determinarea numărului de legături hidrolizate prin
măsurări de osmolaritate (Marchal,1999)
– Echivalentul de Dextroză (DE) :
DE= MMglucoză x 100 / MMmedie_ hidrolizat de amidon
– DE teoretic: DE= 0,18 x100/(dwkgapă / osm)
– Măsurarea osmometrică:
( )( )( )( )00
30
0
11018118
dwosmosmdwdwosmosmDE
m
om
−−⋅+−−
= −
Metode de analiză
1. Metode de analiză a amidonul
2. Metode de analiză a enzimelor amilolitice
3. Metode de analiză a hidrolizatelor de amidon
Metode fizice de analiză a amidonurilor
Siropuri de hidrolizate de amidon cu valori DE diferite
Unghiul de rotaţie specifică
15,1 162,8
18,8 168,3
25,2 159,8
32,8 152,6
36,7 146,8
41,8 139,9
48,8 130,0
55,2 105,8
67,2 97,0
Met. chimice de analiză a amidonurilor• Determinarea echivalentului dextroză DE
folosind metoda Luff -Schoorl
2Cu2+O + R – CHO Cu+2O + R - COOH
2Cu2+SO4 + 4KI- 2 Cu+I + I02 + 2K2SO4
l02 + 2 Na2S-42O3 2 Na2S-6
4O6 + 2 NaI-
0 5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
SaccharoseD-GlucoseD-MaltoseDextran 5000Dextran 50.000Dextran 150.000Dextran BlauPullulanXanthan
DO
C-D
etek
tors
igna
le
Elutionsvolumen in mLTimpul de eluţie, min.
D-GlucozaD-MaltozaZaharozaDextran 5x103 DaDextran 5x104 DaDextran 1,5x105 DaDextran 106 DaPullulan 106 DaXanthan 1,2x106 Da
Inte
nsita
tea
sem
nalu
lui
DO
C
0 5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
0 5 10 15 20 25 30 350,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
SaccharoseD-GlucoseD-MaltoseDextran 5000Dextran 50.000Dextran 150.000Dextran BlauPullulanXanthan
DO
C-D
etek
tors
igna
le
Elutionsvolumen in mLTimpul de eluţie, min.
D-GlucozaD-MaltozaZaharozaDextran 5x103 DaDextran 5x104 DaDextran 1,5x105 DaDextran 106 DaPullulan 106 DaXanthan 1,2x106 Da
Inte
nsita
tea
sem
nalu
lui
DO
C
Metode cromatografice de analiză a amidonurilor: SEC
Cromatograma obţinută la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi
monozaharide cu mase moleculare diferite. (Mironescu şi colab., 2004)
Condițiile de lucru:
‒eluent apa+tampon fosfat;
‒rata curgere 0,1 ml/min;
‒coloană TSK 50S
‒Vol. injecție 100 µl
SEC
y = -575376x + 8E+06R2 = 0,8684
5,0E+04
2,5E+05
4,5E+05
6,5E+05
8,5E+05
1,1E+06
11 11,5 12 12,5 13 13,5 14
Timpul de retenţie, min.
Mas
a m
olec
ulară.
Da
y = -1430,7x + 29132R2 = 0,9899
0,0E+00
1,0E+03
2,0E+03
3,0E+03
4,0E+03
5,0E+03
16,5 17 17,5 18 18,5 19 19,5 20 20,5 21
Timpul de retenţie, min.M
asa
mol
ecul
ară,
Da
BA
Curbele etalon obţinute la SEC a unei probe standard conţinând poli-, oligo- şi monozaharide cu mase moleculare diferite. A) Compuşi cu masă moleculară mare. B) Compuşi cu masă moleculară mică (Mironescu şi colab., 2004)
Det. DE și DP prin HPLC
• DE = DP1 + 0,63.DP2 +
0,4.DP3 + 0,18.DP4+
Caracteristicile metodei: eluent apă; vol. injecţie 100 µl; temperatura 96oC; rata de curgere eluent 0,5 ml/min (Mironescu et al., 2007)
DP1
DP2
DP3
DP4+