Genetica bacteriana I & II

1. Ereditatea – transmiterea caracterelor specifice speciei la urmasi

2. Variabilitatea – schimbarea unor caractere care sunt mostenite de catre urmasi si aparitia unor caractere diferite de ale genitorilor (diversitate mare intr-un numar mic de generatii)

Organizarea materialului genetic la bacterii

Cromozomul (=genomul) bacterian

• Macromolecula unica de ADN cu greutatea moleculara de 109 daltoni si lungime de 1100-1300 µm, suprahelicata in celula

• Structura moleculei de ADN – 2 catene spiralate complementare si de polaritate inversa (modelul Watson si Crick)

• Contine toata informatia necesara cresterii si replicarii celulei bacteriene

ADN

• 1869 – Frederick Miescher• 1920 – Phoebus A.T. Levine – contine acid

ortofosforic, zaharuri cu 5 atomi de C si baze care contin N

• Ulterior – Rosalind Franklin – structura helicoidala prin cristalografia cu raze X

• 1950 – James Watson si Francis Crick – structura 3D a moleculei de ADN

Structura ADN I

• Lant dublu helicat de nucleotide – “scara in spirala” (cu balustrada) sau “fermoar”

• Unitatea structurala de baza este nucleotida:- 1 molecula acid ortofosforic- 1 zahar cu 5 atomi de C (pentoza) – dezoxiriboza- 1 baza care contine N – poate fi o purina sau o pirimidina

Structura ADN II• Scheletul spiralei (“balustrada” si “lateralele

scarii”) – acid ortofosforic si dezoxiriboza• Bazele azotate reprezinta “caramizile” care

construiesc ADN - purina: 2 inele lipite alcatuite din 9 atomi de C si hidrogen: A si G- pirimidina: 1 inel alcatuit din 6 atomi de C si hidrogen: T si C

• Bazele se leaga complementar (A-T si C-G) prin legaturi de hidrogen

Structura ADN III• cele doua lanturi complementare “merg” in

directie opusa (polaritate inversa)• Informatia continuta in ADN – secventa de

“litere” de-a lungul “scarii”/”fermoarului”• Secventa ACGCT inseamna altceva decat

secventa AGTCC chiar daca contin exact aceleasi litere (vezi “stops” si “spots” sau “posts”) - oamenii – 99,9% sunt identici. In genomul urman: din 3 miliarde de litere - 0,1% se “traduc” prin 3 milioane de aranjari diferite ale bazelor azotate (“literelor”) – aspect important in criminalistica dar si in diagnosticul bacteriologic (genomul bacterian)

Genetica bacteriana si diagnosticul microbiologic I

• Proportia de baze complementare este constanta in cadrul unei specii, raportul A-T/ C-G – criteriu taxonomic de baza in clasificarea moderna a bacteriilor

• Noi teste diagnostice – identificarea unei secvente unice de ADN sau ARN prezenta in fiecare specie bacteriana

• PCR – amplificare a secventelor ADN – detectia bacteriilor in numar foarte mic in prelevatele clinice ( BK in LCR)

• Testele genetice “sar” peste nevoia de a cultiva bacteriile – metoda rapida de diagnostic microbiologic

• Genetica bacteriana – necesara intelegerii aparitiei si transferului rezistentei la antibiotice la microorganisme (mutatii…)

Genetica bacteriana si diagnosticul microbiologic II

Replicarea ADN I

• Structura dublu spiralata permite replicarea lui identica, semiconservativa

• Spirala se “deschide” ca un fermoar la locul initial al replicarii sub actiunea unei ADN-giraze

• Pe fiecare spirala se va sintetiza una noua, complementara, cu participarea ADN-polimerazei (I, II, III) din directia capatului 5’ terminal spre capatul 3’ terminal

• Replicarea cromozomului poate fi uni- sau bidirectionala in functie de conditiile de mediu

• In celula bacteriana pot coexista diferite structuri genetice (cromozom, plasmide, bacteriofag), replicarea lor putand sa aiba loc in acelasi timp.

Replicarea ADN II

Terminologie I• Genotipul unei celule = potentialul genetic al

ADN-ului acelui microorganism- toate caracteristicile care sunt condificate in ADN si care au potentialul de a fi exprimate- unele gene sunt “tacute”, fiind exprimate doar in anumite conditii = INDUCTIBILE- genele care sunt exprimate intotdeauna = CONSTITUTIVE

• Fenotipul unei celule = caracteristicile genetice ale unei celule care sunt exprimate si pot fi observate

• Scopul final al unei celule:- producerea proteinelor (str. si functia celulara)- transmiterea info. pt aceasta si generatiilor urmatoare de celule

• Proteinele = polipeptide alcatuite din amino-acizi (aa)

• Informatia pentru sinteza proteica: in ADN-ul bacterian

Terminologie II

• Sinteza proteica - 2 etape principale: - transcriptia/transcrierea informatiei genetice din ADN intr-un ARNm cu ajutorul ARNpolimerazei si folosind ADN ca matrice/model (ARN – lant unic si scurt si contine ca zahar riboza si U in loc de T)- translatia/traducerea – mesajul ARNm este decodificat la nivelul ribozomilor secventa aa intr-un lant polipeptidic (aa sunt adusi in ribozomi prin transferul moleculelor ARNt care “traduc” codonii; moleculele ARNt se ataseaza temporar de ARNm utilizand regiunile lor complementare, anticodon)

Terminologie III

• Codon = un grup de 3 nucleotide in molecula ARNm care codifica un aa specific

• Anticodon = triplet de baze pe ARNt care se leaga de tripletul de baze de pe ARNm (identifica care aa va fi intr-o locatie specifica in proteina)

• Fluxul informatiei genetice este intotdeauna unidirectional – de la acizii nucleici la proteine

• Numarul si secventa de aa in lantul polipeptidic (si deci structura particulara a acelei proteine) este determinata de secventa de codoni din molecula ARNm

Terminologie IV

• Codul genetic = corespondenta dintre secventa codonilor si cea a aa in cadrul unui polipeptid

• Gena (cistron) – secventa de ADN specifica care codifica un aa dintr-un polipeptid care functioneaza direct sau impreuna cu alte polipeptide ca enzima sau proteina structurala.

Terminologie V

Reglarea activitatii genelor I

• Scop: ajustarea metabolismului la conditiile de mediu – cresterea si multiplicarea in conditii optime

• Mecanismele reglarii negative (prezente doar la procariote):

- Gene structurale – codifica enzime pt o anumita linie metabolica – formeaza o unitate numita operon care este delimitat de secvente de control

(operatorul – receptioneaza semnalele, promotorul – initiaza transcrierea genei structurale si terminatorul – incheie transcriptia)

- Gena reglatoare - conduce activitatea unui operon si codifica sinteza unui represor (care este capabil sa se fixeze pe operator, blocand activitatea ARNm polimerazei)

Reglarea activitatii genelor II

Organizarea materialului genetic la bacterii

Plasmidele I

• Elemente extracromozomale alcatuite din ADN circular care se replica autonom in celula gazda

• Nu sunt indispensabile vietii celulei • 1952 – Lederberg le-a denumit• 1963 – Watanabe – importanta practica

(transmiterea rezistentei la antibiotice intre bacterii)

• Mici – 10-40 copii in celula• Mari – 1-3 copii• Plasmidele inrudite (mecanism comun de

control al replicarii) sunt incompatibile intr-o celula bacteriana

• Plasmidele neinrudite – sunt compatibile

Plasmidele II

• Pot fi: - conjugative: se pot transfera singure la alte bacterii (plasmidele R)- neconjugative: transfer doar cu ajutorul altei plasmide conjugative sau a unui bacteriofag (BL la S. aureus)- episomi: se pot integra prin recombinare in cromozomul bacterian, pierzandu-si autonomia de replicare (plasmidul F sau factorul de fertilitate)

Plasmidele III

• Pentru medicina – clasificarea1. Plasmide de virulenta – determinanti genetici ai

unor factori de virulenta la bacterii: hemolizina la S. aureus, secretia enterotoxina la E.coli …

2. Plasmide de rezistenta (R): molecule circulare de ADN cu 2 regiuni genetice distincte (“R” si “FTR”): 90% din tulpinile de spital – Escherichia, Klebsiella, Pseudomonas, Acinetobacter…

3. Plasmidul F – contine pe langa alti determinanti genetici, genele de transfer tra

Plasmidele IV

• Se poate transmite altor celule bacteriene prin conjugare

• Se poate integra in cromozomul bacterian – transferul de gene cromozomale de la o celula bacteriana donor la cea receptor

• In functie de prezenta factorului F, bacteriile se impart in:

1.Bacterii F- - celule femele – receptoare

Plasmidul F

2. Bacterii F+ - celule masculine – donoare3. Bacterii Hfr – celule masculine, au factorul F

integrat in cromozom4. Bacterii F’ – celule masculine – au factorul F

ca plasmid autonom dupa ce a fost integrat in cromozom si l-a parasit rupand un fragment ADN din cromozom

Plasmidul F – cont.

Organizarea materialului genetic la bacterii

Bacteriofagii I

• 1915 – Twort si d’Herelle = virusuri care ataca bacterii

• “phage” – gr. “phagein” = a manca• Cei mai studiati – fagii T si Lambda la E.coli• Poarta informatia genetica pentru:

- replicarea ADN propriu- sinteza proteinelor de invelis

Dar nu le pot realiza singuri! – au nevoie de “gazda”

• Structura bacteriofagilor:- cap hexagonal (ADN dublu catenar invelit intr-o proteina care alcatuieste capsida)- coada si structuri adiacente – rol in atasarea fagului la celula bacteriana si transmiterea in siguranta a ADN-ului fagic in celula gazda

Bacteriofagii II

Bacteriofagii III

Cap/Capsida

Teaca contractila

coada

Fibrele cozii

Placa bazala

• 2 tipuri de infectii la bacteriiI - infectii litice (fagi virulenti)II - infectii lizogenice (temperate) - fagi temperati

• Inainte de infectare – bacteria e implicata in replicarea propriului ADN

• Dupa infectare – ADN-ul viral preia “conducerea” celulei gazda – producerea de acizi nucleici si proteine necesare producerii de noi particule virale

Bacteriofagii IV

• Infectia litica (ciclul litic) - atasare, adsorbtie, penetrare, sinteza de proteine timpurii si replicarea ADN viral, sinteza tardiva de proteine si asamblarea particulelor virale – liza celulei cu eliberarea particulelor virale

• Infectia lizogena (ciclul lizogen) - asasare, adsorbtie, penetrare, integrare ADN viral in cromozomul bacterian (profag – o singura gena a fagului este activa, bacterie = lizogenizata), replicare odata cu bacteria, NU distruge bacteria

Bacteriofagii V

Bacteriofagii VIInfectia litica (ciclul litic)

Bacteriofagii VII

• Dificila recunoasterea bacteriei lizogenizate de cea nelizogenizata (apar identice)

• Uneori profagul – noi caractere (nou fenotip) bacteriei lizogenizate = conversie lizogenica

• EX.: - C. diphteriae – fagul beta – toxina - S. pyogenes – lizogenizat- toxina eritrogena - C. botulinum – lizogenizat – unele toxine• Fenomen similar conversiei lizogenice – virusuri

tumorale – unele cancere umane

Bacteriofagii VIII

• Terapia fagica - Utilizarea in terapeutica a bacteriofagilor litici

pentru a trata infectii bacteriene- Alternativa la antibiotice – Estul Europei si SUA- Beneficii: - mult mai specifica

- nu e daunatoare celulelor eucariote supuse tratarii si nu ar trebui sa

afecteze flora normala a gazdei - efecte secundare minime sau absente

- Georgia – tratamentul infectiilor bacteriene care nu raspund la antibioticele conventionale

Bacteriofagii IX

Organizarea materialului genetic la bacterii

1. Fragmentele de insertie (IS) 2. Transpozonii (Tn) • Fragmente mici ADN cu limite structurale bine

precizate• Se pot integra repetat in mai multe situsuri

dintr-un genom• 1952 – Barbara McClintock – “jumping genes”• 1983 – a primit premiul Nobel

Elementele genetice transpozabile I

Elementele genetice transpozabile II

• Fragmentele de insertie (IS) - 1000 baze, fac parte in mod normal din

cromozom sau plasmide- Prezente in mai multe copii si flancate de

secventa de ADN (pentru codificarea transpozitiei)

- NU confera un caracter nou celulei, DAR dupa insertie pot produce modificari in expresia genelor adiacente inserarii

• Transpozonii (Tn)- Alcatuiti din 2 IS care nu au nevoie de

secventa de ADN pentru codificarea transpozitiei

- Codifica determinanti de rezistenta sau unele caractere care pot apare in fenotipul bacteriei

Elementele genetice transpozabile III

1. Ereditatea – transmiterea caracterelor specifice speciei la urmasi – aparitia de “clone”

2. Variabilitatea – schimbarea unor caractere care sunt mostenite de catre urmasi si aparitia unor caractere diferite de ale genitorilor (diversitate mare intr-un numar mic de generatii)

Variabilitatea

• Mecanisme: 1. Mutatia2. Transferul de material genetic

a. Transformareab. Transductiac. Conjugarea

3. Recombinarea

Mutatia I• Def. = schimbarea unui caracter in mod brusc, cu

frecventa redusa, intamplator, transferabil la descendenti

• Mecanismul mutatiei – schimbarea unei secvente de nucleotide prin:

- substitutie – inlocuirea unei baze azotate cu alta - insertie – adaugarea uneia sau ˃ per. baze - deletie – pierderea uneia sau ˃ per. Baze - inversia – modificarea orientarii unui segment ADN

in raport cu secventele vecine

• Clasificare: 1.Dupa modalitatea de aparitie:

- spontane (naturale) - induse (agenti mutageni: UV, Q, subst. chimice

2.Dupa marime: – punctiforme (afecteaza un singur nucleotid si sunt reversibile)- extinse

Mutatia II

3. Dupa caracterul fenotipic afectat: - morfologice

- biochimice - antigenice- de virulenta- de rezistenta – “one step” – devine R imediat

- “multistep” – R la concentratii crescande de antibiotic

Mutatia III

Variabilitatea

• Mecanisme: 1. Mutatia2. Transferul de material genetic

a. Transformareab. Transductiac. Conjugarea

3. Recombinarea

Transferul de material genetic

• Caracteristici generale: 1.Este unidirectional: de la donor la receptor2.Donorul nu transfera intregul cromozom

(transfer incomplet)3.Fragmentul transferat se poate integra in

ADN-ul receptorului sau sa se stabilizeze in celula in stare autonoma

4.Doar intre tulpini ale aceleiasi specii sau intre specii strans inrudite

1. Transformarea I • Transferul donor-receptor sub forma de ADN: -liza celulei donor - extractie chimica • 1928 – experimentul lui Griffith – pneumococ• Factori care influenteaza transformarea: - dimensiunea ADN - starea de competenta a receptorului – permite

inglobarea ADN strain (Haemophilus, Bacillus, Neisseria, Salmonella, Streptococcus..) – Ag special pe suprafata = factor de competenta

– Recombinare

• Semnificatie– Variatii de faza Neiseseria– Tehnologie ADN recombinant (inducere artificiala a starii de competenta)

etapeetape Preluare ADNPreluare ADN

Gram +Gram + Gram -Gram -

1. Transformarea II

2. Transductia I • Transfer genetic de la o bacterie la alta prin

intermediul unui bacteriofag• Aparitia de caractere noi: R la antibiotice, secretie

toxine, enzime, etc • Transductia generalizata:- Bacteriofagii transfera ORICE gena bacteriana - Mediata de fagii litici (virulenti) • Transductia specializata: - Bacteriofagii transfera anumite gene (genele

adiacente locului de insertie a fagului)- Mediata de fagii temperati

2. Transductia II

•Transductia generalizata

3. Conjugarea I

• Transferul de material genetic de la donor la receptor prin contactul direct dintre cele doua celule

• Se pot transmite plasmide si gene cromozomale (prin intermediul factorului F+ )

• Diferit la bacteriile Gram-negative si Gram-pozitive

• Bacterii Gram-negative – prin intermediul plasmidului F, prin contact direct intre cele doua celule

a. Poate fi situat intr-un plasmid – bacterii F+

- Gene de transfer tra – sinteza pilului de sex si transferul plasmidului

b. Poate fi integrat in cromozom – bacterii Hfr - Transferul de gene cromozomale de la o bacterie

la alta- Recombinare gene cromozomale donator-

receptor

3. Conjugarea II

• Transferul genetic prin contactul direct

Donor

Recipient

3. Conjugarea III

Caracteristicile bacteriilor Hfr:

- Bacteria F- rareori devine Hfr, pe cand bacteria Hfr ramane intotdeauna Hfr

- Materialul genetic cromozomal se transfera cu frecventa marita – recombinare gene donor-receptor

F+ Hfr

3. Conjugarea IV

• Mecanism Hfr si F-

Hfr F- Hfr F-

Hfr F-Hfr F-

3. Conjugarea V

Mecanismul F+ si F-

F+ F- F+ F-

F+ F+F+ F+

3. Conjugarea VI

• Bacteriile Gram-pozitive: prin performanta celulei receptoare: produce substante cu afinitate pentru unele substante adezive de pe suprafata receptorului (sexferomon) – punti intercelulare

• Ex.: Streptococcus, Streptomyces ,Clostridium..

3. Conjugarea VII

Variabilitatea

• Mecanisme: 1. Mutatia2. Transferul de material genetic

a. Transformareab. Transductiac. Conjugarea

3. Recombinarea

Recombinarea I

• Formarea unui nou genotip prin reasortarea genelor dupa schimbarea de material genetic

• Rezulta din transferul genetic (integrare suplimentara de ADN) si transpozitie (schimb de elemente omologe)

• Transpozitia – segmente de ADN (IS si Tn) se deplaseaza de la un situs la altul in genomul bacteriilor sau al bacteriofagilor

• Recombinare legitima (omologa) – ADN donor inserat la receptor are omologie de baze cu acesta

- Ex.: transformare, unele forme de transductie si conjugare

• Recombinare nelegitima (heterologa) – integrarea de ADN suplimentar intr-un replicon

- Ex.: integrarea plasmidului F, a unor profagi sau transpozitia elementelor genetice mobile

Recombinarea II

• Clonarea genelor – forma deosebita de recombinare nelegitima (in vitro)

• Plasmidele sunt folosite frecvent ca vectori pentru transferul si clonarea de material genetic de la o bacterie la alta sau intre organisme foarte indepartate filogenetic

• Se introduc in genomul bacterian gene care codifica sinteza de IFN, insulina, etc – obtinerea artificiala ar fi imposibila sau foarte costisitoare

Recombinarea III

Bibliografie

• Textbook of Diagnostic Microbiology, Connie R. Mahon et al., third edition Elsevier, 2007, p. 21-26

• Curs genetica bacteriana – Conf. Dr. Alexandru Rafila

• Bacteriologie medicala, O.M. Dorobat, Ed. Printech 1999, p. 37-49

• http://textbookofbacteriology.net/phage.html